阅读说明：本技术 一种在制备饲料级胰酶中的灭活病毒的方法 (Method for inactivating virus in preparation of feed-grade pancreatin ) 是由 蔡青和 陈远庆 朱琳娜 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种从胰渣中提取饲料级胰酶过程中的灭活病毒的方法,它将原料胰渣经过粉碎、溶解、板框压滤后,上清液加入有机溶剂和活性剂进行病毒灭活,再经超滤、制粒、包衣和干燥,分装得制品。通过有机溶剂和活性剂破坏病毒的脂质包膜,同时保持胰酶的结构和功能,使制品纯度和活性提高,不仅病毒灭活操作简单,处理时间短,经济实用,而且该发明具有污染小、设备简单、生产周期短、无需添加激活剂、性质稳定便于保存、安全性好等特点。(The invention provides a method for inactivating virus in the process of extracting feed-grade pancreatin from pancreatin slag, which comprises the steps of crushing, dissolving and plate-and-frame filter pressing the raw material pancreatin slag, adding an organic solvent and an active agent into supernate to inactivate the virus, and then carrying out ultrafiltration, granulation, coating, drying and subpackaging to obtain a product. The method destroys the lipid envelope of the virus by the organic solvent and the active agent, and simultaneously keeps the structure and the function of the pancreatin, so that the purity and the activity of the product are improved, the virus inactivation operation is simple, the treatment time is short, and the method is economical and practical, and the method has the characteristics of small pollution, simple equipment, short production period, no need of adding the active agent, stable property, convenient storage, good safety and the like.)

一种在制备饲料级胰酶中的灭活病毒的方法

技术领域

本发明涉及胰酶制剂和在生产胰酶制剂过程中灭活病毒的方法，属于生物技术领域，特别涉及有机溶剂和活性剂在制备饲料级胰酶过程中灭活病毒的方法。

背景技术

乳仔乳仔猪、雏鸡、雏鸭、乳牛等幼龄动物消化道发育不全，内源性消化酶系没有建立，再加上早期断奶等饲养应激，幼龄动物非常容易出现营养性腹泻和其他原因的腹泻，实际生产中通常使用抗生素进行饲喂或治疗，从而导致抗生素残留和超量使用。通过添加合适的酶制剂，可以预防幼龄动物营养性腹泻的发生，从而减少抗生素的使用。

胰酶，是一种具有特殊功能的蛋白质。医药行业胰酶主要用于消化不良，食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍，同时也适用于先天性胰功能不全、腹部手术和外伤胰腺切除导致的胰功能不全。或未经手术切除后天引起的胰功能不全及酒精中毒引起的慢性胰腺炎等。同样，胰酶在饲料行业也有广泛的应用价值，它不仅可以给动物提供蛋白质来源，由于其中含有大量具有生物活性的成分，如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶和活性肽。

目前工业胰酶的传统制备工艺多以猪或牛胰脏为原料，经原料处理(刨片、磨浆)、激活、提取、分离(过滤、沉淀、压榨)、脱脂、制粒、干燥、粉碎等多道工序。药物用血管紧张素的提取原料来源于粗酶粉(来源于猪的胰腺)，粗酶粉中含有血管紧张素以外，还同时含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。而提取血管紧张素的工艺主要是采用水洗和特定分子滤膜过滤，对其中的酶破坏较小。粗酶粉提取药物用血管紧张素后剩余的胰渣用作制备胰酶的原料具有一定的经济价值和可行性，充分综合利用了胰渣资源，在环境保护及资源节约方面具有重大意义。

为了保证该制品的安全性，除要控制猪的饲养环境和原料胰渣的质量外，在胰酶的生产过程中，如何有效的除去或灭活原料中的病毒，是获得安全可靠的饲料胰酶产品的关键问题。

随着动物源性组织制备的制品逐渐增多,加之动物源性产品原材料质量控制未引起足够重视,目前动物源性产品病毒感染畜禽的风险性和潜在的医源性感染问题变得日益突出。为确保制品的安全性,在生产工艺中增加有效的病毒灭活/去除措施是非常必要的。目前国内外较为成熟的去除和灭活病毒的方法主要有化学法和物理法。

1、化学法

化学灭活法是利用化学药品或酶使微生物、活性物质的一些结构发生改变，从而丧失生命力、感染性、毒性或活性。化学灭活效果确实、方法简便而最为常用，但化学灭活的效果常受灭活剂种类、剂量和作用温度、pH、时间等因素影响，微生物的种类和含氮量及是否存在有机物等因素有关，因此必须筛选最佳的灭活条件。

1.1有机溶剂/表面活性剂(S/D)法

早在20世纪80年代中期S/D法开始发展应用，目前依然是血液制品中一种核心的病毒灭活方法。此方法的基本原理是：有机溶剂和非离子表面活性剂的混合物能够破坏脂包膜病毒的类脂膜，从而使类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力。Roberts PL(2008)对S/D法用于高纯度的凝血因子进行病毒灭活的有效性进行了详尽的考察。结果显示，以0.3％的TN-BP和1％的Triton－X100为S/D试剂，在22℃条件下处理30min后可以对凝血因子制品中的牛痘病毒、单纯疱疹病毒、辛德毕斯病毒等模拟脂包膜病毒进行有效的灭活，证实了S/D法用于脂包膜病毒灭活的稳健性和有效性。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制剂、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒的灭活。

1.2低pH孵放法

低pH孵放在20世纪80年代初用于注射用人免疫球蛋白的制备过程中防止免疫球蛋白的聚合，随后发现其对大部分的脂包膜病毒有灭活作用，后被用于血液制品的病毒灭活。灭活机理是:在pH4，温度30～37℃条件下保温超过20h，某些病毒成分产生变质，从而影响病毒的复制，最终使病毒失去传染性。Roberts等(2012)对孵放法进行了考察，研究表明，在pH5、30℃条件下对静脉注射用免疫球蛋白持续处理14d能够对脂包膜病毒和部分非包膜病毒进行有效的灭活。证实了该方法可以作为生产过程的终端处理，和S/D法、离子交换层析法结合共同用于注射用免疫球蛋白的病毒灭活，保证免疫球蛋白产品的安全性。该方法要求蛋白质产品的活性在低pH条件下保持稳定，因此一般只用于免疫球蛋白脂包膜病毒的灭活。

1.3辛酸处理法

早在20世纪90年代初，Lundblad等(1991)报道了辛酸钠灭活4种脂包膜蛋白的机制，揭开了辛酸法在病毒灭活中的应用。此法是在低pH条件下，辛酸的非离子形式具有亲脂性，能够进入病毒脂包膜从而破坏脂质双分子层和相关蛋白质的完整性，使脂包膜病毒失去传染性，达到脂包膜病毒的灭活作用。Dichtelmüller等(2002)以3批注射用免疫球蛋白制剂作为研究对象，对辛酸法用于免疫球蛋白溶液病毒灭活的有效性进行了考察。结果显示7.45g/kg的辛酸溶液能够在极短的时间(1min)内对人免疫缺陷病毒、牛病毒性腹泻病毒、辛德毕斯病毒、伪狂犬病病毒进行有效的灭活。由于辛酸法需要在低pH(通常pH＜6)条件下发挥作用，要求蛋白质产品在低pH条件下能够保持其稳定性，因此目前主要用于免疫球蛋白M和免疫球蛋白G的病毒灭活。

1.4光化学法

亚甲蓝(MB)/可见光处理法、补骨脂素/UVA处理法、核黄素/UV处理法等是目前常用的光化学方法(谭美芳等，2012)，主要用于全血浆以及血小板制品的病毒灭活。MB/可见光法病毒灭活的原理(胡小兵等，2003)是:MB是一种带正电荷的感光吩噻嗪染剂，可以穿过病毒的包膜与核酸结合，在一定强度的光照射下发生光化学反应，产生羟基自由基和单态氧，阻止核酸的复制从而达到病毒灭活的目的。此法对脂包膜病毒有良好的灭活效果，对非包膜病毒灭活效果不理想。此外，对于不稳定的蛋白产品可能造成功能活性的损失，目前多有文献报道(程玉根等，2007)此病毒灭活方法对于血浆蛋白的影响变化。

2、物理法

2.1巴氏消毒法

巴氏消毒法是在60℃条件下对蛋白质溶液进行连续加热至少10h，使病毒蛋白变性，从而抑制病毒遗传物质的复制，最终使病毒失去传染性。Chandra等(2002)通过相关文献的检索对巴氏消毒法进行了详细的综述，结果表明巴氏消毒法只需要控制很少的过程参数，灭毒过程容易被监测，对脂包膜病毒和非包膜病毒均有灭活作用，灭毒范围广。作为一种传统成熟的病毒灭活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的灭活。虽然巴氏消毒法目前已成为一种广泛的血液制品病毒灭活方法，但同时存在着一些局限性:①蛋白质稳定剂的加入降低了病毒灭活的能力；②细小病毒B19有耐热性，不利于该病毒的灭活；③在热条件处理下会导致蛋白质产品的变性，使产品的活性降低，因此不能用于稳定性不好的血浆蛋白的病毒灭活。

2.2干热处理法

干热法最早于20世纪80年代初被用于凝血因子制品中肝炎病毒的灭活，1984年，干热法被批准用于HIV的灭活。其原理是:制剂冻干后加热处理，使病毒复制所需要的分子和结构改变，从而抑制其复制过程。干热法常用的处理条件有60℃、96h，80℃、72h以及100℃、30min。Seop等(2008)通过对冻干后的凝血因子进行干热法病毒灭活的研究发现，在100℃、30min的处理条件下，此病毒灭活方法除了对猪细小病毒的灭活不理想外，对其他病毒均有良好的灭活效果，而且经过此方法后凝血因子的失活仅在5％左右，没有发现蛋白制品的物理或生物学性质发生变化，证明了干热法作为最终病毒灭活的关键步骤，能够保证凝血因子产品的病毒安全性。由于对病毒灭活能力的限制，此方法常用于凝血因子制品的辅助病毒灭活方法。

3、其他方法

蛋白产品的制备过程中常包含有沉淀步骤，同时也有病毒去除的作用。在冷乙醇沉淀过程中，各种病毒可能被分离至废弃组分中，蛋白纯化的同时进行部分病毒的移除。深度过滤是一种重要的蛋白纯化手段，滤材会对部分病毒产生吸附，从而去除病毒。层析技术是目前迅速发展的一种蛋白纯化方法，在纯化过程中蛋白产品被吸附在层析柱而病毒存在于流动相中，在蛋白纯化的同时进行病毒的去除。Roberts等(2012)经研究发现，静脉注射用免疫球蛋白产品经离子交换层析过程后，1型单纯疱疹病毒和牛***状瘤病毒的滴度下降＞5log，能够对病毒有效的去除，对其他模拟病毒虽有一定的去除作用，但是不能达到有效的移除。

以上冷乙醇沉淀、深度过滤、层析等都是蛋白产品的生产过程，同时也具有病毒移除的作用。

Tijsensen等人(US 2014/0017223Al)公开了制备胰酶制剂(PEP)的方法，包括使自方丙内醋(BPL)与含有一种或多种胰酶的制剂反应足够的时间以降低制剂中的病毒感染性。

Ramsch等人(美国专利US 2011/0268844Al)公开了用高压和/或筛选过滤处理胰酶制剂，然后在15℃用4000、5000或6000巳的高压处理5分钟。根据Ramsch的说法，这适用于所有病毒形式，如DNA和RNA病毒，有包膜和无包膜病毒以及细菌和真菌，并且包含至少50％的生物活性。他还进一步公开了使用高压处理灭活某些病毒是否成功的不可预测性。由于样品的压缩性不同，必须根据样品是液体还是固体来选择不同的方法条件。

Kurfurst等人(US 2009/0233344Al)公开了一种通过处理具有0.5重量％或更少残留水分的样品来减少样品的病毒和微生物污染的方法，将胰酶制剂在84℃的温度(优选80℃及以下)热处理48小时或30小时，其中所得的胰酶制剂的活性为至少50％的生物活性。所公开的胰酶制剂病毒感染性降低了大于llog₁₀的log₁₀折减系数(reduction factor)。

Mann(US 2009/6749851)公开了用于灭菌消化酶制剂的方法，以降低活性生物污染物如病毒、细菌、酵母、霉菌和真菌的水平。包含消化酶的组合物的处理包含通过(a)降低温度、(b)还原溶剂、或(c)向组合物中加入稳定剂，然后照射组合物来稳定组合物。

Lewis(US 1971/3 956 483)公开了膜酶制剂加工和细菌减少的同时保持淀粉分解、蛋白水解和脂肪分解活性的方法。该方法包括将膜酶制剂加热至49-82℃之间的足够高的温度。然而，Lewis没有提供灭活或减少病毒数量的方法。

综上所述，目前化学法中的S/D法、低pH孵放法、辛酸法、光化学法，物理法中的巴氏消毒法和干热法等是血液制品制备过程中核心的病毒灭活方法。巴氏消毒法和干热法都属于热力灭活病毒的方法，即通过一定的温度使病毒蛋白变性，从而破坏病毒结构达到灭活病毒的目的，但与此同时，一定的温度会使蛋白制品变性和生物活性降低，故采用上述两种方法灭活病毒时，常需对蛋白制品进行特殊处理(包被、加保护剂等)，但同时这些保护剂在保护蛋白制品的同时也保护了病毒，降低了病毒灭活率，从而加大了病毒灭活的难度。光化学法是利用某些光敏剂怼病毒表面及病毒核酸结构具有强烈的亲和作用，在适当波长的光照下易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构的方法，但该方法对蛋白活性的损失较大。

因此，特别的挑战是灭活或减少来自活性物质是酶混合物的生物提取物基质的病毒，而在该过程中不破坏或改变蛋白质的酶活性或比例。

而有机溶剂/活性剂(S/D法)是利用有机溶剂和活性剂的配伍，破坏病毒脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。该方法具有很好的蛋白质兼容性，同时能有效的灭活病毒，且对生物制品的活性影响甚微。

本发明中使用的活性剂，是一种亲脂性的非离子型表面活性剂，既是优良的乳化剂，又是安全高效广谱的抗菌剂，且不受pH限制，在中性或微碱性条件下，仍有较好的抗菌效果，对囊膜病毒的复制和传播有抑制作用，且可被作为饲料添加剂添加于饲料中。

目前，对于动物源性生化提取制品，尤其是从胰渣中提取规模化生产饲料级胰酶的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道，本发明提供了减少或灭活饲料级胰酶病毒污染的方法，而不影响胰酶制品中所含酶的活性并且不改变其所含酶的组成。此外，该方法在最终产品中不产生任何有毒化合物或残留物。

发明内容

针对现有生物制品中病毒去除和灭活存在的操作时间长，容易造成生物活性物质失活，病毒灭活不彻底，活性物质提取量较低等不足，本发明提供一种简单、快速、经济、适用范围广的，能在胰渣中提取饲料级胰酶过程中，获得最大产量最高活性胰酶的同时灭活存在于胰渣中病毒的方法，以保证胰酶制品能够更安全有效的应用于饲料添加剂生产中。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种在制备饲料级胰酶中的灭活病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、原料处理：原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，用平板粉碎机或刨片机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，再用搅拌机搅拌15-60分钟溶解，或者用磨浆机磨浆溶解，得溶解液；

B、离心：将步骤A的溶解液用离心机离心或者板框压滤机过滤除渣，得到上清滤液；

C、沉淀、浓缩：在步骤B的上清滤液中加入有机溶剂乙醇和活性剂，搅拌均匀后沉淀，在5-20℃条件下沉淀0.5-2.5小时，超滤收集沉淀；

D、制粒、包衣、干燥：将步骤C中的沉淀与饲料用载体混合，利用制粒装置进行制粒，然后通过包衣装置对产品进行包衣，最后通过干燥装置进行干燥，制得胰酶。

优选的，所述原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，原料获取过程中采用有机溶剂乙醇进行过提取。

优选的，所述步骤A溶解温度控制在5-20℃，蒸馏水与原料比例控制在10-1:1。。

优选的，所述步骤B中离心机转速控制在1000-3000r/min。

优选的，所述步骤C中有机溶剂乙醇的浓度为60-100％；所述步骤C中活性剂为一种亲脂性的非离子型表面活性剂(可为脂肪酸单/双甘油酯、单硬脂酸甘油酯、甘油脂肪酸酯等)，其浓度为2g/L-10g/L，其对有囊膜的病毒具有较好的防治效果，是一种广泛的非特异性防治动物病毒的饲料添加剂，既不会对动物造成应激而影响动物生长，而且还会促进动物生长。

优选的，所述步骤D中饲料用载体为玉米淀粉、二氧化硅、明胶、稻壳粉中的任一种。

优选的，所述步骤D中采用超滤进行浓缩，干燥装置为鼓风干燥装置、真空干燥装置或流化床干燥装置。

与现有技术相比：该从胰渣中提取饲料级胰酶的制备工艺，能在制备胰酶制品的过程中，用有机溶剂和活性剂破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而彻底灭活胰渣原料中残留的病毒，同时保持蛋白的结构和功能，不仅病毒灭活操作简单，处理时间短，经济实用，而且所得制品纯度高、性质稳定便于保存、安全性好。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实施例对本发明作更详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。

实施方式1

在制备饲料级胰酶中灭活病毒的方法，包括下列步骤：

A、原料处理：原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，用平板粉碎机或刨片机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，蒸馏水与原料比例控制在2:1再用搅拌机搅拌15分钟溶解，或者用磨浆机磨浆溶解，得溶解液；

B、离心：将步骤A的溶解液用离心机2500rpm离心5分钟，得到上清滤液；

C、沉淀、浓缩：在步骤B的上清滤液中加入有机溶剂70％乙醇和活性剂5g/L，搅拌均匀后沉淀，在5-20℃条件下沉淀0.5小时，离心弃上清收集沉淀；

D、干燥、制粒：将上述沉淀与适量的饲料用载体如玉米淀粉、二氧化硅、稻壳粉等混合，干燥或制粒后干燥，然后检测分装打包。所得胰酶产品质量指标为：水分5.37％、胰蛋白酶活力1326u/g、胰淀粉酶活力612u/g、胰脂肪酶活力873u/g。

实施方式2

A、原料处理：原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，用平板粉碎机或刨片机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，蒸馏水与原料比例控制在4:1再用搅拌机搅拌30分钟溶解，或者用磨浆机磨浆溶解，得溶解液；

B、离心：将步骤A的溶解液用离心机2500rpm离心5分钟，得到上清滤液；

C、沉淀、浓缩：在步骤B的上清滤液中加入有机溶剂90％乙醇和活性剂7g/L，搅拌均匀后沉淀，在5-20℃条件下沉淀1小时，离心弃上清收集沉淀；

D、干燥、制粒：将上述沉淀与适量的饲料用载体如玉米淀粉、二氧化硅、稻壳粉等混合，干燥或制粒后干燥，然后检测分装打包。所得胰酶产品质量指标为：水分5.12％、胰蛋白酶活力1152u/g、胰淀粉酶活力656u/g、胰脂肪酶活力972u/g。

实施方式3

A、原料处理：原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，用平板粉碎机或刨片机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，蒸馏水与原料比例控制在5:1再用搅拌机搅拌40分钟溶解，或者用磨浆机磨浆溶解，得溶解液；

B、离心：将步骤A的溶解液用离心机2000rpm离心10分钟，得到上清滤液；

C、沉淀、浓缩：在步骤B的上清滤液中加入有机溶剂90％乙醇和活性剂4g/L，搅拌均匀后沉淀，在10-20℃条件下沉淀2小时，离心弃上清收集沉淀；

D、干燥、制粒：将上述沉淀与适量的饲料用载体如玉米淀粉、二氧化硅、稻壳粉等混合，干燥或制粒后干燥，然后检测分装打包。所得胰酶产品质量指标为：水分5.30％、胰蛋白酶活力1221u/g、胰淀粉酶活力726u/g、胰脂肪酶活力924u/g。

为表明本发明在制备胰酶样品过程中，彻底灭活胰渣中残留的病毒的灭活效果，下面通过检测实例加以验证，其中灭活效果的检测是依据国药监注[2002]第160号文进行的：

A、各取两批胰渣样品，用平板粉碎机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，蒸馏水与原料比例控制在3:1再用搅拌机搅拌15分钟溶解，得溶解液；分别加入水泡性口炎病毒(Vesicular stoma ti tis virus,VSV，滴度为：8.0TCID50/ml)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV 1，滴度为：9.0TCID50/ml)为指示病毒，Vero细胞为病毒检测用细胞。按实施方式1的方法制得灭活病毒的胰酶样品。

B、设置对照组，阳性对照组为留存的部分病毒，空白对照组为未采用实施方式1处理的样品

C、病毒检测

采用96孔培养板微量法培养4天观察，用Karber法计算病毒滴度，以评估灭活病毒的效率。病毒灭活方案设未处理的含病毒的阳性对照、S/D系统空白对照(含病毒)，无病毒阴性对照，验证结果见表1

表1 灭活工艺验证结果

注：每组数据重复测定两次，取平均值。

验证结论：在本发明方法中，有机溶剂/活性剂(S/D)处理0.5h、1.0h、1.5h、2.0h和2.5h后，可分别将样品中8.5logs的水殖性口炎病毒(VSV)和9.0logs的脊髓灰质炎病毒(PV-1)降到2.0-3.2logs，且重复两次检测数据相近，根据《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术评审一般原则》及《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，认定本方法为有效的病毒灭活方法，该产品的病毒安全性是可以保保证的。

对所制得的饲料级胰酶样品进行动物饲养试验，动物健康，无异常反应。且在动物日粮中添加(150ppm)可以提高饲料利用率，增加营养物质的表观消化率，而不影响血液代谢产物以及粪便中菌含量。

本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)均通过引用并入本文，其程度如同指出每个参考文献被单独且具体地通过引用并入本文并且在本文中完整阐述。

虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。