阅读说明：本技术 一种食品中环氧大豆油的快速测定方法 (Method for rapidly determining epoxidized soybean oil in food ) 是由 张建 彭小东 耿平兰 马义虔 李红洲 陈大鹏 张吉敏 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种食品中环氧大豆油的测定方法,先将食品经均质制样,采用反相液相色谱将环氧大豆油与其他组分分离,利用质谱仪分析标准品中环氧大豆油的主要组分,外标法定量计算食品中环氧大豆油的含量。本发明通过LC-MS/MS技术对食品中环氧大豆油进行准确的检测、分析,具有前处理简便、分析速度快、精密度高﹑准确度好等特点,能够高效快捷地检测食品中的环氧大豆油的含量。该方法前处理无需衍生化,简单、快捷,对于复杂的基质的抗干扰能力强,检测结果稳定、可靠；该方法为食品中环氧大豆油的检测提供了可行的方法,填补了国内食品中环氧大豆油检测方法的空白。(The invention discloses a method for measuring epoxidized soybean oil in food, which comprises the steps of homogenizing and sampling the food, separating the epoxidized soybean oil from other components by adopting reverse phase liquid chromatography, analyzing the main components of the epoxidized soybean oil in a standard product by utilizing a mass spectrometer, and quantitatively calculating the content of the epoxidized soybean oil in the food by an external standard method. The method disclosed by the invention can be used for accurately detecting and analyzing the epoxidized soybean oil in the food by an LC-MS/MS technology, has the characteristics of simple and convenient pretreatment, high analysis speed, high precision, good accuracy and the like, and can be used for efficiently and quickly detecting the content of the epoxidized soybean oil in the food. The method has the advantages that the pretreatment is simple and quick without derivatization, the anti-interference capability to a complex matrix is strong, and the detection result is stable and reliable; the method provides a feasible method for detecting the epoxidized soybean oil in the food, and fills the blank of the detection method of the epoxidized soybean oil in the domestic food.)

一种食品中环氧大豆油的快速测定方法

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，涉及一种食品中环氧大豆油的快速测定方法，具体是通过二氯甲烷或乙腈萃取，液相色谱-质谱/质谱仪LC-MS/MS检测分析，主要应用于食品中环氧大豆油的检测分析。

背景技术

环氧大豆油(Epoxidized soybean oil,ESBO)是由精炼大豆油采用过氧化处理而制得的一种混合甘油三酯化工产品。其具有良好的耐热性、耐光性，与聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)相容性好，且低毒稳定、生物可降解，是国际认可的食品包装材料的增塑剂和稳定剂，被广泛用于金属瓶盖的PVC密封圈和贴膜中。但又有研究发现ESBO对皮肤和眼睛有刺激性，有人怀疑其对动物肝、肾、睾丸和子宫会造成一定的影响。在食品的包装、灭菌和储藏过程中，若过量的ESBO迁移到食品中，就会对消费者的健康造成一定威胁。本发明人为我国食品检测机构提供高效、准确、具有普遍适用性的检测食品中环氧大豆油的方法，为我国食品企业的产品质量监管工作提供有力的技术支持，为广大消费者的“舌尖上”的安全提供技术保障，响应了国家加强对食品***的号召。同时，也为把控进出口产品的安全性提供有效的检测手段，消除我国国际贸易的技术壁垒。

在我国，ESBO一直被认为是一种绿色环保的增塑剂，我国国标GB9695-2008将其列为食品包装材料允许使用的添加剂，且没有规定使用限量。此物质早期在欧盟国家也被认为是安全的增塑剂，但1997年欧盟食品科学委员会规定ESBO的日耐受量为1mg/(kg.bw)。EU10/2011规定ESBO在普通食品中的特定迁移量为60mg/kg，婴儿食品中为30mg/kg。我国目前只有针对食品接触材料中的ESBO的检测方法标准，即出入境检验检疫行业标准SN/T 3549-2013。针对食品中的ESBO含量的检测，我国还尚未出台相关标准。食品安全问题已成为目前世界各国政府和消费者所广泛关注的共同焦点，一方面，为了保障消费者饮食健康安全，维护消费者权益；另一方面，为了提高我国在国际食品贸易中的竞争能力，促进经济发展。我国都亟需提高食品中ESBO检测技术水平，出台相关限量法规和检测方法标准，加强对食品中ESBO含量的监管工作。因此，针对食品中ESBO，建立准确、快速、简便和高效的检测方法有其必要性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食品中环氧大豆油的快速测定方法，该方法具有前处理简便、分析速度快、精密度高﹑准确度好等特点，能够高效快捷地检测食品中的环氧大豆油的含量。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的：

一种食品中环氧大豆油的测定方法，先将食品经均质制样，采用反相液相色谱将环氧大豆油与其他组分分离，利用质谱仪分析标准品中环氧大豆油的主要组分，外标法定量计算食品中环氧大豆油的含量；

具体包括以下步骤：

1)仪器准备：液相色谱-质谱/质谱仪LC-MS/MS；

2)将食品经均质制样，采用反相液相色谱将环氧大豆油与其他组分分离，利用质谱仪分析标准品中环氧大豆油的主要组分，待测定样品中环氧大豆油含量；

3)外标法定量计算样品中环氧大豆油的含量。

所述步骤1)中，仪器准备为调整各项参数至工作状态：碰撞气体为氮气；色谱柱为C₁₈色谱柱；柱温40℃。

所述步骤1)中，色谱柱为C₁₈色谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；进样量：5μL；流速：0.4mL/min；流动相A：50/850V/V，15mM乙酸/乙腈；流动相B：丙酮；

所述步骤1)中，质谱条件：质谱扫描模式为多反应离子监测MRM，离子化模式为电喷雾电离正离子模式ESI+，毛细管电压：5500V。

所述步骤2)中，环氧大豆油为甘油三脂混合体，经LC-MS检测，其主要由5种组分构成，分别为M₁，分子式C₅₇H₉₆O₁₃，占比14％，母离子m/z 1012，子离子m/z 699、349.4；M₂，分子式C₅₇H₉₈O₁₂，占比34％，母离子m/z 998，子离子m/z 685、335.6；M₃，分子式C₅₇H₁₀₀O₁₁，占比25％，母离子m/z 984，子离子m/z 671.0、335.0；M₄，分子式C₅₇H₁₀₂O₁₀，占比14％，母离子m/z971，子离子m/z 671.0、655.0；M₅，分子式C₅₇H₁₀₆O₈，占比13％，母离子m/z 943，子离子m/z630.0、335.0；环氧大豆油以这5种组分的总和进行定量分析；

其中：M₁为(LnLL)_OX和(LnLnO)_OX；

M₂为(LLL)_OX、(LnLO)_OX和(LnLnS)_OX；

M₃为(OLL)_OX、(LnOO)_OX和(LnLS)_OX；

M₄为(LOO)_OX、(LLS)_OX和(LnOS)_OX；

M₅为(SOO)_OX和(SSL)_OX；

Ln表示亚麻酸链，L表示亚油酸链；O表示油酸链；S表示硬脂酸链；ox表示环氧化。

所述的食品为白酒、油辣椒、动植物油脂、发酵酸食品。

本发明通过LC-MS/MS技术对食品中环氧大豆油进行准确的检测、分析，该方法前处理无需衍生化，简单、快捷，对于复杂的基质的抗干扰能力强，检测结果稳定、可靠；该方法为食品中环氧大豆油的检测提供了可行的方法，填补了国内食品中环氧大豆油检测方法的空白。

附图说明

图1为环氧大豆油中5种主要组分的色谱图(5μg/L)。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。

一种食品中环氧大豆油的测定方法，先将食品经均质制样，采用反相液相色谱将环氧大豆油与其他组分分离，利用质谱仪分析标准品中环氧大豆油的主要组分，外标法定量计算食品中环氧大豆油的含量；

更具体而言，包括以下步骤：

1)仪器准备：液相色谱-质谱/质谱仪LC-MS/MS；

2)将食品经均质制样，采用反相液相色谱将环氧大豆油与其他组分分离，利用质谱仪分析标准品中环氧大豆油的主要组分，待测定样品中环氧大豆油含量；

3)外标法定量计算样品中环氧大豆油的含量。

所述步骤1)中，仪器准备为调整各项参数至工作状态：碰撞气体为氮气；色谱柱为C₁₈色谱柱；柱温40℃。

所述步骤1)中，色谱柱为C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；进样量：5μL；流速：0.4mL/min；流动相：A：50/850(V/V)，15mM乙酸/乙腈，B：丙酮；

所述步骤1)中，质谱条件：质谱扫描模式为多反应离子监测(MRM)，离子化模式为电喷雾电离正离子模式(ESI+)，毛细管电压：5500V。

所述步骤2)中，环氧大豆油为甘油三脂混合体，经LC-MS/MS检测，发现其主要由5种组分构成，见表1，色谱图见图1；本方法以这5种组分作为环氧大豆油的定量组分。

表1环氧大豆油5种主要组分

组分	母离子(m/z)	分子式	各组分占比(％)
				M1	1012	C<sub>57</sub>H<sub>96</sub>O<sub>13</sub>	14
M2	998	C<sub>57</sub>H<sub>98</sub>O<sub>12</sub>	34
				M3	984	C<sub>57</sub>H<sub>100</sub>O<sub>11</sub>	25
M4	971	C<sub>57</sub>H<sub>102</sub>O<sub>10</sub>	14
				M5	943	C<sub>57</sub>H<sub>106</sub>O<sub>8</sub>	13

所述食品为白酒、动植物油脂、油辣椒、发酵酸食品。

实施例一：

1、仪器及试剂

QTRAP 5500液相色谱串联质谱(配电喷雾离子源ESI，美国AB SCIEX公司)；电子天平(精度0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司)；混匀振荡器(Heidolph公司)；环氧大豆油(纯度＞99.5％，麦克林公司)，乙腈(色谱纯，默克公司)2、标准工作液配制

标准储备液：精确称取适量的环氧大豆油标准品，色谱乙腈定容，配成浓度为1.0mg/mL的环氧大豆油的标准储备液，于4℃冰箱中保存，有效期6个月；

标准工作液：以52％乙醇-水溶液(v/v)为基质，配制质量浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0，20.0、50.0ng/mL环氧大豆油标准工作液。

3、仪器分析条件

(1)液相条件

色谱柱：C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)或采用同效果色谱柱；柱温：35℃；流动相：A：50/850(v/v)，15mM乙酸/乙腈，B：丙酮；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；具体洗脱程序见表1；

表1流动相梯度洗脱程序

时间(min)	A(％)	B(％)
			0.0	95	5
1	95	5
			3	70	30
4	70	30
			5	95	5
6	95	5

(2)质谱条件

离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI⁺)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；其他参考质谱条件参见表2：

表2环氧大豆油的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压

4、样品前处理

准确称取白酒样品2.00g(精确至0.01g)，色谱乙腈定容至10mL，涡旋混匀1min，静置1min，过0.22μm有机滤膜至色谱小瓶中，上机分析。

5、含量计算

1)样品中环氧大豆油各组分的含量按下式计算：

式中：X_i——试样中环氧大豆油各组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；C——从标准曲线求得待测溶液中环氧大豆油各组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/mL)；C₀——从标准曲线求得空白溶液中环氧大豆油各组分的含量，单位纳克每毫升(ng/mL)；V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；M——样品质量，单位为克(g)；D——试样的稀释倍数；

2)样品中环氧大豆油含量按下式计算：

X＝M₁×f₁+M₂×f₂+M₃×f₃+M₄×f₄+M₅×f₅

式中：X——试样中环氧大豆油的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；M₁、M₂、M₃、M₄、M₅——环氧大豆油中5种主要组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；f₁、f₂、f₃、f₄、f₅——环氧大豆油中5种主要组分换算系数，由环氧大豆油标液测试结果得出5种组分与所有峰峰面积总和的比值；

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，结果保留三位有效数字。

6、精密度测定

将浓度为5.0μg/mL标准溶液重复进样测试6次，作为方法精确度及重复性评估，结果如下：

表3环氧大豆油标准溶液的精密度测定结果

由表3可以看出环氧大豆油的5种主要组分RSD均小于10％，表明方法精密度良好。

7、检出限、定量限及线性范围：

根据GB/T 27417-2017中5.4.2.2的方法，通过往空白样品中添加几个不同浓度水平的标液，在每个水平分别随机检测10次，记录检出结果(阳性或阴性)，以3倍检出限作为方法定量限，结果见表4：

表4检出限、定量限(白酒)

由表4可知环氧大豆油在白酒中的方法检出限为5.0μg/kg，定量限为15.0μg/kg。

表5环氧大豆油标准工作液曲线方程(以52％的乙醇为基质)

组分	曲线方程(Y)	相关系数(r)
			M1	Y＝2.73e+004X+1.65e+004	0.9993
M2	Y＝1.09e+005X+1.04e+005	0.9982
			M3	Y＝6.64e+004X+6.43e+004	0.9976
M4	Y＝4.59e+004X+4.23e+004	0.9961
			M5	Y＝4.80e+004X+4.01e+004	0.9984

由表5可知，环氧大豆油在0ng/mL～50ng/mL范围内(以52％的乙醇为基质加标配制的曲线)，线性良好，相关系数r>0.996。

8、加标回收率

选用白酒进行加标实验，分别称取3组样品，每组3个平行样，进行加标实验，取样量均为2.00g，各样品标准品添加量为：①组：白酒加标量为42.5μg/kg；②组：白酒加标量为62.5μg/kg；③组：白酒加标量为125.0μg/kg。

按上述测定方法进行测定，计算加标回收率(％)及RSD，结果见表6。

表6环氧大豆油回收率(白酒)

由表6可知，白酒的加标回收率均在80％～110％之间，表明该方法和仪器均有较好的准确性，可以满足测试的要求。

根据上述液相色谱串联质谱测定方法，选择一种白酒样品，测得其中环氧大豆油为0μg/kg。

实施例二：

1、仪器及试剂

QTRAP 5500液相色谱串联质谱(配电喷雾离子源ESI，美国AB SCIEX公司)；电子天平(精度0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司)；混匀振荡器(Heidolph公司)。环氧大豆油(纯度＞99.5％，麦克林公司)，乙腈(色谱纯，默克公司)2、标准工作液配制：

标准储备液：精确称取适量的环氧大豆油标准品，色谱乙腈定容，配成浓度为1.0mg/mL的环氧大豆油的标准储备液，于4℃冰箱中保存，有效期6个月；

标准工作液：以橄榄油为基质，配制质量浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0，20.0、50.0μg/mL环氧大豆油标准工作液。

3、仪器分析条件

(1)液相条件：

色谱柱：C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)或采用同效果色谱柱；柱温：35℃；流动相：A：50/850(v/v)，15mM乙酸/乙腈，B：丙酮；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；具体洗脱程序见表1；

表1流动相梯度洗脱程序(油辣椒)

时间(min)	A(％)	B(％)
			0.0	95	5
3	95	5
			11	90	10
14	90	10
			15	12	88
25	12	88
			26	95	5
30	95	5

(2)质谱条件

离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI⁺)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；其他参考质谱条件参见表2：

表2环氧大豆油的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压

4、样品前处理

准确称取均质好的样品2.00g(精确至0.01g)，准确加入10mL色谱纯二氯甲烷，涡旋混匀1min，于3000r/min的离心机中离心5min，吸取上清液，过0.22μm有机滤膜至色谱小瓶中，上机分析。

5、含量计算

1)样品中环氧大豆油各组分的含量按下式计算：

式中：X_i——试样中环氧大豆油各组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；C——从标准曲线求得待测溶液中环氧大豆油各组分的含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；C₀——从标准曲线求得空白溶液中环氧大豆油各组分的含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；M——样品质量，单位为克(g)；D——试样的稀释倍数；

2)样品中环氧大豆油含量按下式计算：

X＝M₁×f₁+M₂×f₂+M₃×f₃+M₄×f₄+M₅×f₅

式中：X——试样中环氧大豆油的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；M₁、M₂、M₃、M₄、M₅——环氧大豆油中5种主要组分含量，单位为克每千克(mg/kg)；f₁、f₂、f₃、f₄、f₅——环氧大豆油中5种主要组分换算系数，由环氧大豆油标液测试结果得出5种组分与所有峰峰面积总和的比值；

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，结果保留三位有效数字。

6、精密度测定

称取3份鸡丝油辣椒样品(已均质)，按照测定方法进行测定，做方法精确度及重复性评估，结果如下：

表3油辣椒样品中环氧大豆油精密度的测定结果

由表3可以看出环氧大豆油的5种主要组分的RSD均小于10％，表明仪器精密度良好。

7、检出限、定量限及线性范围：

根据GB/T 27417-2017中5.4.2.2的方法，通过往空白样品中添加几个不同浓度水平的标液，在每个水平分别随机检测10次，记录检出结果(阳性或阴性)，以3倍检出限作为方法定量限，结果见表4：

表4检出限、定量限(油辣椒)

由表4可知环氧大豆油在油辣椒食品中的检出限为5.0mg/kg，定量限为15.0mg/kg。

表5环氧大豆油标准工作液曲线方程(以橄榄油为基质)

组分	曲线方程(Y)	相关系数(r)
			M1	Y＝2.83e+005X-1.42e+005	0.9992
M2	Y＝6.32e+005X+1.18e+006	0.9960
			M3	Y＝4.86e+005X+4.65e+005	0.9998
M4	Y＝1.15e+005X+1.59e+006	0.9996
			M5	Y＝2.55e+005X+4.97e+005	0.9997

由表5可知，环氧大豆油在0μg/mL～50g/mL范围内，线性良好，相关系数r>0.996；

8、加标回收率

选用油辣椒进行加标实验，分别称取3组样品，每组3个平行样，进行加标实验，取样量均为2.00g，各样品标准品添加量为：①组：植物油样品为25mg/kg；②组：植物油样品为50mg/kg；③组：植物油样品为100mg/kg。

按上述测定方法进行测定，计算加标回收率(％)及RSD，结果见表6。

表6环氧大豆油回收率(油辣椒)

由表6可知，油辣椒的加标回收率均在80％～110％之间，表明该方法和仪器均有较好的准确性，可以满足测试的要求。

根据上述液相色谱串联质谱测定方法，选择一种油辣椒样品，测得其中环氧大豆油为23.5mg/kg。

实施例三：

根据实施例二所述的测定方法，选择一种动植物油样品，测得其中环氧大豆油为7.2mg/kg。

实施例四：

根据实施例二所述的测定方法，选择一种发酵酸食品样品，测得其中环氧大豆油为0mg/kg。

最后说明的是，以上实施例仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。