阅读说明：本技术 一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测方法 (Gas chromatography-tandem mass spectrometry detection method for clotrimazole residues in animal-derived food ) 是由 韩超 胡贝贞 叶明立 沈燕 付长春 魏云潇 王婷婷 于 2019-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测方法。该方法为动物肌肉、脂肪和内脏样品中克霉唑残留使用环己烷/乙酸乙酯混合溶剂加速溶剂萃取、提取液经凝胶渗透色谱净化后采用气相色谱-串联质谱多反应监测模式下进行检测,同位素内标法定量。在优化的条件下,克霉唑在1.0～100μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.9995,方法定量限为1.0μg/kg。方法平均回收率为76.5％～107.4％,相对标准偏差不大于6.2％。本方法提取效率高、净化效果好、灵敏度高、重复性好,可用于动物肌肉、脂肪和内脏中克霉唑残留量的测定。(The invention discloses a gas chromatography-tandem mass spectrometry detection method for clotrimazole residues in animal-derived food. The method comprises the steps of using a cyclohexane/ethyl acetate mixed solvent to accelerate solvent extraction of clotrimazole residues in animal muscle, fat and viscera samples, purifying an extracting solution through gel permeation chromatography, detecting in a gas chromatography-tandem mass spectrometry multi-reaction monitoring mode, and quantifying by an isotope internal standard method. Under the optimized condition, the clotrimazole has good linear relation in the range of 1.0-100 mug/L, the correlation coefficient is 0.9995, and the quantitative limit of the method is 1.0 mug/kg. The average recovery rate of the method is 76.5-107.4%, and the relative standard deviation is not more than 6.2%. The method has the advantages of high extraction efficiency, good purification effect, high sensitivity and good repeatability, and can be used for measuring the residual quantity of clotrimazole in animal muscles, fat and viscera.)

一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测 方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，涉及加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化-气相色谱-串联质谱法，具体是指一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测方法。

背景技术

克霉唑是一种咪唑类抗真菌药，有研究显示，因在动物饲养过程中使用克霉唑作为抗真菌药物，会造成部分动物肌肉、脂肪或内脏中残留克霉唑。然而我国现行的农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对包括克霉唑在内的此类抗真菌的使用限量未作出规定，已发布的法规和检测标准也未涉及到克霉唑。最新颁布的GB 2763.1-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对包括克霉唑在内的此类抗真菌的使用限量也未作出规定。近年来有关克霉唑的检测方法研究主要集中集中在药品中克霉唑含量的测定、人体血浆和生物样本中残留量的测定、环境水体及污泥中残留量的测定。以上文献主要采用液相色谱-荧光检测器、液相色谱-串联质谱、气相色谱等仪器测定克霉唑，前处理主要有分散固相萃取、超声波提取、固相萃取、分散液相微萃取、液液萃取。

与植物源食品相比，动物源食品基质存在更复杂、脂肪含量高等问题，分析其中的药物残留对样品提取、净化和检测提出更高要求。

加速溶剂萃取法(Accelerated solvent extraction)是目前固体、半固体基质样品的主要前处理方式，它与索氏提取法(Soxhlet extraction)相比具有快速、溶剂使用量少、自动化程度高、重现性好、提取效率高、更安全的特点。

动物源食品基质复杂，脂肪含量高，在分析其中药物残留含量时，常受到杂质干扰，特别是一些大分子物质。本发明中引入凝胶渗透色谱净化方法(Gel PermeationChromatography,GPC净化)，以去除中动物源食品中所含的大分子杂质和脂肪类成份，既可降低大分子杂质和脂肪对分析物的色谱干扰，也可避免其在色谱进样口和柱头的沉积，保护了色谱系统。

目前的检测方法，通过液相色谱和气相色谱，只能通过保留时间、响应峰面积进行定性定量，缺少实质性判定依据。即使经过了高效的净化富集，动物源食品中克霉唑的含量通常还是很低，因此后续分析也需要高效灵敏通用性强的分离和检测手段。集色谱超强分离能力和质谱高灵敏度与高特异分辨能力于一体的色谱-质谱联用技术无疑是理想的选择，气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)技术具有其他检测方法无可企及的显著优势：高灵敏度、高选择性和高特异性，不仅可对已知物质进行精确定量和确证，还可对未知化合物进行高效定性识别和结构解析。

发明内容

本发明提供一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测方法，该方法结合加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化-气相色谱-串联质谱法，能够对动物源食品中克霉唑进行测定，该方法具有前处理简单快速、抗基质干扰强、确证准确、灵敏度高的优点，为动物源食品中克霉唑的快速、准确检测提供了可靠的分析方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供的一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测方法，包括以下步骤：

步骤(1)：动物肌肉、脂肪和内脏样品的提取：称取3.0g样品并转移至陶瓷研钵中，加入60μL、浓度为1.0μg/mL的d5-克霉唑标准溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，转移研磨好的样品于10mL的萃取池中，进行加速溶剂萃取，萃取条件为：萃取溶剂为环己烷和乙酸乙酯，体积比为1:1，萃取温度100℃，加热并静态萃取5min，对萃取池体积30％的萃取溶剂进行氮气吹扫60s后得到萃取液。将萃取液转移至50mL圆底烧瓶中，在35℃水浴中，通过旋转蒸发仪浓缩至小于3mL，转移剩余液体至10mL刻度离心管中，补加体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待净化液，备用。

步骤(2)：样品的净化：凝胶渗透色谱条件如下：

净化柱：500mm×10mm，填装10g Bio Beads-X3填料，柱床高32cm；

流动相：体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯，流速为1.0mL/min；

样品定量环为1mL；预淋洗体积为17mL；洗脱体积为15mL；清洗体积为5mL。

取步骤(1)中制备的待净化液1mL通过凝胶渗透仪按上述条件净化，收集洗脱液于刻度离心管中。将收集到的洗脱液于45℃的水浴中氮气吹至近干，取0.2mL正己烷饱和的乙腈涡旋振荡溶解残余物，再加入0.5mL正己烷饱和的乙腈，涡旋振荡并静置分层，吸出乙腈层于2mL进样小瓶中，向刻度离心管中重复加入0.5mL正己烷饱和的乙腈操作一次，合并乙腈层，过0.22μm滤膜于气相色谱-串联质谱仪的进样小瓶中，制得待测样品溶液，供气相色谱-串联质谱测定。

步骤(3)：标准曲线的配制：取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑标准储备液；取d5-克霉唑标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mLd5-克霉唑标准储备液；各取100μg/mL的克霉唑和d5-克霉唑标准储备液0.1mL，分别用乙腈稀释定容至10mL，配制成1.0μg/mL的克霉唑和d5-克霉唑标准工作液。制作校准曲线用工作溶液的制备：各取1、2、5、20、50、100μL的1.0μg/mL克霉唑标准工作液，分别加入20μL的1.0μg/mLd5-克霉唑溶液，再各加入979、978、975、960、930、880μL乙腈，制得1、2、5、20、50、100μg/L的系列浓度标准曲线溶液，其中d5-克霉唑同位素内标溶液浓度均为20μg/L。

步骤(4)：待测样品溶液的检测：将步骤(2)中制备的待测样品溶液和步骤(3)中制备的标准曲线溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，根据标准曲线对定量离子进行内标法定量计算，获得待测样品溶液中克霉唑的浓度，继而获得动物源食品中克霉唑的含量。

进一步地，所述步骤(2)中净化方式中，待净化液采用凝胶渗透仪净化除去80％以上的脂肪和其他杂质，再采用液液萃取除去剩余的脂肪。

进一步地，步骤(4)中气相色谱-串联质谱的参数条件如下：

色谱柱：HP-5ms，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：

总运行时间17.33min；进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥99.999％，流量1.0mL/min；进样量口温度：240℃；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999％；离子源温度：300℃；质谱传输线温度：280℃；监测模式：多反应监测(MRM)，MRM离子对及电压如下表所示，表中*标记为定量离子对。

克霉唑和d5-克霉唑的多反应监测参数

本发明的有益效果是：本发明通过对动物源食品(动物肌肉、脂肪和内脏)样品的提取，并将提取液进行净化处理，最终浓缩、进样进行检测。第一步提取：先将样品用环己烷/乙酸乙酯(1:1,v/v)进行加速溶剂提取；第二步净化：将第一步提取液采用凝胶渗透仪净化除去大部分脂肪和其他杂质，再采用液液萃取除去剩余的脂肪，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中加速溶剂萃取快速、溶剂使用量少、自动化程度高、重现性好、提取效率高、更安全的特点；凝胶渗透色谱净化方法，以去除中动物源食品中所含的大分子杂质和脂肪类成份，既可降低大分子杂质和脂肪对分析物的色谱干扰，也可避免其在色谱进样口和柱头的沉积，保护了色谱系统。

其次，本发明对于动物源食品(动物肌肉、脂肪和内脏)中克霉唑残留量的定性定量检测分析是通过气相色谱-串联质谱仪分析。先配置一组阶梯形的标准曲线溶液，然后将标准曲线溶液和待检液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的质谱定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有克霉唑。另外，在质谱定量分析中，有两种方法分别是内标法和外标法。内标法是将一定量的同位素标记物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。外标法是用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。由于内标法是通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，其测定结果较为准确。而外标法虽然简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。由于气相色谱-串联质谱法一般都有基体效应的影响，采用外标法进行定量，结果不准确。本发明采用同位素d5标记克霉唑为内标物进行定量，克服了外标法定量不准确的问题。

附图说明

图1为本发明具体实施例中的克霉唑化学结构式；分子式为C₂₂H₁₇N₂Cl。

图2为20μg/L的克霉唑及d5-克霉唑标准溶液的提取离子对谱图(A:离子对278.2→243.2的谱图；B:离子对278.2→165.1的谱图；C:离子对283.1→248.2的谱图；D:离子对283.1→169.6的谱图)；

图3为本发明具体实施例中克霉唑及d5-克霉唑扫描离子对的二级质谱图(A:克霉唑；B:d5-克霉唑)；

图4为本发明具体实施例中标准工作曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。

本发明提供的一种动物源食品中克霉唑残留量的加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化-气相色谱-串联质谱检测方法，包括以下步骤。

步骤(一)样品的提取，如图1所示，为克霉唑化学分子式为C₂₂H₁₇N₂Cl：称取3.0g样品(动物肌肉、脂肪和内脏)并转移至陶瓷研钵中，加入1.0μg/mL d5-克霉唑标准溶液60μL，加入60目硅藻土5g并充分研磨，转移研磨好的样品于10mL的萃取池中，进行加速溶剂萃取，萃取条件为：萃取溶剂环己烷/乙酸乙酯(1:1,v/v)，萃取温度100℃，加热5min，静态萃取5min，对萃取池体积30％的提取溶剂氮气吹扫60s后得到萃取液。将萃取液转移至50mL圆底烧瓶中，在35℃水浴中，通过旋转蒸发仪减压浓缩至小于3mL，旋转蒸发仪的真空度为80-200mbar，转移剩余液体至10mL刻度离心管中，补加环己烷/乙酸乙酯(1:1,v/v)至3mL，制得待净化液，备用。

步骤(二)样品的净化：凝胶渗透色谱条件如下：净化柱：500mm×10mm，填装10gBio Beads-X3填料(中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体，排斥极限为相对分子质量400-14000)，柱床高32cm；流动相：环己烷/乙酸乙酯(1:1,v/v)，流速为1.0mL/min；样品定量环：1mL；预淋洗体积：17mL；洗脱体积：15mL；清洗体积：5mL。取步骤(一)中的待净化液1mL通过凝胶渗透仪按上述条件净化，收集洗脱液于刻度离心管中。将收集到的洗脱液于45℃的水浴中氮气吹至近干，此时脂肪含量高的样品在离心管底残留少量油脂，取0.2mL乙腈饱和的正己烷涡旋振荡溶解残余物，再加入0.5mL正己烷饱和的乙腈，涡旋振荡并静置分层，吸出乙腈层于2mL进样小瓶中，重复加入0.5mL正己烷饱和的乙腈操作一次，合并乙腈层，过0.22μm滤膜于仪器进样小瓶中，供GC-MS/MS测定。待净化液采用凝胶渗透仪净化可除去80％以上的脂肪和其他杂质，液液萃取可除去剩余的脂肪。

步骤(三)标准曲线的配制：取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制100μg/mL克霉唑标准储备液；取d5-克霉唑标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mLd5-克霉唑标准储备液，如图2所示，为20μg/L的克霉唑及d5-克霉唑标准溶液的提取离子对谱图，谱图背景干净，说明没有干扰，灵敏度高。各取100μg/mL的克霉唑和d5-克霉唑标准储备液0.1mL，分别用乙腈稀释定容至10mL，配制成1.0μg/mL克霉唑和d5-克霉唑标准工作液。制作校准曲线用工作溶液制备：各取1、2、5、20、50、100μL的1.0μg/mL克霉唑标准工作液，分别加入20μL的1.0μg/mLd5-克霉唑标准工作液，再各加入979、978、975、960、930、880μL乙腈，配成1、2、5、20、50、100μg/L的系列浓度标准曲线溶液，其中d5-克霉唑同位素内标溶液浓度均为20μg/L。如图3所示，为克霉唑及d5-克霉唑扫描离子对的二级质谱图(A:克霉唑；B:d5-克霉唑)，d5-克霉唑是在克霉唑结构式基础上，把苯环上的5个氢(H)用5个氘(D,氢的同位素)替代，故分子量增加5，在图谱上的质谱峰也相对应的分子量大5。

步骤(四)待测样品溶液的检测：将步骤(二)中的待测样品溶液和步骤(三)中的标准曲线溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，根据标准曲线对定量离子进行内标法定量计算，获得待测样品溶液中克霉唑的浓度，继而获得动物源食品中克霉唑的含量。

气相色谱-串联质谱的参数条件如下：

色谱柱：HP-5ms，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：

总运行时间17.33min；进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥99.999％，流量1.0mL/min；进样量口温度：240℃；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999％；离子源温度：300℃；质谱传输线温度：280℃；监测模式：多反应监测(MRM)，MRM离子对及电压如表1所示，表中*标记为定量离子对。

表1-克霉唑和d5-克霉唑的多反应监测参数

如图4所示，为本发明具体实施例中标准工作曲线，结果表明克霉唑在1.0～100μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9995，本方法定量限为1.0μg/kg，结果如表2。

表2-克霉唑的线性方程、相关系数、定量限

化合物	线性方程	相关系数	定量限μg/kg
				克霉唑	Y＝0.0189426+0.0474255X	0.9995	1.0

以10倍信噪比(S/N)计算该方法定量限(LOQ),克霉唑的定量限为1.0μg/kg，显示了该方法具有较高的灵敏度。

在空白样品中分别添加浓度为1.0、5.0、10.0μg/kg3个水平的克霉唑，平行测定6次，回收率与相对标准偏差(RSD)结果列于表3。由表3可知，方法平均回收率为76.5％～107.4％，相对标准偏差不大于6.2％，该方法显示了较好的回收率和精密度。本方法提取效率高、净化效果好、灵敏度高、重复性好，可用于动物肌肉、脂肪和内脏中克霉唑残留量的测定。

表3-克霉唑的添加回收率、精密度及定量限(n＝6)

本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。