阅读说明：本技术 一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法及其检测方法 (Sample pretreatment method for determining residual quantity of various pesticides in dendrobium officinale and detection method thereof ) 是由 许振岚 李灵香玉 徐明飞 吴声敢 汤涛 张春荣 赵学平 于 2019-12-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法及其检测方法,属于分析化学技术领域。本发明提供的测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法,包括如下步骤：将铁皮石斛样品匀浆处理后,与乙腈-水溶液混合,进行提取,得到铁皮石斛提取液；将所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管混合后,依次经涡旋和离心,然后取上清液作为待测液,完成样品前处理。本发明以石墨化多壁碳纳米管为吸附剂,能够有效去除复杂基质铁皮石斛样品中的杂质,且对具有平面结构的农药吸附少,能够保证多种农药残留量测试结果的准确性。此外,本发明所提供的样品前处理方法操作简单,易于实施。(The invention provides a sample pretreatment method for measuring the residual quantity of various pesticides in dendrobium officinale and a detection method thereof, belonging to the technical field of analytical chemistry. The invention provides a sample pretreatment method for determining various pesticide residues in dendrobium officinale, which comprises the following steps: homogenizing a dendrobium officinale sample, mixing the homogenate with an acetonitrile-water solution, and extracting to obtain a dendrobium officinale extracting solution; and mixing the dendrobium officinale extracting solution with the graphitized multi-walled carbon nano tube, sequentially performing vortex and centrifugation, taking the supernatant as a solution to be detected, and finishing the pretreatment of the sample. The method takes the graphitized multi-walled carbon nanotube as the adsorbent, can effectively remove impurities in the dendrobium officinale sample with a complex matrix, has less adsorption on pesticides with a planar structure, and can ensure the accuracy of test results of various pesticide residues. In addition, the sample pretreatment method provided by the invention is simple to operate and easy to implement.)

一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法及其 检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法及其检测方法。

背景技术

铁皮石斛的人工种植过程中遇到病虫害时常需要施用农药，且农药多残留现象严重，因此，急需建立一个高效且高通量的方法来检测铁皮石斛中的农药残留量，从而确保人工种植铁皮石斛的品质。铁皮石斛是一种复杂基质，富含色素、氨基酸及多糖等物质。建立高通量、有机溶剂使用量少的农药多残留量检测方法，关键在于除去铁皮石斛中色素等杂质，消除其对检测的干扰。

传统的基质分散固相萃取方法具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全等特点，被广泛应用于农药多残留的检测。该方法多使用多种吸附剂的组合来达到除杂的目的。经典常用的吸附剂是PSA(primary secondary amine，乙二胺-N-丙基硅烷)、C18和GCB(graphitized carbonblack，石墨化碳)。其中，GCB对于色素等杂质具有很好的去除效果，但是它对具有平面结构的农药具有较强的吸附作用，从而降低这些农药的回收率，因此限制了其使用。同时，对于色素等杂质含量较高的铁皮石斛，传统的基质分散固相萃取方法存在着吸附剂用量过大、除杂效果不理想等问题，因此在处理铁皮石斛时存在很大的局限性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法及其检测方法，本发明仅用一种吸附剂即可实现对复杂基质铁皮石斛的前处理，且除杂效果好，对具有平面结构的农药吸附少。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法，包括如下步骤：

将铁皮石斛样品匀浆处理后，与乙腈-水溶液混合，进行提取，得到铁皮石斛提取液；

将所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管混合后，依次经涡旋和离心，然后取上清液作为待测液，完成样品前处理。

优选地，所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为1.8～2.2:1。

优选地，所述铁皮石斛样品与乙腈-水溶液的用量比为2g:13～17mL。

优选地，所述提取包括如下步骤：

将待提取液进行第一震荡处理后，加入盐，进行第二震荡处理，然后经离心，取上清液作为铁皮石斛提取液；所述待提取液为铁皮石斛样品匀浆处理后的产品与乙腈-水溶液的混合物。

优选地，所述第一震荡处理和第二震荡处理在室温进行；所述第一震荡处理的转速为3000～5000rpm，时间为8～12min；所述第二震荡处理的转速为3000～5000rpm，时间为4～6min。

优选地，所述盐包括无水硫酸镁和氯化钠，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比为3.8～4.2:1。

优选地，所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管的用量比为1.2mL:4～18mg。

优选地，所述铁皮石斛样品为铁皮石斛的茎时，所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管的用量比为1.2mL:4～6mg；所述铁皮石斛样品为铁皮石斛的叶时，所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管的用量比为1.2mL:13～18mg。

优选地，所述涡旋在室温进行；所述涡旋的转速为4000～6000rpm，时间为0.8～1.2min；所述离心的转速为4500～5500rpm，时间为8～12min。

本发明还提供了一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的方法，包括如下步骤：

按照上述技术方案所述的样品前处理方法对铁皮石斛样品进行处理，得到待测液；

将所述待测液进行高效液相色谱-质谱分析，得到谱图；

其中，高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Luna Omega C18 LC柱，柱内径为2.1mm，柱长为100mm，填料粒径为1.6μm；

柱温：38～42℃；

流动相：流动相A为质量浓度为0.2％甲酸水溶液，其中含有2mM的乙酸铵；流动相B为质量浓度为0.2％甲酸甲醇溶液，其中含有2mM的乙酸铵；

洗脱程序如表1所示：

表1洗脱程序

时间/min	流动相A(v％)	流动相B(v％)
			0.50	90	10
5.00	50	50
			10.00	30	70
15.00	10	90
			20.00	10	90
20.10	90	10
			22.00	90	10

质谱的条件为：电喷雾电离，多反应监测模式，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为800L/h；

根据所述谱图，计算得到多种农药残留量。

本发明提供了一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法，包括如下步骤：将铁皮石斛样品匀浆处理后，与乙腈-水溶液混合，进行提取，得到铁皮石斛提取液；将所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管混合后，依次经涡旋和离心，然后取上清液作为待测液，完成样品前处理。本发明以石墨化多壁碳纳米管为吸附剂，能够有效去除复杂基质铁皮石斛样品中的杂质，且对具有平面结构的农药吸附少，能够保证多种农药残留量测试结果的准确性。此外，本发明所提供的样品前处理方法操作简单，易于实施。

具体实施方式

本发明提供了一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法，包括如下步骤：

将铁皮石斛样品匀浆处理后，与乙腈-水溶液混合，进行提取，得到铁皮石斛提取液；

将所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管(即在高温碳化炉中经碳化后的多壁碳纳米管)混合后，依次经涡旋和离心，然后取上清液作为待测液，完成样品前处理。

本发明将铁皮石斛样品匀浆处理后，与乙腈-水溶液混合，进行提取，得到铁皮石斛提取液。

在本发明中，所述铁皮石斛样品优选为铁皮石斛的茎和/或叶。

本发明对所述匀浆处理的条件没有特殊限定，按照常规的匀浆处理方式进行匀浆处理即可；所述匀浆处理有利于将铁皮石斛样品中的多种农药提取完全。

在本发明中，所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比优选为1.8～2.2:1，更优选为2:1。在本发明中，上述比例的乙腈-水溶液有利于提取不同极性的农药，使该前处理方法更适合于多种农药残留的提取。

在本发明中，所述铁皮石斛样品与乙腈-水溶液的用量比优选为2g:13～17mL，更优选为2g:15mL。

在本发明中，所述提取优选包括如下步骤：

将待提取液进行第一震荡处理后，加入盐，进行第二震荡处理，然后经离心，取上清液作为铁皮石斛提取液；所述待提取液为铁皮石斛样品匀浆处理后的产品与乙腈-水溶液的混合物。

在本发明中，先进行第一震荡处理有利于将待提取液与乙腈-水溶液充分混合均匀，以利于多种农药残留的提取；盐起到除水和盐析的作用，有利于农药进入乙腈有机相，得到乙腈相提取液，即所得铁皮石斛提取液为农药的乙腈溶液。

在本发明中，所述第一震荡处理和第二震荡处理优选在室温进行；所述第一震荡处理的转速优选为3000～5000rpm，更优选为5000rpm；时间优选为8～12min，更优选为10min；所述第二震荡处理的转速优选为3000～5000rpm，更优选为5000rpm；时间优选为4～6min，更优选为5min。

在本发明中，所述盐优选包括无水硫酸镁和氯化钠；所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比优选为3.8～4.2:1，更优选为4:1；所述乙腈-水溶液和盐的用量比优选为1.8～2.2mL:1g，更优选为2mL:1g。

在本发明中，所述提取的过程中，离心的转速优选为3500～4500rpm，更优选为4000rpm，时间优选为8～12min，更优选为10min。

得到铁皮石斛提取液后，本发明将所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管混合后，依次经涡旋和离心，然后取上清液作为待测液，完成样品前处理。

本发明对所述石墨化多壁碳纳米管的来源没有特殊限定，采用市售石墨化多壁碳纳米管即可。在本发明实施例中，所述石墨化多壁碳纳米管优选购买自南京先丰材料科技有限公司，管径为10～20nm。

在本发明中，所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管的用量比优选为1.2mL:4～18mg；所述铁皮石斛样品为铁皮石斛的茎时，所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管的用量比优选为1.2mL:4～6mg；所述铁皮石斛样品为铁皮石斛的叶时，所述铁皮石斛提取液与石墨化多壁碳纳米管的用量比优选为1.2mL:13～18mg；当所述铁皮石斛样品为铁皮石斛的茎和叶的混合物时，则全部按照铁皮石斛样品为叶进行前处理。

在本发明中，所述涡旋优选在室温进行；所述涡旋的转速优选为4000～6000rpm，更优选为5000rpm，时间优选为0.8～1.2min，更优选为1min；所述离心的转速优选为4500～5500rpm，更优选为5000rpm，时间优选为8～12min，更优选为10min。

离心后，本发明优选将所得上清液经微孔滤膜过滤，得到待测液；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm。

在本发明中，所述样品前处理方法适用于测定铁皮石斛样品中的76种农药的残留量，所述76种农药优选为甲胺磷、多菌灵、敌百虫、抗蚜威、吡虫啉、乐果、啶虫脒、磷胺、敌敌畏、嘧霉胺、抑霉唑、克百威、甲萘威、氯吡脲、溴氰虫酰胺、异丙威、嘧菌环胺、多效唑、甲硫威、咪鲜胺、乙霉威、螺虫乙酯、亚胺硫磷、苯线磷、腈菌唑、灭线磷、嘧菌酯、***酮、环酰菌胺、啶酰菌胺、戊唑醇、四氟醚唑、双炔酰菌胺、戊菌唑、氟菌唑、氟吡菌酰胺、异菌脲、马拉硫磷、***磷、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯唑磷、苯醚甲环唑、嘧菌酯、杀铃脲、啶氧菌酯、二嗪磷、四螨嗪、吡唑醚菌酯、喹氧灵、伏杀硫磷、辛硫磷、丙溴磷、环氟菌胺、肟菌酯、胺菊酯、噻螨酮、毒死蜱、乙螨唑、哒螨灵、螺螨酯、3-羟基克百威、噻虫胺、三环唑、噻唑磷、稻瘟灵、氟酰胺、环丙唑醇、氟环唑、氟硅唑、己唑醇、丙环唑、噻嗪酮、联苯菊酯。

本发明还提供了一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的方法，包括如下步骤：

按照上述技术方案所述的样品前处理方法对铁皮石斛样品进行处理，得到待测液；

将所述待测液进行高效液相色谱-质谱分析，得到谱图；

其中，高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Luna Omega C18 LC柱，柱内径为2.1mm，柱长为100mm，填料粒径为1.6μm；

柱温：38～42℃；

流动相：流动相A为质量浓度为0.2％甲酸水溶液，其中含有2mM(即mmol/L)的乙酸铵；流动相B为质量浓度为0.2％甲酸甲醇溶液，其中含有2mM的乙酸铵；

洗脱程序如表1所示：

表1洗脱程序

时间/min	流动相A(v％)	流动相B(v％)
			0.50	90	10
5.00	50	50
			10.00	30	70
15.00	10	90
			20.00	10	90
20.10	90	10
			22.00	90	10

质谱的条件为：电喷雾电离，多反应监测模式，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为800L/h；

根据所述谱图，计算得到多种农药残留量。

在本发明中，所述柱温优选为40℃。

在本发明中，所述流动相的流速优选为0.2mL/min；进样量优选为5μL。

在本发明中，所述质谱的条件中，76种农药的质谱参数如表2所示，

表2 76种农药的质谱条件

本发明对所述多种农药残留量的计算方法没有特殊限定，本领域技术人员可以按照常规的方法计算，如外标法、内标法，在本发明实施例中，所述计算的方法优选为外标法，更优选为标准曲线法，所述标准曲线优选采用基质标准曲线。

本发明所提供的样品前处理方法处理得到的待测液可测定铁皮石斛样品中的76种农药残留，且其中72种农药残留的测试结果准确性均较高。

下面结合实施例对本发明提供的一种测定铁皮石斛中多种农药残留量的样品前处理方法及其检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

线性相关性验证：

在2～200ppb浓度范围内验证各农药的线性相关性，具体方法如下：

以不含农药残留的铁皮石斛的鲜茎为原料，按照如下方法配制基质标准液：

先将铁皮石斛鲜茎匀浆处理后，取2g匀浆处理的产物与15mL乙腈-水溶液(乙腈和水的体积比为2:1)混合，在5000rpm下室温震荡10min，然后加入6g无水硫酸镁和1.5g氯化钠，在5000rpm下室温继续震荡5min，然后在4000rpm的转速下离心10min，将上清液取出，作为提取液；

取1.2mL提取液，与5mg石墨化多壁碳纳米管混合，在5000rpm转速下涡旋1min，然后在5000rpm的转速下离心10min，将上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，得到基质标准液用溶剂；

使用基质标准液用溶剂配制浓度为2、5、20、50、100和200ppb的不同农药的基质标准液，在以下条件下进行高效液相色谱-质谱分析，并记录峰面积，以拟合鲜茎线性基质标准曲线，得到相关性系数(R²)，结果如表3所示，

其中高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Luna Omega C18 LC柱，柱内径为2.1mm，柱长为100mm，填料粒径为1.6μm；

柱温：40℃；

流动相：流动相A为质量浓度为0.2％甲酸水溶液，其中含有2mM的乙酸铵；流动相B为质量浓度为0.2％甲酸甲醇溶液，其中含有2mM的乙酸铵；流动相流速0.2mL/min；

进样量：5μL；

洗脱程序如前述表1所示；

质谱的条件为：电喷雾电离，多反应监测模式，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为800L/h；各农药的质谱条件如前述表2所示。

按照上述方法，以不含农药的铁皮石斛鲜叶为原料，配制基质标准液，并进行高效液相色谱-质谱分析，以拟合鲜叶线性基质标准曲线，不同之处仅在于，石墨化多壁碳纳米管的用量为15mg。结果如表3所示。由表3的结果可知本发明所提供的测定方法测试76种农药时，线性关系良好，R²均大于0.99。

实施例2

基质效应的检测：

以乙腈为溶剂，配制浓度为2、5、20、50、100和200ppb的不同农药的标准液，并按照实施例1中的分析方法进行高效液相色谱-质谱分析，并拟合线性溶剂标准曲线，将实施例1所得线性基质标准曲线的斜率除以线性溶剂标准曲线的斜率，得到基质效应(ME)，结果如表3所示。

由表3可知，基质效应(ME)值在0.8～1.2之间视为无基质效应。当ME大于1.2，视为基质增强效应。当ME小于0.8，视为基质抑制效应。由表3可知鲜茎中基质效应在80～120％的有66种农药。鲜叶中基质效应在80～120％的有64种农药，说明本发明所提供的方法对于大多数农药都无基质效应，适用于大多数农药的检测。

表3铁皮石斛鲜茎和鲜叶的基质标准曲线的相关性系数和基质效应

实施例3

准确性和精确性测定：

在两个不同的加标浓度(0.02mg/kg和0.2mg/kg)下检测76种目标化合物的回收率值，每个浓度重复5次实验。具体过程为：

先将铁皮石斛鲜茎匀浆处理后，取2g匀浆处理的产物与15mL乙腈-水溶液(乙腈和水的体积比为2:1)混合，在5000rpm下室温震荡10min，然后加入6g无水硫酸镁和1.5g氯化钠，在5000rpm下室温继续震荡5min，然后在4000rpm的转速下离心10min，将上清液取出，作为提取液；

取1.2mL提取液，与5mg石墨化多壁碳纳米管混合，在5000rpm转速下涡旋1min，然后在5000rpm的转速下离心10min，将上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，得到待测液；

将所述待测液按照实施例1中的高效液相色谱-质谱分析法进行分析，得到谱图；并计算各农药的含量。

按照上述方法测试铁皮石斛中鲜叶中的各农药残留量，不同之处仅在于，石墨化多壁碳纳米管的用量为15mg。

加标样品中的各农药残留量的测定：

向铁皮石斛鲜茎或鲜叶中分别按照0.02mg/kg和0.2mg/kg的比例加入表2中的76种农药，然后按照前述铁皮石斛鲜茎或鲜叶的测试的方法，测试加标样品中农药的浓度。

根据上述结果，计算铁皮石斛鲜茎和鲜叶中的76种农药的加标回收率，结果如表4和5所示。由表4和5可知，铁皮石斛鲜茎中：加标水平为0.02mg/kg时，平均回收率在70～120％的农药有71个，RSDs为0.9～18.0％；加标水平为0.2mg/kg时，平均回收率在70～120％的农药数量有72个，RSDs为0.5～19.9％。鲜叶中：加标水平为0.02mg/kg时，平均回收率在70～120％的农药有70个，RSDs为0.6～13.8％；加标水平为0.2mg/kg时，平均回收率在70～120％的农药数量有70个，RSDs为0.3～11.2％。

表4本发明所提供的测试方法对鲜茎中多种农药残留量测试准确性的结果

表5本发明所提供的测试方法对鲜叶中多种农药残留量测试准确性的结果

实施例4

定量限(LOQ)和检测限(LOD)的测定：以信噪比为10时，确定为相应浓度为定量限，信噪比为3时相应的浓度为检测限。具体的测试方法是：

按照实施例1的方法配制不同浓度的鲜茎基质标准液和鲜叶基质标准液，并按照实施例1的分析方法进行高效液相色谱-质谱分析，确定信噪比，以信噪比为10时对应的浓度为定量限，以信噪比为3时的浓度为检测限。

结果如表6所示，由表6可知，鲜茎中LOD在0.01～7.37μg/kg范围内，而LOQ在0.03～24.56μg/kg范围内；鲜叶中LOD在0.01～19.48μg/kg范围内，而LOQ在0.04～64.87μg/kg范围内，均较低。

表6铁皮石斛中76种农药的定量限和检测限测试结果

由于叶的基质相对于茎更加复杂，因此，对比例均以铁皮石斛的叶为待测样品，测试加标回收率，具体如下：

对比例1

以石墨化碳(购买于博纳艾杰尔科技，粒径为40～60μm)为吸附剂，按照实施例3所述的加标回收率的测定方法测定加标量为0.2mg/kg时的加标回收率，石墨化碳的加入量以能够得到透明待测液的最小加入量为准，具体的，对于鲜叶，石墨化碳的加入量为20mg，其他参数与实施例3均相同，结果如表7所示，统计其加标回收率的范围，如表8所示。

对比例2

以多壁碳纳米管(购买于南京先丰纳米材料科技有限公司，管外径为10～20nm)为吸附剂，按照实施例3所述的加标回收率的测定方法测定加标量为0.2mg/kg时的加标回收率，多壁碳纳米管的加入量以能够得到透明待测液的最小加入量为准，具体的，对于鲜叶，多壁碳纳米管的加入量为10mg，其他参数与实施例3均相同，结果如表7所示，统计其加标回收率的范围，如表8所示。

表7对比例1～2对鲜叶中多种农药残留量测试准确性的结果

由表8可知，采用石墨化碳多壁纳米管的准确性优于石墨化碳和多壁碳纳米管，回收率在70～120％范围内的农药种类最多。

表8实施例3和对比例1～2所得加标回收率的汇总

将实施例3对鲜叶中具有平面结构农药的加标回收率(加标量为0.2mg/kg)和对比例1～2对鲜叶中具有平面结构农药的加标回收率列于表9中，由表9可知，在相同的净化标准下(即将提取液净化至透明)，石墨化碳和多壁碳纳米管对平面结构农药的吸附性都较大，测试的加标回收率都明显较低。

表9实施例3和对比例1～2所得具有平面结构农药的加标回收率汇总

名称	实施例3	对比例1	对比例2
				嘧霉胺	94.1％	53.0％	61.9％
嘧菌环胺	75.2％	25.6％	52.6％
				四螨嗪	88.7％	76.5％	12.9％
吡唑醚菌酯	92.6％	75.7％	83.6％
				喹氧灵	93.7％	62.7％	54.2％
三环唑	90.3％	80.4％	67.8％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。