阅读说明：本技术 血液透析器中n-甲基吡咯烷酮、聚维酮k30残留的测定方法 (Method for measuring residues of N-methyl pyrrolidone and povidone K30 in hemodialyzer ) 是由 沈永� 郭利娟 吴长岩 杜福映 孟凯 刘斌 高晋权 于 2018-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的测定方法。血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的测定方法为：用水浸提血液透析器中的目标物,得到样品供试液；采用高效液相色谱法检测所述样品供试液中的目标物的含量,进而计算出血液透析器中目标物的残留量；所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱C18柱,流速0.3～0.7mL/min,检测波长190～210nm,柱温20～30℃,进样量50～100μL。本发明能准确、灵敏、高效地测定血液透析器中的N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留量,这对于血液透析器的研究开发,质量控制及产品监管都具有重要的意义。(The invention provides a method for measuring residues of N-methylpyrrolidone and povidone K30 in a hemodialyzer. The method for measuring the residues of N-methylpyrrolidone and povidone K30 in the hemodialyzer comprises the following steps: leaching a target object in a hemodialyzer by using water to obtain a sample test solution; detecting the content of the target in the sample test solution by adopting a high performance liquid chromatography, and further calculating the residual quantity of the target in a hemodialyzer; the chromatographic conditions of the high performance liquid chromatography are as follows: a chromatographic column C18, the flow rate is 0.3-0.7 mL/min, the detection wavelength is 190-210 nm, the column temperature is 20-30 ℃, and the sample injection amount is 50-100 mu L. The method can accurately, sensitively and efficiently determine the residual quantity of the N-methylpyrrolidone and the povidone K30 in the hemodialyzer, and has important significance for research and development, quality control and product supervision of the hemodialyzer.)

血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的测定方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其是涉及血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的测定方法。

背景技术

血液透析器是一种用于治疗急慢性肾功能衰竭的医疗器械，由空心纤维、外壳、密封层和端盖组成。血液透析器在生产过程中透析膜部位使用加工助剂N-甲基吡咯烷酮及添加剂聚维酮K30。N-甲基吡咯烷酮及聚维酮K30均易溶于水。在临床使用中，血液透析器中残留N-甲基吡咯烷酮及聚维酮K30均有滤沥到血液的风险。据文献报道，N-甲基吡咯烷酮的慢性作用可引发中枢神经系统机能损伤，致使呼吸器官、肾脏、血管系统的病变。血液透析器中残留N-甲基吡咯烷酮具有明显的安全风险。

现有技术中，有关N-甲基吡咯烷酮和聚维酮K30的检测方法很多，然而并没有同时检测N-甲基吡咯烷酮和聚维酮K30的相关报道，也没有针对血液透析器中N-甲基吡咯烷酮/聚维酮K30残留检测的相关报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的测定方法，该测定方法能够准确、灵敏、高效地测定血液透析器中的N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留量。

为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：

血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的测定方法，包括下列步骤：

用水浸提血液透析器中的N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30，得到样品供试液；

采用高效液相色谱法检测所述样品供试液中的N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30的含量，进而计算出血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30的残留量；

所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：C18柱，

流速：0.3～0.7mL/min，

检测波长：190～210nm，

柱温：20～30℃，

进样量：50～100μL，

流动相：乙腈与缓冲溶液以1～5:95～99的体积比组成，所述缓冲溶液为pH为2.5±0.1的磷酸盐缓冲液。

本发明的以上方法解决了无法同时检测血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留的问题。

测定方法中的核心在于色谱条件，在一定波长下，采用特定的流动相和固定相，才能将N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30有效分离，并且保证两者与邻近色谱峰的分离度大于1.5，进而提高检测方法的准确度、精密度和高效性，并满足了方法验证过程中对专属性、线性、准确度、精密度等方面的要求，该方法对于血液透析器的研究开发、质量控制及产品监管都具有重要意义。

本发明中，流速可在0.3～0.7mL/min范围内任意选择，例如0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min等。

本发明中，检测波长可在190～210nm，范围内任意选择，例如190nm、195nm、200nm、205nm、210nm等。

本发明中，柱温可在20～30℃范围内任意选择，例如20℃、22℃、25℃、27℃、29℃、30℃等。

本发明中，进样量可在50～100μL范围内任意选择，例如50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL等。

本发明的流动相中，乙腈与缓冲溶液以1～5:95～99范围内任意体积比组成，例如1:99，3:97，4:96，5:95等。

在以上范围内，各参数的优选范围如下。

优选地，所述高效液相色谱法的色谱柱为150mm×4.6mm×3.5μm的C18柱或等效色谱柱；

优选地，流速为0.5～0.7mL/min，

优选地，检测波长为：200～210nm，

优选地，柱温为：20～25℃，

优选地，进样量：80～100μL，

优选地，流动相：乙腈与缓冲溶液以3～5:95～97的体积比组成。

优选地，所述缓冲溶液由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸和水组成，以定容1L的缓冲液为例，配制过程为：

精密称取磷酸二氢钾2.085g、无水磷酸氢二钾0.2175g于1L容量瓶中，用水溶解、稀释，加入1.0mL磷酸，用水定容至刻度。

本发明中，浸提的目的是充分提取出透析膜部位残留的N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30，进而检测残留量，为血液透析器的安全性监控提供准确数据。因此，优选模拟血液透析器的工况，来浸提N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30，具体如下。

用水在所述血液透析器的血室与透析液室之间进行循环，循环预设时间后，取出循环液，即为样品供试液。

该方法模拟临床上血液透析的过程，能充分考察N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留对人体的危害。

其中，循环时间不宜过长或过短，过短无法将两种化合物充分浸提出，过长则浪费时间和能源，经过筛选，优选循环5小时以上。

循环的温度和流速优选模拟临床上血液透析的条件，即所述循环的温度为35～38℃，优选37～38℃；

优选地，所述循环的流速为150～250mL/min，优选150～200mL/min。

为了提高检测准确度，降低杂质对测定的影响，循环水优选采用三次水。

同时，优选在循环之前对所述血液透析器进行预冲洗；

所述预冲洗的方法为：用硅胶管分别与所述血液透析器的血室、透析液室连接形成两个独立的循环系统，分别用水对该两个独立的循环系统冲洗。

另外，在计算所述血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30的残留量时，还优选扣除空白供试液，以提高实验准确性；所述空白供试液通过以下方法获得：用硅胶管连成循环系统，再用水对该循环系统冲洗，所述冲洗的条件(包括温度、流速等)与获得所述样品供试液的浸提条件相同。

优选地，所述循环的用水量为400～600mL，优选500mL，以保证目标物的浓度足够大，以被准确检测出。在最终进样前通常定容至600mL。

综合考虑样品的获取方法，更优选的色谱条件如下：

色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm或等效柱；

流速：0.5mL/min；

检测波长：200nm；

柱温：25℃；

进样量：100uL；

流动相：乙腈：缓冲溶液＝3:97，缓冲溶液的配制：精密称取磷酸二氢钾2.085g、无水磷酸氢二钾0.2175g于1L容量瓶中，用水溶解、稀释，加入1.0mL磷酸，用水定容至刻度。

采用本发明的方法检测血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30的残留量时，绘制标准曲线时浓度范围对准确度也有一定影响。

针对N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选选取浓度为0.5μg/mL～30μg/mL区间的标准样品绘制曲线，例如0.5μg/mL～20μg/mL。

针对聚维酮K30(PVP)，优选选取浓度为0.5μg/mL～100μg/mL区间的标准样品绘制曲线，例如0.5μg/mL～80μg/mL。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)本发明的方法能够高效、准确、灵敏地测定血液透析器中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30的残留，解决了取样难题以及同时检测两种化合物的难题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的预冲洗血液透析器的水流路线图；

图2为本发明实施例1提供的获取样品供试液的水流路线图；

图3为实施例1提供的样品供试液的色谱图；

图4为实施例1提供的N-甲基吡咯烷酮标准溶液高效液相色谱图；

图5为实施例1提供的聚维酮K30标准溶液高效液相色谱图；

图6为实施例1提供的空白供试液的色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一、材料和试剂

材料：血液透析器(新华医疗器械有限公司)。

试剂：磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙腈、N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30、三次水、高效液相色谱仪(购于Waters)、XBridge RP C18色谱柱(购于Waters)。

二、检测方法步骤

(1)溶液配制：配制实验过程中所需如下溶液

a、N-甲基吡咯烷酮(NMP)系列标准溶液配制：

精密称取NMP标准品54.19mg于50mL棕色容量瓶，用水稀释、定容，得浓度为1.0816mg/mL标准储备液，采用逐级稀释法分别配制浓度为0.5408、0.1082、0.2163、0.5408、1.082、2.163、5.408、10.82、21.63μg/mL标准溶液。

b、聚维酮K30(PVP)系列标准溶液配制：

精密称取PVP标准品50.69mg于50mL棕色容量瓶，用水溶解、稀释、定容，得浓度为1.0138mg/mL标准储备液，采用逐级稀释法分别配制浓度为5.069、10.138、20.276、40.55、81.10μg/mL标准溶液。

c、缓冲溶液配制

精密称取磷酸二氢钾2.085g、无水磷酸氢二钾0.2175g于1L容量瓶中，用水溶解、稀释，加入1.0mL磷酸，用水定容至刻度。

(2)色谱条件：根据供试液需要确定如下色谱条件

c、色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm或等效柱；

d、流速：0.5mL/min；

e、检测波长：200nm；

f、柱温：25℃；

g、进样量：100uL；

h、流动相：乙腈：缓冲溶液＝3:97(体积比)。

(3)供试样品预冲洗：按图1图示预冲洗血液透析器，将血液透析器产品的血液侧与透析液侧分别与1个玻璃烧杯用硅胶管连接，形成2个分别独立的循环系统，2个玻璃烧杯中各加入1000mL三次水通过滚压泵注满整个闭路系统，然后以200mL/min的流速分别冲洗血液透析器血液侧与透析液侧10分钟，然后吹入空气尽量祛除血液透析器中的液体。

(4)样品供试液与空白供试液制备：按图2图示方式，通过滚压泵用500mL三次水于37℃±1℃以200mL/min的流速对预冲洗后的透析器血室与透析液室进行循环，循环5小时后将循环液取出，用三次水定容至600mL得样品供试液，备用。500mL三次水通过硅胶管形成循环系统于37℃±1℃以200mL/min的流速循环，循环5小时后将循环液取出，用三次水定容至600mL得空白供试液。

(5)样品供试液、空白供试液测定：取样品供试液、空白供试液经0.45μm滤膜过滤，按照(2)色谱条件测定；

(6)标准溶液测定：N-甲基吡咯烷酮取浓度为0.5408、0.1082、0.2163、0.5408、1.082、2.163、5.408、10.82、21.63μg/mL系列标准溶液；聚维酮K30取5.069、10.138、20.276、40.55、81.10μg/mL系列标准溶液，按照(2)色谱条件测定；

(7)结果分析：采用保留时间进行定性分析，外标法进行定量分析。

取样品供试液、N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30标准溶液按照(2)色谱条件测定，样品供试液、N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30标准溶液高效液相色谱图见图3、图4、图5。对比图3、图4、图5，可知供试品中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30与N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30标准品保留时间基本一致。

血液透析器供试样品N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30定量分析，取供试样品3份按照(3)(4)(5)步骤操作，根据外标法由线性回归方程计算，测得供试品中N-甲基吡咯烷酮溶出量为161.84μg/套-271.22μg/套、聚维酮K30溶出量为6423.79μg/套-9459.70μg/套。

方法验证

(1)专属性：取空白供试液，0.45μm滤膜过滤，按照(2)色谱条件测定，空白高效液相色谱图见图6。结合供试品定性分析，双酚A色谱峰峰形良好且与邻近色谱峰分离度均大于1.5,空白溶剂对N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30测定均无干扰，表明本技术方法满足分析要求。

(2)标准工作溶液线性

i.N-甲基吡咯烷酮标准工作溶液线性测定：取浓度为0.5408、0.1082、0.2163、0.5408、1.082、2.163、5.408、10.82、21.63μg/mL系列标准溶液，按照(2)色谱条件测定，以N-甲基吡咯烷酮浓度(μg/mL)为横坐标，以N-甲基吡咯烷酮色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程(见表1)。

表1 N-甲基吡咯烷酮标准溶液——峰面积数据表

线性回归方程y＝807374x+47765，相关系数r＝0.9999，N-甲基吡咯烷酮在0.05408-21.63μg/mL范围内线性良好。

j.聚维酮K30标准工作溶液线性测定:取浓度为5.069、10.138、20.276、40.55、81.10μg/mL系列标准溶液，按照(2)色谱条件测定，以聚维酮K30浓度(μg/mL)为横坐标，以聚维酮K30色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程(见表2)。

表2 聚维酮K30标准溶液——峰面积数据表

线性回归方程y＝7806.2x-6615.9，相关系数r＝0.9999，聚维酮K30在5.069-81.10μg/mL范围内线性良好。

(3)精密度(重复性)实验：

k.N-甲基吡咯烷酮精密度试验：取浓度为取浓度为0.05408、0.5408、5.408μg/mLN-甲基吡咯烷酮标准溶液，按照(2)色谱条件测定，连续进6次，测定其峰面积(见表3)。对标准品溶液平行6次测定结果，相对标准偏差为0.086％-1.33％，表明本法标准品测定精密度良好。同时，由m回收率试验对N-甲基吡咯烷酮进行低、中、高3个水平回收率精密度测定，每个加标水平平行测定3次，相对标准偏差为0.141％-0.823％，表明本方法测定样品精密度良好。

表3 N-甲基吡咯烷酮精密度试验结果(n＝6)

l.聚维酮K30精密度试验：取浓度为5.069、20.276、81.10μg/mL聚维酮K30标准溶液,按照(2)色谱条件测定，连续进6次，测定其峰面积(见表4)。对标准品溶液平行6次测定结果，相对标准偏差为0.190％-2.44％，表明本法标准品测定精密度良好。同时，由回收率试验对聚维酮K30进行低、中、高3个水平回收率精密度测定，每个加标水平平行测定3次，相对标准偏差为0.734％-3.46％，表明本方法测定样品精密度良好。

表4 PVP精密度试验结果(n＝6)

(4)回收率实验

m.N-甲基吡咯烷酮回收率试验：以供试品液为基质，分别对N-甲基吡咯烷酮进行低、中、高3个水平添加回收率和精密度的测定，每个加标水平平行测定3次，方法回收率和相对标准偏差(RSD)见表5。结果表明N-甲基吡咯烷酮的平均回收率93.12％-96.05％,相对标准偏差为0.141％-0.823％，表明方法的准确度达到分析要求。

n.聚维酮K30回收率试验：以供试品液为基质，分别对聚维酮K30进行低、中、高3个水平添加回收率和精密度的测定，每个加标水平平行测定3次，方法回收率和相对标准偏差(RSD)见表6。结果表明聚维酮K30的平均回收率84.05％-102.84％，相对标准偏差为0.734％-3.46％，表明方法的准确度达到分析要求。

表5 N-甲基吡咯烷酮回收率和精密度结果(n＝3)

加标浓度(μg/套)	平均回收率(％),n＝3	RSD(％),n＝3
			129.78	93.12	0.8230
1297.8	96.05	0.1409
			6489.78	94.57	0.5281

表6 聚维酮K30回收率和精密度结果(n＝3)

加标浓度(μg/套)	平均回收率(％),n＝3	RSD(％),n＝3
			3041.4	84.05	3.4580
12165.6	102.84	0.7344
			48060	92.77	0.8281

以上数据可确定，血液透析器供试样品中N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30残留单体经三次水加严模拟浸提后，N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30采用C18液相色谱柱分离，高效液相-紫外检法测定，能够准确、灵敏、高效地测定血液透析器N-甲基吡咯烷酮、聚维酮K30溶出量。

实施例2

与实施例1的样品供试液、空白供试液的获取方式以及标准溶液的配制均相同，区别在于色谱检测条件不同：

色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm；

流速：0.7mL/min；

检测波长：205nm；

柱温：30℃；

进样量：90μL；

流动相：乙腈：缓冲溶液＝1:99(体积比)，缓冲溶液与实施例1相同。

结果显示该方法也表现出：专属性好，特异性强，准确度高，精密度、线性良好，两个化合物的标准工作曲线相关系r均大于0.999，N-甲基吡咯烷酮方法精密度相对标准方差RSD为0.083％-1.52％，低、中、高浓度平均回收率为92.11％-95.12％；聚维酮K30方法精密度相对标准方差RSD为0.22％-3.72％，低、中、高浓度平均回收率82.10％-100.22％。

实施例3

与实施例1的样品供试液、空白供试液的获取方式以及标准溶液的配制均相同，区别在于色谱检测条件不同：

色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm；

流速：0.3mL/min；

检测波长：195nm；

柱温：20℃；

进样量：80uL；

流动相：乙腈：缓冲溶液＝5:95(体积比)，缓冲溶液与实施例1相同。

结果显示该方法也表现出：专属性好，特异性强，准确度高，精密度、线性良好，标准工作曲线相关系r均大于0.999，N-甲基吡咯烷酮方法精密度相对标准方差RSD为0.091％-1.45％，低、中、高浓度平均回收率为91.10％-97.25％；聚维酮K30方法精密度相对标准方差RSD为0.25％-3.75％，低、中、高浓度平均回收率85.90％-103.58％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。