具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因而，它们当然也可有所变化。另外应当了解，本文使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。

A.定义

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”“一种”“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。

范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每一个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每一个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于”值时，也公开了如本领域技术人员所恰当理解的介于值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每一个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

术语“受试者”在本文中定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施例中，受试者是人。

向受试者“给药/施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行施用，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉内、肌内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用(simultaneous administration或administered simultaneously)”意指化合物在同一时间点施用或基本上紧接着施用。在后一种情况下，该两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用化合物时获得的结果不可区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻施用点的一个或多个区域，并且不以治疗上显著的量系统地引入该药剂。例如，局部施用的药剂在局部施用点的附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。

“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受体造成显著的副作用。

“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所提到的元素，但不包括对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药用载体，诸如磷酸盐缓冲液、防腐剂等。“由...组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于给予本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个所定义的实施例都在本发明的范围内。

“对照”是在实验中出于比较目的的替代受试者或样品。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。

“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。

药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。

“减少”可以指导致较少的基因表达、蛋白质表达、症状数量、疾病、组合物、病症或活动的任何变化。当含有该物质的基因产物的遗传产量与不含该物质的基因产物的遗传产量相比较小时，物质也被理解为减少基因的遗传产量。此外，举例来说，减少可以是一种障碍症状的改变，使得症状比以前观察到的要少。减少可以是统计学上显著的量的病症、症状、活动、组合物中的任何个体、中位数或平均减少。因此，只要减少非常显著，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

“抑制(Inhibit、inhibiting和inhibition)”意指降低活性、反应、病症、疾病或其他生物参数。这可以包括但不限于活动、反应、病症或疾病的完全消融。这也可以包括，例如，与未经处理的或对照水平相比，活动、反应、病症或疾病减少10％。因此，与未经处理的或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何减少量。

如本文所用，术语“预防(prevent、preventing或prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或阻止疾病和/或其一个或多个伴随症状的发生或复发，或阻止受试者获得或重新获得疾病或减少受试者获得或重新获得疾病或一个或多个伴随症状的风险的方法。

“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并施用到如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人类的施用时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲液、水、乳液(诸如油/水或者水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。

“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。

“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不良生理病症，预防效应例如预防障碍或其他不良生理病症(例如，非免疫原性癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药用的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药用的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。

组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(诸如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的所需治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年施用多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。

在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。

B.组合物

本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每一个在本文中均予以特别考虑和描述。例如，如果公开讨论了特定生物响应水凝胶和/或工程化颗粒并且讨论了可以对包括生物响应水凝胶和/或工程化颗粒的多个分子进行多种改良，除非指明是相反情况，否则具体考虑到生物响应水凝胶和/或工程化颗粒的各种和每种组合和排列以及可能的修改。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子的实例，则公开了A-D，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

在肿瘤发生过程中，DNA高甲基化等表观遗传变异在免疫逃避中发挥关键作用。这是异质性癌症表型的一个共同特征，因为已检测到TAA启动子区域在多种类型的癌症中是高甲基化的。据报道，低甲基化剂(HMA)，也称为DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)，可有助于增强TAA的表达，这会增加肿瘤免疫原性并增强CD8⁺T细胞的浸润。此外，DNA甲基化也涉及到宿主免疫应答的警报，并且已证明HMA可通过减少MDSC来调控免疫抑制性肿瘤微环境。本文显示，HMA还诱导免疫抑制配体诸如PD-L1/PD-L2的表达，，使肿瘤对PD-1/PD-L1检查点阻断治疗敏感。

本文公开了生物响应水凝胶和工程化颗粒；其中生物响应水凝胶包含第一治疗剂并且工程化颗粒包含第二治疗剂。在一个方面，工程化颗粒可封装在生物响应水凝胶中。因此，在一个方面，本文公开了生物响应水凝胶，其包含第一治疗剂和工程化颗粒；其中所述工程化颗粒包含第二治疗剂。

如上所述，本文所公开的水凝胶和/或工程化颗粒被设计为使患有癌症的受试者对免疫阻断抑制疗法敏感。因此，在一个方面，可以理解和可以在本文设想的是，第一治疗剂或第二治疗剂中的任一者包含阻断抑制剂(诸如，例如，PD-1/PD-L1、CTLA-4/B7-1/2和/或CD47/SIRPα抑制剂)，且其余治疗剂包含低甲基化剂(HMA)(诸如，例如，泽布拉林(Zeb)、5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(地西他滨，DAC)、5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)、N-邻苯二甲酰-L-色氨酸、(S)-2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(RG-108)、瓜德希他滨(SGI-110)、肼苯哒嗪表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、MG98、5-氮杂-4'-硫代-2'-脱氧胞苷(Aza-TdC)、或普鲁卡因)。

在一个方面中，可用于所公开的生物响应水凝胶和/或工程化颗粒中的阻断抑制剂可以为免疫检查点阻断抑制剂的任何抑制剂，诸如，例如PD-1/PD-L1阻断抑制剂、CTLA-4/B7-1/2阻断抑制剂(诸如，例如，易普利单抗)和CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)阻断抑制剂(诸如例如Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和/或TTI-621)。用于所公开的生物响应水凝胶中的PD-1/PD-L1阻断抑制剂的实例可包括本领域已知的任何PD-1/PD-L1阻断抑制剂，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、皮地珠单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。

如本文所述，所公开的生物响应水凝胶和/或工程化颗粒利用嵌入在生物响应水凝胶中或整合在工程化颗粒(颗粒本身可以封装在生物响应水凝胶中)的HMA，以使受试者对免疫检查点抑制疗法敏感。可以理解和可以在本文设想的是，在所公开的水凝胶和/或工程化颗粒中使用的HMA可包括任何已知的HMA，包括但不限于泽布拉林(Zeb)、5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(地西他滨，DAC)、5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)、N-邻苯二甲酰-L-色氨酸、(S)-2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(RG-108)、瓜德希他滨(SGI-110)、肼苯哒嗪表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、MG98、5-氮杂-4'-硫代-2'-脱氧胞苷(Aza-TdC)、或普鲁卡因。因此，在一个方面，本文公开了本文所公开的任何生物响应水凝胶和/或工程化颗粒(包括包含第一治疗剂的水凝胶和嵌入在水凝胶基质中的工程化颗粒)；其中第一治疗剂或包含在工程化颗粒中的第二治疗剂中的任一者包含HMA；并且其中所述HMA包含泽布拉林(Zeb)、5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(地西他滨，DAC)、5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)、N-邻苯二甲酰-L-色氨酸、(S)-2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(RG-108)、瓜德希他滨(SGI-110)、肼苯哒嗪表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、MG98、5-氮杂-4'-硫代-2'-脱氧胞苷(Aza-TdC)、或普鲁卡因。

为了促进这些功能，可以将生物响应水凝胶设计为聚合物。“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加聚物等。在一个方面，凝胶基质可包括共聚物、嵌段共聚物、二嵌段共聚物和/或三嵌段共聚物。

在一个方面，生物响应水凝胶可包含生物相容性聚合物(诸如，例如，透明质酸甲基丙烯酸酯(m-HA))。在一个方面，可交联生物相容性聚合物。此类聚合物还可用于将脂肪褐变剂和/或脂肪调节剂缓慢释放到组织中。如本文所使用的，生物相容性聚合物包括但不限于多糖；亲水性多肽；聚(氨基酸)诸如聚-L-谷氨酸(PGS)、γ-聚谷氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-L-丝氨酸或聚-L-赖氨酸；聚亚烷基二醇和聚环氧烷诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚(环氧乙烷)(PEO)；聚(氧乙烯化多元醇)；聚(烯烃醇)；聚乙烯吡咯烷酮；聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)；聚(羟烷基甲基丙烯酸)；聚(糖)；聚(羟基酸)；聚(乙烯醇)、多羟基酸诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)；聚羟基脂肪酸酯诸如聚3-羟基丁酸或聚4-羟基丁酸；聚己内酯；聚(正酯)；聚酸酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-己内酯)；聚碳酸酯诸如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧环己酮)；聚(烷基烯)；疏水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸盐；聚羟基戊酸盐；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸盐；聚(马来酸)及其共聚物。生物相容性聚合物还可包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醇(PVA)、甲基丙烯酸酯PVA(m-PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、乙基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯、聚氯乙烯聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、线性和支链共聚物及其嵌段共聚物，以及其共混物。示例性可生物降解聚合物包括聚酯、聚(邻位酯)、聚(乙烯胺)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基戊酸酯)、聚酸酐、聚(丙烯酸)、聚乙二醇、聚(氨基甲酸乙酯)、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈及其衍生物、线性和支链共聚物及其嵌段共聚物，以及其共混物。

在一些实施例中，该颗粒包含生物相容性和/或可生物降解聚酯或聚酸酐，诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)。该颗粒可包含以下聚酯中的一种或多种：包括乙醇酸单元(本文称为“PGA”)的均聚物和乳酸单元(诸如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、和聚-D,L-丙交酯5，本文统称为“PLA”)和己内酯单元(诸如聚(己内酯)，在本文中统称为“PCL”)；和包括乳酸和乙醇酸单元的共聚物(诸如以乳酸与乙醇酸之比为特征的各种形式的聚(乳酸-乙醇酸)和聚(丙交酯-乙交酯)，在本文中统称为“PLGA”)；和聚丙烯酸酯，以及其衍生物。示例性聚合物还包括聚乙二醇(PEG)和上述聚酯的共聚物，诸如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，在此统称为“PEG化聚合物”。在某些实施例中，该PEG区域可与聚合物共价缔合以通过可裂解的接头产生“PEG化聚合物”。在一个方面中，该聚合物包含至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的缩醛侧基。

本文所公开的三嵌段共聚物包含核心聚合物，诸如，例如，聚乙二醇(PEG)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚己内酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、纤维素衍生物(诸如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等)。在一个方面，该核心聚合物侧翼可为多肽嵌段。

可在本文公开的胶束中使用的二嵌段共聚物的实例包含聚合物，诸如例如，聚乙二醇(PEG)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇(PVA)、聚吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚己内酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。

可以理解和可以在本文设想的是，该生物响应水凝胶可被设计成对肿瘤微环境具有生物响应，并且一经暴露于肿瘤微环境内的因子，即将第一治疗剂、任何经封装的工程化颗粒(包括包含第二治疗剂的工程化颗粒)及任何另外的抗癌剂释放到所述微环境中，所述微环境诸如，例如活性氧，包括但不限于过氧化物(例如过氧化氢)、超氧化物、羟基自由基和单线态氧；酸性的存在；氧化还原电位(谷胱甘肽(GSH))；特定肿瘤相关的酶；乏氧；和5′-三磷酸腺苷(ATP)。因此，在一个方面，本文所公开的生物响应水凝胶包含生物响应支架，所述生物响应支架一经暴露于肿瘤微环境内的因子，即将第一治疗剂和任何经封装的工程化颗粒、和/或另外的抗癌剂释放到所述微环境中(诸如例如，活性氧(ROS)可降解水凝胶)。在一个方面，水凝胶可包含交联的聚乙烯醇(PVA)和N¹-(4-二羟硼基苄基)-N³-(4-二羟硼基苯基)-N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二铵(TSPBA)。在一个方面，ROS响应水凝胶可借由交联聚乙烯醇(PVA)与ROS不稳定接头来获得：N¹-(4-二羟硼基苄基)-N³-(4-二羟硼基苯基)-N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二铵(TSPBA)，其通过N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二铵与过量4-(溴甲基)苯基硼酸的季铵化反应合成。TSPBA含有两种苯硼酸，它们与PVA上的多个二醇络合。当TSPBA在肿瘤微环境中暴露于H₂O₂时，会被氧化和水解，导致聚合物支架被解离，PVA和有效载荷被释放。

在一个方面，可以理解并可以在本文设想的是，所公开的工程化颗粒和/或生物响应水凝胶也可响应于肿瘤微环境中的pH。在一个方面，本文公开了包含第二治疗剂的工程化颗粒(例如纳米颗粒)，以及包含所述工程化颗粒的生物响应水凝胶；其中所述工程化颗粒包含pH响应性材料(诸如，例如，葡聚糖、CaCO3、壳聚糖、透明质酸、以及它们的聚合物，包括例如葡聚糖单体的聚合物(例如m-葡聚糖单体的聚合物))。

在一个方面，本文所公开的生物响应水凝胶可包含一种以上纳米颗粒。例如，生物响应水凝胶可包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种纳米颗粒。进一步可以理解并且可以在本文设想的是，纳米颗粒可以包含多于一种类型的抗癌剂、阻断抑制剂或HMA。例如，工程化颗粒(诸如纳米颗粒)可包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种抗癌剂、阻断抑制剂或HMA的任意组合。此外，可以理解并可以在本文设想的是，除了并入工程颗粒中的一种或多种抗癌剂、阻断抑制剂或HMA，生物响应水凝胶还可包含额外的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种抗癌剂、阻断抑制剂、HMA或工程化颗粒。

可用于所开的生物响应水凝胶的抗癌剂可包括本领域已知的任何抗癌剂，包括但不限于阿贝西利、醋酸阿比特龙、Abitrexate(二氢叶酸还原酶抑制剂)、紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、本妥昔单抗(BrentuximabVedotin)、ADE、曲妥珠单抗美坦新偶联物、阿霉素(盐酸阿霉素)、双马来酸盐阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和帕洛诺司琼)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、阿来替尼(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、Aliqopa(CopanlisibHydrochloride)、马法兰注射剂(盐酸美法仑)、马法兰片(美法仑)、盐酸帕洛诺司琼注射剂(盐酸帕洛诺司琼)、布吉他滨(布加替尼)、氨苄青霉素(氯霉素)、氨苄青霉素、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿瑞地亚(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、菊欧文氏菌天冬酰胺酶、阿特朱单抗、Avastin(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、卡莫司汀(Carmustine)、贝利司他(Belinostat)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(奥英妥珠单抗)、贝伐单抗、蓓萨罗丁、Bexxar(托西单抗和碘I 131托西单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、博舒替尼(Bosutinib)、博舒替尼、本妥昔单抗、布加替尼、BuMel、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、Cabometyx(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、阿仑单抗(Alemtuzumab)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、CARBOPLATIN-TAXOL、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、Cerubidine(盐酸柔红霉素)、希瑞适(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、CHLORAMBUCIL-PREDNISONE、CHOP、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、帕博西尼、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、盐酸库潘尼西、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、Cotellic(帕博西尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-U(阿糖孢苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、更生霉素、达雷木单抗、达拉他滨(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素、狄诺塞麦、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努妥昔单抗、多西他赛、阿霉素脂质体(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用)、Elitek(拉布利酶)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲波帕、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Eridge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、Erwinaze(菊欧文氏菌天冬酰胺酶)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、优维宁(左旋苯丙氨酸氮芥盐酸盐)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部用、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-BEVACIZUMAB、FOLFIRI-CETUXIMAB、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(奥比妥珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV四价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗、依鲁替尼、ICE、Iclusig(盐酸帕纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉利司、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、Imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特、Imlygic(TalimogeneLaherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、奥英妥珠单抗、重组干扰素Alfa-2b、Interleukin-2(阿地白介素)、Intron A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西单抗和托西单抗、易普利单抗、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙比隆、伊沙佐米柠檬酸盐、Ixempra(伊沙比隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(派姆单抗)、Kisqali(瑞博西尼)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(氯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、环己亚硝脲、Lonsurf(三氟啶和盐酸替吡拉西)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥单抗)、Nanoparticle Paclitaxel(紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、Nerlynx(马来酸来那替尼)、奈托匹坦和盐酸帕洛诺司琼、Neulasta(乙二醇化非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼罗替尼、尼鲁米特、Ninlaro(枸橼酸艾沙佐米)、对甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武单抗、Nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、奥滨尤妥珠单抗、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕尼、奥拉单抗、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(纳武单抗)、Ontak(地尼白介素)、Opdivo(纳武单抗)、OPPA、奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、帕拉普拉特(卡铂)、帕拉铂(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、聚乙二醇化酶、聚乙二醇化非格司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、派姆单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(狄诺塞麦)、Promacta(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、瑞格拉非尼、Relistor(甲基纳曲酮溴化物)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycella(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、罗拉匹坦盐酸盐、罗米地辛、罗米司亭、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、无菌滑石粉(Talc)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、Somatuline Depot(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(Talc)、Steritalc(Talc)、Stivarga(瑞格拉非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Tagrisso(奥希替尼)、Talc、Talimogene Laherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(蓓萨罗丁)、Tasigna(尼罗替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司脂化物、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-局部用)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(西罗莫司脂化物)、托西妥单抗和碘I131托西妥单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟啶和盐酸替吡拉西、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(恩杂鲁胺)、三乙酸尿苷、VAC、凡德他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春花碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春花碱)、维莫非尼、Venclexta(维奈托克)、维奈托克、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、Vincasar PFS(硫酸长春花碱)、Vincristine Sulfate、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三乙酸尿苷)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(甲酰四氢叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(狄诺塞麦)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(易普利姆玛)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-Aflibercept)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕利一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、Zevalin(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-Aflibercept、Zofran(昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。

1.抗体

(1)一般抗体

本文在广义上使用术语“抗体”，并且该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，术语“抗体”中还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，本文还公开了人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段。可使用本文所述的体外测定或类似方法测试抗体所需的活性，然后根据已知的临床试验方法来测试它们的体内治疗和/或预防活性。存在以下五大类人类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些还可以分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将识别小鼠的可比类。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均匀的抗体群中获得的抗体，即，除了可能存在于抗体分子的小亚群中自然发生的突变外，群中的单个抗体是相同的。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的拮抗活性。

可使用产生单克隆抗体的任何程序制备所公开的单克隆抗体。例如，所公开的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)所描述的方法。在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物通常用免疫剂免疫以诱导产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将特异性地结合到该免疫剂上。可替换地，淋巴细胞可以在体外免疫。

单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备。可以使用常规程序来容易地对编码所公开的单克隆抗体的DNA进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。抗体库或活性抗体片段也可以使用噬菌体展示技术生成和筛选，例如，如Burton等人的美国专利号5,804,440以及Barbas等人的美国专利号6,096,441所述。

体外方法也适用于制备单价抗体。使用本领域已知的常规技术可以消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例见1994年12月22日出版的WO 94/29348和美国专利号4,342,566中所述的那些。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段)，每一个片段都有一个抗原结合位点和一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生的片段具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原。

如本文所用，术语“抗体或其片段”包括具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等片段，这些片段包括杂合片段。因此，提供保留结合其特异性抗原能力的抗体片段。这些抗体和片段可以通过本领域已知的技术制备，并且可以根据实例中所述的方法和用于产生抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法来筛选特异性和活性(参见Harlow和Lane，Antibodies,A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988))。

在“抗体或其片段”的含义中还包括抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物。

片段，无论是否附加到其他序列，也可以包括插入、删除、替换或对特定区域或特定氨基酸残基的其他选择修饰，前提是抗体或抗体片段的活性与未经修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可以提供一些额外的特性，如去除/添加能够二硫键合的氨基酸、增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，该抗体或抗体片段必须具有生物活性特性，如与其同源抗原的特异性结合。该抗体或抗体片段的功能或活性区域可通过对蛋白质的特定区域进行诱变，然后对表达的多肽进行表达和检测来确定。这些方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以包括编码该抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变(Zoller,M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354,1992)。

如本文所用，术语“抗体(antibody或antibodies)”也可指人类抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，来自小鼠、大鼠或兔子的抗体)在人类中是天然的抗原，因此在施用到人类时会引起不良免疫应答。因此，在这些方法中使用人类或人源化抗体有助于减少给人类施用抗体引起不良免疫应答的可能性。

(2)人类抗体

所公开的人类抗体可以使用任何技术制备。所公开的人类抗体也可以从转基因动物中获得。例如，已经描述了能够在免疫反应中产生全套人类抗体的转基因突变小鼠(参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-255(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.,7:33(1993))。具体地说，在这些嵌合和生殖系突变小鼠中，抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失导致内源性抗体产生完全抑制，而将人类生殖系抗体基因阵列成功地转移到这些生殖系突变小鼠中则导致在抗原攻击时产生人类抗体。如本文所述，使用Env-CD4共受体复合物选择具有所需的活性的抗体。

(3)人源化抗体

抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。据此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段，诸如sFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合部分)，其包含来自整合到人类(受体)抗体框架中的非人类(供体)抗体的抗原结合位点的一部分。

为了产生人源化抗体，来自受体(人类)抗体分子的一个或多个互补决定区(CDR)的残基被来自已知具有所需的抗原结合特性(例如，对目标抗原有一定的特异性和亲和力)的供体(非人类)抗体分子的一个或多个CDR的残基替代。在一些情况下，人类抗体的Fv框架(FR)残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体也可能含有既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。实际上，人源化抗体通常是人类抗体，其中一些CDR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代，且一些FR残基可能被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。人源化抗体通常含有抗体恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类抗体恒定区(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)，Reichmann等人，Nature,332:323-327(1988)，以及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2:593-596(1992))。

非人类抗体的人源化方法在本领域中是众所周知的。例如，可根据Winter和同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)，Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)，Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人类抗体的相应序列来生成人源化抗体。可用于产生人源化抗体的方法也描述于美国专利号4,816,567(Cabilly等人)、美国专利号5,565,332(Hoogenboom等人)、美国专利号5,721,367(Kay等人)、美国专利号5,837,243(Deo等人)、美国专利号5,939,598(Kucherlapati等人)、美国专利号6,130,364(Jakobovits等人)以及美国专利号6,180,377(Morgan等人)中。

2.药物载体/药品的递送

如上所述，这些组合物也可以药学上可接受的载体施用到体内。“药学上可接受”意指非生物学上或其他方面不良的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用到受试者，不会造成任何不良生物效应或以有害方式与含其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知，该载体将自然地被选择，以最小化该活性成分的任何降解，并最小化该受试者中的任何不利副作用。

可经口服、肠胃外(例如静脉内)、肌内注射、腹膜内注射、经皮、体外、局部等方式施用组合物，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过一个或两个鼻孔将该组合物递送至鼻腔和鼻腔通道，且可包括通过喷雾机制或液滴机制递送，或通过核酸或载体的雾化递送。通过吸入剂的组合物的施用是经鼻腔或口腔、通过喷雾或液滴机制递送。通过插管，递送也可以直接到达呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切数量因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄、体重和一般情况、所治疗过敏性障碍的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切数量。然而，适当的量可以由本领域的普通技术人员通过仅使用本文给出教导的常规实验来确定。

该组合物的肠外施用(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适合在注射前于液体中溶解悬浮液的固体形式，或者是乳剂。最近修订的肠外施用方法包括使用缓释或缓释系统，以保持恒定剂量。参见，例如，美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Senter等人，Bioconjugate Chem.，2:447-451，(1991)；Bagshawe、K.D.，Br.J.Cancer，60:275-281，(1989)；Bagshawe等人，Br.J.Cancer，58:700-703，(1988)；Senter等人，Bioconjugate Chem.，4:3-9，(1993)；Battelli等人，CancerImmunol.Immunother.,35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992)；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等载体。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Hughes等人，Cancer Research,49:6214-6220,(1989)；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta,1104:179-187,(1992))。一般来说，受体参与内吞作用的通路，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化通路具有多种功能，如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节等。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价态和配体浓度，许多受体遵循不止一个细胞内通路。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and CellBiology 10:6，399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

组合物包括抗体，可在治疗上与药学上可接受的载体结合使用。

合适的载体及其制剂在以下文献中有所描述：Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第19版)，A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA1995。通常，在该制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使该制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该溶液的pH值优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。载体还包括缓释制剂，诸如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透膜基质，其基质为成型制品的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，某些载体可能更可取，例如取决于施用途径和所施用的组合物的浓度。

本领域技术人员已知药物载体。这些通常是给人类施用药物的标准载体，包括无菌水、生理盐水和生理pH下的缓冲液等溶液。这些组合物可以肌肉注射或皮下施用。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

除了所选择的分子，药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。

根据是否需要局部或全身治疗以及治疗区域的不同，药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或肠胃外，例如静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的抗体可经静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或经皮施用。

用于肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

局部施用制剂可包括软膏、乳液、面霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。传统的药物载体、水、粉末或油性碱、增稠剂等可能是必要的或可取的。

口服施用组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。

一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐施用，并通过无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应形成，或无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如一、二、三烷基和芳基胺及取代乙醇胺)反应形成。

b)治疗用途

可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。组合物的施用剂量范围应足够大，以产生所需的效果，从而影响障碍的症状。剂量不应太大以致引起不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以通过本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。例如，在抗体治疗用途的文献中可以找到选择适当剂量抗体的指南，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编，NogesPublications,Park Ridge,N.J.,(1985)第22章和第303-357页；Smith等人，Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编，Raven Press,New York(1977)第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能在每天约1μg/kg至100mg/kg体重或以上的范围内。

C.治疗癌症的方法

在一个方面，本文公开了治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移(诸如，例如，具有低PD-L1表达的癌症或选自由黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈部癌和/或膀胱癌组成的组的非免疫原性癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的任何生物响应水凝胶。例如，本文公开了治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移(诸如，例如，具有低PD-L1表达的癌症或选自由黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈部癌和/或膀胱癌组成的组的非免疫原性癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用生物响应水凝胶和工程化颗粒；其中生物响应水凝胶包含第一治疗剂；并且其中颗粒包含第二治疗剂。

“治疗(Treat、treating或treatment)”及其在本文中使用的语法变体包括组合物的施用，其目的在于部分或完全预防、延迟、治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善、稳定、减缓和/或降低强度或一种或多种疾病或病症的频率，一种疾病或病症的症状，或一种疾病或病症的根本原因。根据本发明所述的治疗可防范性、预防性、姑息性或补救性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后施用到受试者。预防性施用可在感染症状出现之前一天或数天至数年发生。

在一个方面，在所公开的治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移的方法中使用的第一治疗剂或第二治疗剂中的任一者包含阻断抑制剂并且其余治疗剂包含低甲基化剂(HMA)。在一个方面中，可用于所公开的方法中的阻断抑制剂可以是免疫检查点的任何抑制剂，诸如PD-1/PD-L1阻断抑制剂、CTLA-4/B7-1/2阻断抑制剂(例如易普利单抗)和CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)阻断抑制剂(例如Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和/或TTI-621)。用于所公开的生物响应水凝胶中的PD-1/PD-L1阻断抑制剂的实例可包括本领域已知的任何PD-1/PD-L1阻断抑制剂，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、皮地珠单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。因此，在一个方面，本文公开了治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移的方法，所述方法包括向受试者施用生物响应水凝胶和工程化颗粒；其中所述生物响应水凝胶包含第一治疗剂；并且其中所述颗粒包含第二治疗剂；其中，所述第一治疗剂或第二治疗剂中的任一者包含阻断抑制剂；其中所述阻断抑制剂为PD-1/PD-L1阻断抑制剂，诸如纳武单抗、派姆单抗、皮地珠单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559；CTLA-4/B7-1/2抑制剂，例如，易普利单抗；和/或CD47/SIRPa抑制剂，诸如Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621。可以理解和可以在本文设想的是，该生物响应水凝胶可设计为同时并入1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种阻断抑制剂。

如本文所述，所公开的方法利用嵌入在生物响应水凝胶中或整合在工程化颗粒(颗粒本身可以封装在生物响应水凝胶中)的HMA。可以理解和可以在本文设想的是，在所公开的方法中使用的HMA可包括任何已知的HMA，包括但不限于泽布拉林(Zeb)、5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(地西他滨，DAC)、5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)、N-邻苯二甲酰-L-色氨酸、(S)-2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(RG-108)、瓜德希他滨(SGI-110)、肼苯哒嗪表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、MG98、5-氮杂-4'-硫代-2'-脱氧胞苷(Aza-TdC)、或普鲁卡因。因此，在一个方面，本文公开了治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移的方法，所述方法包括向受试者施用生物响应水凝胶和工程化颗粒；其中所述生物响应水凝胶包含第一治疗剂；并且其中所述颗粒包含第二治疗剂；其中所述第一治疗剂或第二治疗剂中的任一者包含HMA；并且其中所述HMA包含泽布拉林(Zeb)、5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(地西他滨，DAC)、5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)、N-邻苯二甲酰-L-色氨酸、(S)-2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(RG-108)、瓜德希他滨(SGI-110)、肼苯哒嗪表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、MG98、5-氮杂-4'-硫代-2'-脱氧胞苷(Aza-TdC)、或普鲁卡因。

在一个方面，所公开的治疗、预防、抑制或减少癌症或转移的方法包括向受试者施用本文公开的任何治疗剂递送载体或药物组合物(诸如所公开的工程化颗粒和生物响应水凝胶，包括但不限于包含工程化颗粒的生物响应水凝胶)，所述方法可包括以适合于受试者的特定癌症的治疗的任何频率施用药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒。例如，药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒可至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给患者。在一个方面，药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

如本文所公开的，可将生物响应水凝胶支架设计成当水凝胶响应于肿瘤微环境中的因子而发生降解时，释放封装在水凝胶中的任何治疗剂、工程化颗粒或其他抗癌剂。因此，本文公开了治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移的方法，其中生物响应水凝胶包含生物响应支架，所述生物响应支架一经暴露于肿瘤微环境内的因子，即将第一治疗剂和/或包含第二治疗剂的工程化颗粒和/或任何另外的封装的抗癌剂释放到所述微环境中。在一个方面，生物响应水凝胶包括活性氧(ROS)可降解水凝胶。可以理解并可以在本文设想的是，第一治疗剂和/或包含第二治疗剂的工程化颗粒和/或由生物响应水凝胶封装的任何另外的抗癌剂向肿瘤微环境的释放受到微环境的影响。在一个方面，本文也公开了治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移的方法，其中水凝胶向肿瘤微环境中释放第一治疗剂和或工程化颗粒达至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。

可以理解并可以在本文设想的是，生物响应水凝胶和工程化颗粒可分别(同时或序贯施用)施用于肿瘤部位或通过在施用前将工程化颗粒封装在生物响应水凝胶中而同时施用。因此，本文可以设想的是，生物响应水凝胶和工程化颗粒可分开保存并同时或序贯施用。例如，在施用工程化颗粒之前至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时，可将生物响应水凝胶施用于受试者的肿瘤部位。类似地，在施用工程化颗粒之后至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时，可将生物响应水凝胶施用于受试者的肿瘤部位。

在一个方面，本文所公开的施用给受试者以供所公开的方法中使用的药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒的量可包括医师所确定的适于治疗受试者的特定癌症的任何量。例如，药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒的量可为约10mg/kg至约100mg/kg。例如，施用的药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒的量可为至少10mg/k、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg。因此，在一个方面，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，其中施用的药物组合物、生物响应水凝胶和/或工程化颗粒的剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。

如上所述，可以理解和可以在本文设想的是，所公开的治疗、预防、抑制或减少受试者的癌症或转移的方法可进一步包括施用将进一步有助于减少、抑制、治疗和/或消除癌症或转移的任何抗癌剂(诸如，例如，吉西他滨)。可用于所公开的生物响应水凝胶或作为除所公开的药物组合物、工程化颗粒和/或生物响应水凝胶(包括其中包封有工程化颗粒的生物响应水凝胶)之外的额外治疗剂的用于在本文所公开的受试者中减少、抑制、治疗和/或消除癌症或转移的方法中的抗癌剂可以包括本领域已知的任何抗癌剂，包括但不限于阿贝西利、醋酸阿比特龙、Abitrexate(二氢叶酸还原酶抑制剂)、紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、本妥昔单抗(Brentuximab Vedotin)、ADE、曲妥珠单抗美坦新偶联物、阿霉素(盐酸阿霉素)、双马来酸盐阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和帕洛诺司琼)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、阿来替尼(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、Aliqopa(Copanlisib Hydrochloride)、马法兰注射剂(盐酸美法仑)、马法兰片(美法仑)、盐酸帕洛诺司琼注射剂(盐酸帕洛诺司琼)、布吉他滨(布加替尼)、氨苄青霉素(氯霉素)、氨苄青霉素、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿瑞地亚(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)三氧化二砷、奥法木单抗(Ofatumumab)、菊欧文氏菌天冬酰胺酶、阿特朱单抗、Avastin(贝伐单抗)、阿维单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维单抗)、BEACOPP、卡莫司汀(Carmustine)、贝利司他(Belinostat)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(奥英妥珠单抗)、贝伐单抗、蓓萨罗丁、Bexxar(托西单抗和碘I 131托西单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、博舒替尼(Bosutinib)、博舒替尼、本妥昔单抗、布加替尼、BuMel、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、Cabometyx(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、阿仑单抗(Alemtuzumab)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、CARBOPLATIN-TAXOL、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、Cerubidine(盐酸柔红霉素)、希瑞适(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、CHLORAMBUCIL-PREDNISONE、CHOP、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、帕博西尼、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、盐酸库潘尼西、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、Cotellic(帕博西尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-U(阿糖孢苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、更生霉素、达雷木单抗、达拉他滨(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素、狄诺塞麦、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努妥昔单抗、多西他赛、阿霉素脂质体(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用)、Elitek(拉布利酶)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲波帕、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Eridge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、Erwinaze(菊欧文氏菌天冬酰胺酶)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、优维宁(左旋苯丙氨酸氮芥盐酸盐)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部用、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-BEVACIZUMAB、FOLFIRI-CETUXIMAB、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(奥比妥珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV四价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗、依鲁替尼、ICE、Iclusig(盐酸帕纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉利司、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、Imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、奥英妥珠单抗、重组干扰素Alfa-2b、Interleukin-2(阿地白介素)、Intron A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西单抗和托西单抗、易普利姆玛、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙比隆、伊沙佐米柠檬酸盐、Ixempra(伊沙比隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(派姆单抗)、Kisqali(瑞博西尼)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(氯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、环己亚硝脲、Lonsurf(三氟啶和盐酸替吡拉西)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥单抗)、Nanoparticle Paclitaxel(紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、Nerlynx(马来酸来那替尼)、奈托匹坦和盐酸帕洛诺司琼、Neulasta(乙二醇化非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼罗替尼、尼鲁米特、Ninlaro(枸橼酸艾沙佐米)、对甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武单抗、Nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、奥滨尤妥珠单抗、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕尼、奥拉单抗、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(纳武单抗)、Ontak(地尼白介素)、Opdivo(纳武单抗)、OPPA、奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、帕拉普拉特(卡铂)、帕拉铂(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、聚乙二醇化酶、聚乙二醇化非格司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、派姆单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(狄诺塞麦)、Promacta(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、瑞格拉非尼、Relistor(甲基纳曲酮溴化物)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycella(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、罗拉匹坦盐酸盐罗米地辛、罗米司亭、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、无菌滑石粉(Talc)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、Somatuline Depot(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(Talc)、Steritalc(Talc)、Stivarga(瑞格拉非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Tagrisso(奥希替尼)、Talc、Talimogene Laherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(蓓萨罗丁)、Tasigna(尼罗替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司脂化物、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-局部用)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(西罗莫司脂化物)、托西妥单抗和碘I 131托西妥单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟啶和盐酸替吡拉西、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(恩杂鲁胺)、三乙酸尿苷、VAC、凡德他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春花碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春花碱)、维莫非尼、Venclexta(维奈托克)、维奈托克、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、Vincasar PFS(硫酸长春花碱)、Vincristine Sulfate、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三乙酸尿苷)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(甲酰四氢叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(狄诺塞麦)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(易普利姆玛)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-Aflibercept)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕利一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、Zevalin(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-Aflibercept、Zofran(昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。

所公开的组合物可用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症和转移，包括但不限于具有低PD-L1表达的癌症或非免疫原性癌症。所公开的组合物可用于治疗的代表性但不限于以下的癌症列表：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病、骨髓性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等肺癌、神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、黑素瘤、口腔鳞癌、咽喉鳞癌、喉癌和肺鳞癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌、以及上皮癌、肾癌、泌尿生殖道癌、肺癌、食管癌、头颈部癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。

在一个方面，本公开为在患有癌症的受试者的肿瘤中诱导阻断抑制剂敏感性的方法，其包括向受试者施用本公开所述的任何生物响应水凝胶(诸如，例如，包含第一治疗剂和工程化颗粒的生物响应水凝胶，其中所述工程化颗粒包含第二治疗剂；并且其中所述治疗剂中的一者包含低甲基化剂(HMA)且另一者治疗剂包含免疫阻断抑制剂)。

D.实例

提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范而非旨在限制公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

1.实例1：结合表观遗传调控和免疫检查点阻断的双生物响应性药物递送库

本文描述了双生物响应性原位形成的贮库，用于局部共同递送泽布拉林(Zeb)、去甲基化剂中的一种、和aPD1抗体(图1A)。首先将aPD1抗体装入pH敏感的CaCO₃纳米颗粒(aPD1-NPs)中用于局部缓释，然后将aPD1-NPs和Zeb一起封装到通过混合聚乙烯醇(PVA)和N¹-(4-二羟硼基苄基)-N³-(4-二羟硼基苯基)-N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二铵(TSPBA)接头进行交联的ROS响应水凝胶(Zeb-aPD1-NPs-Gel)中。将这种ROS/H⁺双敏感支架设计为利用肿瘤内的酸性肿瘤微环境和ROS来控释并增加治疗剂的保留时间。我们预计装有Zeb的水凝胶可以调控TAA的表达，通过减少抑制性免疫细胞来逆转免疫抑制性肿瘤微环境，并上调PD-L1表达。结合封锁PD-L1与PD-1相互作用的aPD1的控释，双重应答库将引发强烈的抗肿瘤免疫应答。

为了选择用于组合疗法的最佳HMA，已经测试了包括5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)、泽布拉林(Zeb)和5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)的四种药剂。AC和DAC为研究最多的HMA中的两种，且已被批准用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)。作为最近研究的药剂，Zeb具有更好的稳定性和更低的毒性，其已显示出优选在体外/体内靶向癌细胞的潜力。另一嘧啶核苷类似物5-F在C5位置具有氟原子而不是质子，经研究，已将其用于减少脑肿瘤的增殖。首先，进行MTT测定以比较这些药剂之间的细胞毒性并确定诱导TAA表达的合适的浓度。DAC和5-F对B16F10黑素瘤细胞的IC₅₀值分别为2.55μM和1.05μM，远低于AC(48.98μM)和Zeb(69.18μM)。这种高细胞毒性可显著阻碍DAC和5-F的应用，因为它们直接导致肿瘤细胞死亡而不是诱导TAA。因此选择具有合适IC₅₀值的AC和Zeb用于以下研究。下一步比较的是AC和Zeb之间的TAA的诱导。检测到包括黑素瘤抗原家族E1(MAGE-E1)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP1)和黑素瘤细胞粘附分子(CD146)抗原的三种TAA。结果表明，Zeb诱导的肿瘤抗原表达与AC相似或略多。此外，AC在水溶液中非常不稳定，而Zeb在中性和酸性溶液中是稳定的，这使得后者的潜在临床应用更加灵活。因此，最终选择Zeb作为TAA诱导剂进行进一步研究。

下一步，使用聚(乙二醇)-聚(谷氨酸)(PEG-P(Glu))嵌段共聚物与水溶液中的Ca²⁺和CO₃ ^2-相互作用来制备装有aPD1的CaCO₃纳米颗粒。谷氨酸(Glu)提供羧基，以与Ca²⁺相互作用，防止大CaCO₃块的矿化，而PEG壳起到避免团聚和聚集的作用。得到平均粒径约为100nm(图1B)且封装效率约为50％的单分散aPD1-NPs。ROS响应TSPBA接头一经合成，然后借由¹H-NMR进行表征(图2)。由于苯基硼酸和PVA中的cis-1,3-二醇之间缀合，当将接头与PVA混合时，立即形成水凝胶。将包含Zeb的TSPBA接头溶液添加到包含aPD1-NPs的PVA溶液中，使得立即形成水凝胶(Zeb-aPD1-NPs-Gel)。该干燥支架的冷冻扫描电镜术(Cyro-SEM)图像显示出球形NP被装入具有网络结构的水凝胶中(图1C)。此外，当TSPBA接头暴露于H₂O₂中时会被氧化和水解，使得水凝胶降解且Zeb释放(图1D)。aPD1-NPs可以通过与H⁺反应而在微酸性缓冲液中溶解和释放aPD1(图3)，在72小时内释放量接近95％。更重要的是，将aPD1-NPs封装在凝胶库中可以更大程度地控释aPD1。如图1E所示，约75％的aPD1抗体在72小时之时借由H₂O₂和低pH刺激物两者触发而释放。为了研究aPD1抗体在体内的保留能力，将用Cyanine5.5(Cy5.5)标记的aPD1装入凝胶库中，然后进行瘤周注射。凝胶植入后六天，仍然可检测到荧光信号，而游离Cy5.5-aPD1和Cy5.5-aPD1-NPs组几乎没有信号，这表明凝胶中aPD1-NPs的封装增加了其在肿瘤部位的保留(图1F)。

然后，通过蛋白质印迹测定研究装有Zeb的凝胶(Zeb-Gel)治疗组的TAA表达。结果显示MAGE-E1、TRP1和CD146的表达增强，表明Zeb可以促进TAA的暴露，从而增加黑素瘤的免疫原性，这可以增强抗原呈递细胞对肿瘤抗原的捕获(图4A)。Zeb-Gel治疗还促进成熟树突细胞(mDC)表达CD80和CD86(图4D和4E)。此外，在Zeb-Gel组中检测到MDSC显著减少，MDSC的量约为未治疗组(UnTx)的约30％且为Gel处理组的一半，这表明Zeb可以逆转免疫抑制性肿瘤微环境(图4F和图4G)。此外，Zeb的存在上调了B16F10肿瘤上的PD-L1的表达(图4B和图4C)，使得随后使用免疫检查点阻断变得必不可少。为了证实表观遗传调控和ICB治疗的组合策略可增强对肿瘤生长的抑制，建立了B16F10黑素瘤荷瘤小鼠模型。在瘤周部位注射不同的制剂，包括空白Gel、aPD1-NPs-Gel(aPD1，每只小鼠40μg)、aPD1-NPs-Gel+Zeb(aPD1，每只小鼠40μg；Zeb，5mg/kg)，Zeb-NPs-Gel(Zeb，5mg/kg)和Zeb-aPD1-NPs-Gel(aPD1，每只小鼠40μg；Zeb，5mg/kg)。通过捕获荧光素酶标记的B16F10细胞的生物发光图像来监测体内肿瘤生长(图5A)。Zeb-aPD1-NPs-Gel治疗组显示出最显著的肿瘤抑制作用，而空白Gel治疗组显示出可忽略的治疗效力，且单药剂治疗组表现出对肿瘤生长的有限的抑制作用(图5B)。此外，Zeb-aPD1-NPs-Gel组在第12天的平均肿瘤体积比aPD1-NPs-Gel+Zeb治疗组小4.27倍，这归因于凝胶库中Zeb的控释。更重要的是，用Zeb-aPD1-NPs-Gel治疗的小鼠的中位存活时间有效延长至39.5天，显著长于其他组(p<0.001)，包括未治疗组(16天)、空白Gel(15天)、aPD1-NPs-Gel(18天)、Zeb-NPs-Gel(16天)和aPD1-NPs-Gel+Zeb(23天)(图5C)。甚至三分之一的Zeb-aPD1-NPs-Gel治疗小鼠存活了六十多天。

此外，在不同治疗后五天收获肿瘤用于流式细胞术和免疫荧光分析。如图5D和5E所示，用Zeb-aPD1-NPs-Gel治疗的组表现出显著更高的肿瘤中CD8⁺T细胞浸润率，平均为4.46％，是Zeb-NPs-Gel组的2.73倍(p<0.001)，是aPD1-NPs-Gel+Zeb组的1.90倍(p<0.01)。如图6所示，用Zeb-aPD1-NPs-Gel的治疗进一步有效地增加活化CD8⁺T细胞(CD8⁺CD44⁺T细胞)的数量，使CD8⁺T细胞增效。

为了评估Zeb-aPD1-NPs-Gel的全身抗肿瘤免疫效果，构建了双侧B16F10荷瘤小鼠。将Zeb-aPD1-NPs-Gel植入到左侧肿瘤旁边。与对照组相比，两侧的肿瘤生长具有相似的趋势并且明显受到抑制(p<0.001)(图7A和7B)。治疗组在在治疗后十天左侧和右侧的平均肿瘤体积分别比左侧未治疗组小14.3倍和5.5倍。此外，与未治疗组相比，流式细胞术检测到肿瘤的CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞浸润增加(左侧和右侧)(p<0.05)(图7C-7E)。这些结果表明Zeb-aPD1-NPs-Gel的局部递送可以有效诱导全身抗肿瘤免疫应答。

总之，将装有Zeb和aPD1的生物响应库设计为结合表观遗传调控和免疫疗法，已被证明可有效增强抗肿瘤免疫应答。这种双响应支架由pH敏感的CaCO₃ NP和ROS响应水凝胶组成，能够通过响应与肿瘤微环境相关的酸性pH和ROS条件来实现有效载荷的控释。此外，Zeb的局部释放通过增强TAA表达来增加肿瘤的免疫原性，减少免疫抑制。基于这些功能，Zeb与aPD1抑制剂的组合有效地增强了T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。这种与表观遗传调控剂和免疫检查点阻断治疗相结合的递送策略可以经转化用于提高临床客观响应速率。

a)材料和方法

(1)蛋白质印迹测定：

进行蛋白质印迹测定以研究B16F10黑素瘤的多种TAA表达水平。对于体外研究，将B16F10细胞用不同的去甲基化剂以预定浓度治疗72小时，然后去除装有药物的培养基并替换为正常的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，并将细胞再孵育四天。对于体内研究，将Gel或Zeb-Gel植入黑素瘤荷瘤小鼠中五天。使用RIPA缓冲液从细胞或肿瘤组织中收集蛋白质，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)定量总蛋白质浓度。将等量的蛋白质与2x laemmli样品缓冲液混合，然后装入Mini-TGX^TM预制蛋白质凝胶(Bio-Rad)并分离，并转移至膜(Bio-Rad)，并在3％脱脂牛奶中在室温下阻断1小时，然后与以下稀释于1.5％牛血清白蛋白(BSA)的一抗在4℃孵育过夜：抗β肌动蛋白抗体、抗TRP1抗体、抗CD146抗体和抗MAGE-E1抗体。然后，将山羊抗兔/鼠HRP缀合的二抗稀释并孵育1小时。借助化学发光获得图像。

(2)ROS响应TSPBA接头和PEG-P(Glu)嵌段共聚物的合成：

TSPBA是由N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺(TMPA)和4-(溴甲基)苯基硼酸之间的季铵化反应合成的。简而言之，将4-(溴甲基)苯基硼酸和TMPA在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中混合(3:1，mmol/mmol)并在60℃搅拌24小时。然后，将反应溶液在四氢呋喃(THF)中沉淀并过滤，并进一步用THF洗涤三次。将产物在真空条件下放置过夜以获得纯的TSPBA，然后通过¹H-NMR表征。

合成PEG-P(Glu)嵌段共聚物。简而言之，使用三光气和L-谷氨酸γ-苄基酯借由Fuchs-Farthing法合成了γ-苄基L-谷氨酸(NCA-BLG)的N-羧酸酐。然后，利用CH₃O-PEG-NH₂的伯氨基，在DMF中通过以下开环程序引发NCA-BLG，获得PEG-聚(γ-苄基L-谷氨酸)(PEG-PBLG)。最后，在室温通过与0.5N NaOH混合来去除PEG-PBLG的苄基以获得PEG-P(Glu)。使用¹H-NMR光谱(300MHz；溶剂：D₂O)计算出PEG-P(Glu)的P(Glu)片段的重复单元为50。

(3)Zeb-aPD1-NPs-Gel的制备和表征：

首先，aPD1-NPs是通过化学沉淀制备的。简而言之，将5mg PEG-P(Glu)溶解在DI水中，然后添加80μg aPD1，随后添加10mg CaCl₂水溶液。然后，缓慢添加1mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，以将pH值调节至pH7.8，从而形成Ca²⁺螯合物。并将3mg Na₂CO₃滴加到混合物中，直到观察到表明aPD1-NPs制剂的乳白光。将混合物在4℃搅拌过夜，然后离心去除多余的离子、共聚物和抗体(14,800rpm，15分钟)。通过DLS表征粒径分布，并通过TEM(JEOL 2000FX)观察其形态。借由ELISA(大鼠IgG总ELISA试剂盒，Abcam，目录号ab189578)测量aPD1在CaCO₃ NP中的封装效率。然后将预定量的Zeb溶解在10wt％的TSPBA溶液中，然后添加到含有aPD1-NPs的5wt％PVA中形成Zeb-aPD1-NPs-Gel。这种支架的形态由Cyro-SEM(JEOL7600F搭载Gatan Alto)进行表征。

(4)来自水凝胶的Zeb和aPD1的体外释放：

关于Zeb的释放，将1mM H₂O₂添加到PBS缓冲液中以研究ROS响应水凝胶中的Zeb的释放曲线，通过HPLC分析Zeb的量。对于aPD1释放，在具有或不具有H₂O₂的不同pH值(pH 6.5或pH 7.4)的PB缓冲液中对其进行了研究。借由大鼠IgG总ELISA试剂盒测量已释放的aPD1。所有研究均在室温进行。

(5)体内抗肿瘤效果：

通过将约1×10⁶的luc-B16F10细胞植入小鼠右侧来建立携带皮下B16F10黑素瘤的C57BL/6雄性小鼠模型。六天后，将小鼠随机分为六组(n＝6)，以每只小鼠40μg aPD1和/或5mg/kg Zeb的剂量瘤周植入不同制剂，包括空白Gel、aPD1-NPs-Gel、aPD1-NPs-Gel+Zeb、Zeb-NPs-Gel和Zeb-aPD1-NPs-Gel。对于生物发光成像，腹膜内注射100μL D-荧光素底物溶液(30mg/mL)5分钟，然后通过IVIS成像系统(Perkin Elmer Ltd)对小鼠成像。每两天一次测量肿瘤体积并根据公式计算：(长径×短径²)/2。从植入肿瘤细胞的那天开始记录模型小鼠的存活时间，并绘制Kaplan-Meier存活曲线。当出现健康不佳的迹象或肿瘤大小超过1.5cm³时，对动物实施安乐死。

(6)流式细胞术：

如上所述建立和处理小鼠模型。五天后，对小鼠实施安乐死，收集肿瘤并在冷细胞染色缓冲液中均质化，以在过滤后获得单细胞悬浮液。按照说明用不同的荧光标记抗体对细胞进行染色。在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)上测量染色的细胞并借助FlowJo软件进行分析。

(7)治疗远处肿瘤的体内全身免疫效果：

在小鼠两侧植入1×10⁶个luc-B16F10细胞。七天后，左侧肿瘤部位注射Zeb-aPD1-NPs-Gel，而右侧肿瘤部位未进行治疗。如上所述，对体内生物发光成像和两侧的肿瘤体积进行成像。十天后，处死小鼠并收集肿瘤以进行上述流式细胞术实验。

(8)统计分析：

所有结果均表示为平均值±SD，如GraphPad Prism 7.0所示和所执行的。Tukey事后检验和单因素方差分析(ANOVA)用于多重比较(比较至少三组)。使用对数秩检验确定存活益处。统计显著性的阈值为P<0.05。

(9)化学品和试剂：

4-(溴甲基)苯基硼酸、N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺(TMPA)、聚乙烯醇(PVA，89-98kDa，99％水解)、5-氮杂胞苷(AC)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)、泽布拉林(Zeb)、5-氟-2'-脱氧胞苷(5-F)和L-谷氨酸γ-苄基酯购自Sigma-Aldrich。mPEG-Amine(MW 10kDa)购自Laysan Bio。D-Luciferin-K⁺盐生物发光底物(目录号NC0921725)购自Perkin Elmer LLC。从Abcam获得抗PD-L1抗体、抗TRP1抗体(ab178676)和抗CD146抗体(ab75769)。抗黑素瘤抗原家族E1抗体(Novus Biologicals^TM，目录号NBP191489)。抗鼠PD-1抗体(目录号114114)、抗CD3抗体(目录号100204)、抗CD4抗体(目录号100412APC)、抗CD8抗体(目录号100707)、抗CD45抗体(目录号103108)、抗CD11b抗体(目录号101208)、抗Gr-1抗体(目录号108412)、抗CD11c抗体(目录号117307)、抗CD80抗体(目录号104705)、抗CD86抗体(目录号105011)、抗CD8抗体(目录号201703)、抗CD44抗体(目录号103029)、抗CD3抗体(目录号100205)、抗CD4抗体(目录号100433)和抗Foxp3抗体(目录号126407)购自Biolegend。

(10)MTT测定：

B16F10细胞以每孔5×10³个细胞的密度在96孔板中培养过夜。然后将DMEM培养基分别替换为包含不同浓度AC、DAC、Zeb或5-F的DMEM培养基。孵育72小时后，每孔添加5mg/mLMTT溶液，再孵育4小时。最后，根据560nm处的吸光度，借助板式读数器(Power Wave XS，Bio-TEK，USA)计算细胞存活率。

(11)来自CaCO₃纳米颗粒的aPD1的体外释放：

在室温，在具有不同pH值(pH 6.5和7.4)的PB缓冲液中释放装有aPD1的NP。借由大鼠IgG总ELISA试剂盒测量已释放的aPD1。

(12)细胞系：

荧光素酶标记的B16F10黑素瘤细胞系(luc-B16F10)由北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC-CH)的Leaf Huang博士友情提供。B16F10细胞用DMEM(Gibco,Invitrogen)来保存，并添加10％胎牛血清(Invitrogen)、青霉素(100U/ml；Invitrogen)和链霉素(100U/ml；Invitrogen)。

(13)小鼠：

六至八周龄的C57BL/6雄性小鼠购自杰克逊实验室，并贯穿所有实验使用。所有动物研究均严格按照UNC-CH和北卡罗来纳州立大学(NCSU)的动物护理和使用委员会批准的动物协议进行。所有小鼠均按照UNC-CH和NCSU动物研究的联邦和州政策进行饲养。

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