血液透析器中双酚a残留的测定方法
阅读说明：本技术 血液透析器中双酚a残留的测定方法 (Method for measuring bisphenol A residue in hemodialyzer ) 是由 郭利娟 孙兴霞 许凯 刘爱娟 陈方 刘栋 胡建宁 于 2018-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了血液透析器中双酚A残留的测定方法。测定方法为：用有机溶剂浸提血液透析器中的双酚A,得到样品供试液；采用高效液相色谱法检测样品供试液中的双酚A的含量,进而计算出残留量；色谱柱C18柱,流速0.8～1.7mL/min,激发波长230-234nm,发射波长310-320nm,柱温20～35℃,进样量5～15μL,乙腈与缓冲溶液以30～90:20～70的体积比梯度洗脱,所述缓冲溶液为pH为3.8～4.2的无机盐缓冲液。本发明能准确、灵敏、高效地测定血液透析器中的双酚A残留量,这对于血液透析器的研究开发,质量控制及产品监管都具有重要的意义。(The invention provides a method for measuring bisphenol A residue in a hemodialyzer. The determination method comprises the following steps: leaching bisphenol A in a hemodialyzer by using an organic solvent to obtain a sample test solution; detecting the content of bisphenol A in a sample test solution by adopting a high performance liquid chromatography, and further calculating the residual quantity; a chromatographic column C18 with a flow rate of 0.8-1.7 mL/min, an excitation wavelength of 230-234nm, an emission wavelength of 310-320nm, a column temperature of 20-35 ℃, a sample injection amount of 5-15 muL, and acetonitrile and a buffer solution which are inorganic salt buffer solution with a pH value of 3.8-4.2, wherein the volume ratio of acetonitrile to buffer solution is 30-90: 20-70. The invention can accurately, sensitively and efficiently determine the bisphenol A residual quantity in the hemodialyzer, and has important significance for research and development, quality control and product supervision of the hemodialyzer.)
技术领域
本发明涉及分析化学领域，尤其是涉及血液透析器中双酚A的测定方法。
背景技术
血液透析器是一种用于治疗急慢性肾功能衰竭的医疗器械，由空心纤维、外壳、密封层和端盖组成。血液透析器外壳及端盖部分为聚碳酸酯材质，其主要合成原料为双酚A。双酚A易溶于甲醇、乙醇、丙酮、甲苯等有机溶剂，难溶于水。血液透析器在临床使用时，血液透析器端盖及外壳与血液有直接和间接的接触，产品中残留双酚A单体可能溶出或迁移至血液。据国内外对双酚A毒理学研究报道，双酚A对小鼠有一定的生殖毒性、遗传毒性并使其免疫防御机能下降。血液透析器中残留双酚A单体具有明显的安全风险，所以控制双酚A单体残留量是非常有必要的。
现有技术中，有关双酚A的检测方法很多，然而并没有针对血液透析器中双酚A残留检测的相关报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供血液透析器中双酚A残留的测定方法，该测定方法能够准确、灵敏、高效地测定血液透析器中双酚A的残留量。
为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：
血液透析器中双酚A残留的测定方法，包括下列步骤：
用有机溶剂浸提血液透析器中的双酚A，获取样品供试液；
采用高效液相色谱-荧光检测器检测所述样品供试液中的双酚A的含量，进而计算出血液透析器中双酚A的残留量；
所述检测的色谱条件为：
色谱柱：C18柱，
流速：0.8～1.7mL/min，
激发波长230-234nm，发射波长310-320nm，
柱温：20～35℃，
进样量：5～15μL，
流动相：乙腈与缓冲溶液以30～90:20～70的体积比梯度洗脱，优选31～80:20～69的体积比，所述缓冲溶液为pH为3.8～4.2的无机盐缓冲液，优选pH4～4.1。
本发明测定方法的核心在于色谱条件，采用高效液相色谱-荧光检测器，采用特定的流动相和固定相，才能将双酚A从浸提液中有效分离出，并且保证目标物与邻近色谱峰的分离度大于1.5，进而提高检测方法的准确度、精密度和高效性，且满足了方法验证过程中对专属性、线性、准确度、精密度等方面的要求，该方法对于血液透析器的研究开发、质量控制及产品监管都具有重要意义。
本发明中，流速可在0.8～1.7mL/min范围内任意选择，例如0.8mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min、1.6mL/min、1.7mL/min等。
本发明中，激发波长可在230-234nm范围内任意选择，例如230nm、231nm、232nm、233nm、234nm等，发射波长可在310-320nm范围内任意选择，例如310nm、312nm、314nm、316nm、318nm、320nm等。
本发明中，柱温可在20～35℃范围内任意选择，例如20℃、22℃、25℃、27℃、29℃、30℃、32℃、35℃等。
本发明中，进样量可在5～15μL范围内任意选择，例如5μL、7μL、8μL、10μL、15μL等。
本发明采用梯度洗脱，乙腈/缓冲溶液的初始体积比可以为30:70，或者31:69，或者40:60等；终点体积比可以为80:20，或者85:15，或者70:30，或者90:10,等。不同梯度下的流速可以相同或不同。
在以上范围内，各参数的优选范围如下。
优选地，所述高效液相色谱法的色谱柱为150mm×4.6mm×3.5μm的C18柱或等效色谱柱；
优选地，流速为1.0～1.5mL/min，
优选地，激发波长232-234nm，发射波长314-320nm，
优选地，柱温为：25～30℃，
优选地，进样量：8～10μL，
优选地，所述梯度洗脱按照表1进行：
表1梯度洗脱
时间/min
乙腈/％
缓冲液/％
0
31
69
25
31
69
27
80
20
32
80
20
34
31
69
42
31
69
优选地，所述缓冲溶液由醋酸铵、醋酸和水组成，以定容1L的缓冲液为例，配制过程为：
精密称取1.54g醋酸铵于1L容量瓶中，用水溶解、稀释、定容，用醋酸调节pH至预设值。
本发明中，浸提的目的是充分提取出端盖及外壳部位残留的双酚A，进而检测残留量，为血液透析器的安全性监控提供准确数据，因此，优选模拟血液透析器的工况，来浸提双酚A，具体如下。
用有机溶剂在所述血液透析器的血室与透析液室之间进行循环，循环预设时间后，取出循环液，即为样品供试液。
该方法模拟临床上血液透析的过程，能充分考察双酚A残留对人体的危害。
其中，循环时间不宜过长或过短，过短无法将双酚A充分浸提出，过长则浪费时间和能源，经过筛选，优选循环5小时以上。
循环的温度和流速优选模拟临床上血液透析的条件，即所述循环的温度为35～38℃，优选37～38℃；
优选地，所述循环的流速为150～250mL/min，优选150～200mL/min。
为了提高检测准确度，循环所用的有机溶剂优选采用甲醇、乙醇、丙酮或甲苯，优选甲醇。
同时，优选在循环之前对所述血液透析器进行预冲洗；
所述预冲洗的方法为：用硅胶管分别与所述血液透析器的血室、透析液室连接形成两个独立的循环系统，分别用水对该两个独立的循环系统冲洗。
另外，在计算所述血液透析器中双酚A的残留量时，还优选扣除空白供试液，以提高实验准确性；所述空白供试液通过以下方法获得：用硅胶管连成循环系统，再用有机溶剂对该循环系统冲洗，所述冲洗的条件与获得所述样品供试液的浸提条件相同。此处所用的有机溶剂与获取样品供试液的有机溶剂相同。
优选地，所述循环的有机溶剂用量为400～600mL，优选500mL，以保证目标物的浓度足够大，以被准确检测出。在最终进样前通常定容至600mL。
另外，为提高供试检验液灵敏度在获取样品供试液和空白供试液后，建议取部分溶液旋蒸至干，然后用同样的有机溶剂重溶，用滤膜(通常用0.45μm滤膜)过滤。
综合考虑样品的获取方法，优选的色谱条件如下：
色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5um或等效柱；
流速：1.0～1.5mL/min；
激发波长：232nm发射波长：314nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
流动相：按照表2进行梯度洗脱。
表2梯度洗脱
时间/min
乙腈/％
缓冲液/％
0
31
69
25
31
69
27
80
20
32
80
20
34
31
69
42
31
69
采用本发明的方法检测血液透析器中双酚A的残留量时，绘制标准曲线时浓度范围对准确度也有一定影响。
优选选取浓度为50ng/mL～10000ng/mL左右区间的标准样品绘制曲线，例如50ng/mL～1020ng/mL。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)本发明的方法能够高效、准确、灵敏地测定血液透析器中双酚A的残留，解决了取样难题以及高效分离的难题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的预冲洗血液透析器的循环路线图；
图2为本发明实施例1提供的获取样品供试液的循环路线图；
图3为实施例1提供的双酚A标准品与供试品高效液相色谱对比图；
图4为实施例1提供的空白溶剂高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一、材料和试剂
材料：血液透析器(新华医疗器械有限公司)。
试剂：甲醇、醋酸、醋酸铵、乙腈、双酚A、三次水、高效液相-荧光色谱仪(购于安捷伦)、XBridge RP C18色谱柱(购于Waters)。
二、检测方法步骤
(1)溶液配制：配制实验过程中所需如下溶液
a、标准溶液配制
精密称取双酚A标准品5.12mg于50mL棕色容量瓶，用甲醇溶解、稀释、定容，得浓度为102.4μg/mL标准储备液，采用逐级稀释法分别配制浓度为51.2、102.4、204.8、409.6、1024ng/mL标准溶液。
b、缓冲溶液配制
精密称取1.54g醋酸铵于1L容量瓶中，用水溶解、稀释、定容，用醋酸调节pH至4.0。
(2)色谱条件：根据供试液需要确定如下色谱条件
c、色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5um或等效柱；
d、流速：见表3；
e、激发波长：232nm，发射波长：314nm；
f、柱温：30℃；
g、进样量：10μL
h、流动相：A乙腈；B缓冲溶液，洗脱梯度见表3。
表3洗脱条件
(3)供试样品预冲洗：按图1图示预冲洗血液透析器，将血液透析器产品的血液侧与透析液侧分别与1个玻璃烧杯用硅胶管连接，形成2个分别独立的循环系统，2个玻璃烧杯中各加入1000mL三次水通过滚压泵注满整个闭路系统，然后以200mL/min的流速分别冲洗血液透析器血液侧与透析液侧10分钟，然后吹入空气尽量祛除血液透析器中的液体。
(4)样品供试液与空白供试液制备：按图2图示方式，通过滚压泵用500mL甲醇于37℃±1℃以200mL/min的流速对预冲洗后的透析器血室与透析液室进行循环，循环5小时后将循环液取出，用甲醇定容至600mL得样品供试液，备用。500mL甲醇通过硅胶管形成循环系统于37℃±1℃以200mL/min的流速循环，循环5小时后将循环液取出，用甲醇定容至600mL得空白供试液。
(5)样品供试液、空白供试液测定：量取100mL供试品循环液旋蒸至干，精密移取2.00mL甲醇溶解旋蒸残渣，0.45μm滤膜过滤，得供试液，按照(2)色谱条件测定；
(6)标准溶液测定：取浓度为51.2、102.4、204.8、409.6、1024ng/mL系列标准溶液，按照(2)色谱条件测定；
(7)结果分析：采用保留时间进行定性分析，外标法进行定量分析。
取双酚A标准溶液、样品供试液按照(2)色谱条件测定，双酚A标准品与供试品高效液相色谱比较图(见图3)，知供试品中双酚A与双酚A标准品保留时间基本一致。
血液透析器供试样品双酚A定量分析，取供试样品3份按照(3)(4)(5)步骤操作，根据外标法由线性回归方程计算，测得供试品中双酚A残留总量为双酚A残留量为808.75ng/套-863.96ng/套。
方法验证
(1)专属性：量取100mL空白循环液旋蒸至干，精密移取2.00mL甲醇溶解旋蒸残渣，0.45μm滤膜过滤，得空白供试液，按照(2)色谱条件测定，空白高效液相色谱图见图4。结合供试品定性分析，双酚A色谱峰峰形良好且与邻近色谱峰分离度均大于1.5,空白溶剂对双酚A测定均无干扰，表明本技术方法满足分析要求。
(2)标准工作溶液线性
取浓度为51.2、102.4、204.8、409.6、1024ng/mL系列标准溶液，按照(2)色谱条件测定，以双酚A浓度(ng/mL)为横坐标，以双酚A色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程(见表4)。
表4双酚A标准溶液——峰面积数据表
标准溶液浓度(ng/mL)
51.2
102.4
204.8
409.6
1024
峰面积
2.7
6.1
12.3
25.7
66.1
线性回归方程y＝0.0652x-0.7942，相关系数r＝0.9999,双酚A在51.2-1024ng/mL范围内线性良好。
(3)精密度(重复性)：取浓度为51.2、204.8、1024ng/mL双酚A标准溶液，按照(2)色谱条件测定，连续进6次，测定其峰面积(见表5)。对标准品溶液平行6次测定结果，相对标准偏差为0.64％-2.99％，表明本法标准品测定精密度良好。同时，由6.9回收率试验对双酚A进行低、中、高3个水平回收率精密度测定，每个加标水平平行测定3次，相对标准偏差为2.15％-3.37％，表明本方法测定样品精密度良好。
表5双酚A精密度试验结果(n＝6)
次数
1
2
3
4
5
6
平均峰面积
RSD％
峰面积(51.2ng/mL)
2.5
2.5
2.5
2.6
2.6
2.4
2.52
2.99
峰面积(204.8ng/mL)
11.8
11.7
11.7
11.8
11.9
11.8
11.78
0.64
峰面积(1024ng/mL)
63.4
63.9
63.2
61.0
61.9
61.4
62.47
1.90
(4)回收率：以供试品液为基质，分别对双酚A进行低、中、高3个水平添加回收率和精密度的测定，每个加标水平平行测定3次，方法回收率和相对标准偏差(RSD)见表6。结果表明双酚A的平均回收率96.94％-113.44％,相对标准偏差为2.15％-3.37％，表明方法的准确度达到分析要求。
表6双酚A回收率和精密度结果(n＝3)
加标浓度(ng/套)
平均回收率(％),n＝3
RSD(％),n＝3
648
113.44
2.50
1228.8
107.42
2.15
2457.6
96.94
3.37
以上数据可确定，血液透析器供试样品中双酚A残留单体经甲醇加严模拟浸提后，双酚A采用C18液相色谱柱分离，高效液相-荧光检法测定，能够准确、灵敏、高效地测定血液透析器双酚A残留单体，说明本发明具有很大的优势。
实施例2
与实施例1的样品供试液、空白供试液的获取方式以及标准溶液的配制均相同，区别在于色谱检测条件不同：
色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5um；
激发波长230nm，发射波长310nm；
柱温：20℃；
进样量：5μL；
流动相：梯度洗脱如表7所示，缓冲溶液与实施例1相同。
表7梯度洗脱表
结果显示该方法也表现出：专属性好，特异性强，准确度高，精密度、线性良好，标准工作曲线相关系r均大于0.999，方法精密度相对标准方差RSD为0.84％-3.96％，低、中、高浓度平均回收率为94.92％-115.51％。
实施例3
与实施例1的样品供试液、空白供试液的获取方式以及标准溶液的配制均相同，区别在于色谱检测条件不同：
色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5um；
激发波长234nm，发射波长320nm；
柱温：25℃；
进样量：15μL；
流动相：梯度洗脱如表8所示，缓冲溶液与实施例1相同。
表8梯度洗脱表
结果显示该方法也表现出：专属性好，特异性强，准确度高，精密度、线性良好，标准工作曲线相关系r均大于0.999，方法精密度相对标准方差RSD为0.84％-4.02％，低、中、高浓度平均回收率为98.71％-118.22％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。