阅读说明：本技术 猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法 (Triple inactivated vaccine for porcine circovirus type 2, mycoplasma hyopneumoniae and haemophilus parasuis and preparation method thereof ) 是由 耿兴良 王楠 朱杰 徐海军 杨合涛 杨灵芝 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗极其制备方法,属于兽用生物制品技术领域。本发明由抗原和疫苗佐剂构成；所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原组成；所述猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达获得的cap蛋白,蛋白含量≥150μg/mL；所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体菌液；所述副猪嗜血杆菌为灭活的副猪嗜血杆菌菌液；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。本发明提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗,在预防此三种猪病,提高猪生产性能表现出明显优势。(The invention discloses a porcine circovirus type 2, mycoplasma hyopneumoniae and haemophilus parasuis triple inactivated vaccine and a preparation method thereof, belonging to the technical field of biological products for livestock. The invention is composed of antigen and vaccine adjuvant; the antigen consists of porcine circovirus type 2 antigen, mycoplasma hyopneumoniae antigen and haemophilus parasuis antigen; the porcine circovirus type 2 antigen is cap protein obtained by pichia pastoris expression, and the protein content is more than or equal to 150 mug/mL; the mycoplasma hyopneumoniae antigen is inactivated mycoplasma hyopneumoniae bacterial liquid; the haemophilus parasuis is inactivated haemophilus parasuis bacterial liquid; the vaccine adjuvant is composed of an aqueous high molecular polymer adjuvant and a complex polysaccharide immunopotentiator. The triple inactivated vaccine for porcine circovirus type 2, mycoplasma hyopneumoniae and haemophilus parasuis provided by the invention has obvious advantages in preventing the three porcine diseases and improving the production performance of pigs.)

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗 及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型引起的猪的一种传染病，引起仔猪断奶综合征、猪皮炎与肾病综合征及母猪繁殖障碍，其临床表现多样化。猪感染圆环病毒后，可引起严重的免疫抑制，从而继发或并发其他传染病，如猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、猪溶血性链球菌等疾病。

猪支原体肺炎，又称猪地方性流行肺炎，是由猪肺炎支原体引起的以慢性、高度传染性、高发病率和低死亡率为主要特点的呼吸道疾病。感染猪长期发育不良、饲料转化率低、日增重下降，严重影响养猪业的经济效益。猪肺炎支原体和其他呼吸道疾病的病原，如猪繁殖与呼吸道综合征病毒、放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪流感病毒、圆环病毒2型混合感染时，会使病情加剧，引起猪的死亡。猪支原体肺炎是一种顽固性慢性病，抗支原体药物治疗一般可以抑制该病但很难清除，用药后咳喘症状消失，但停药后容易再次复发。

副猪嗜血杆菌定居于健康猪的上呼吸道，是猪上呼吸道的一种共栖菌。在转群、断奶后失去母源抗体保护、其他疾病导致免疫力下降时，表现出浆膜炎、脑膜炎等症状，可影响2周龄的哺乳仔猪和4个月的青年猪，主要在断奶后和保育期发病，多见于5-8周龄的猪。猪圆环和猪肺炎支原体属于免疫抑制病，导致猪群免疫力下降，给副猪嗜血杆菌的致病创造条件，这三种疾病常发生混感，造成猪只的发病及死亡，严重影响我国养猪事业的发展。

目前，市售疫苗中仅有相关单苗或者二联疫苗，免疫频率过大，导致猪只应激。同时由于抗生素滥用，导致耐药菌株的出现，使药物治疗趋于无效；本发明所提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联疫苗，可做到一针三防，减少免疫次数及应激，切实解决养猪业的难题。

虽然也有关于圆环病毒2型亚单位疫苗的联苗发明专利，但圆环病毒2型Cap蛋白采用大肠杆菌表达系统获得。大肠杆菌表达系统为原核表达系统，缺乏对蛋白翻译后的加工修饰作用，因此不能对表达获得的圆环cap蛋白进行空间构型的折叠修饰，很难保证后期cap蛋白的VLP有100％活性。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备方法。

本发明的技术方案为：

一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，由抗原和疫苗佐剂构成；所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原组成；所述猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达并纯化获得的cap蛋白，蛋白含量≥150μg/mL；所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体破碎菌液；所述副猪嗜血杆菌为灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。

毕赤酵母表达系统为真核表达系统，可以对表达蛋白进行后期的加工修饰，使目的蛋白更接近天然的空间构想，蛋白活性更好。本发明的三联灭活疫苗中，猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达并纯化的cap蛋白，该cap蛋白活性高，免疫效果好。

作为优选方案，所述水性高分子聚合物佐剂为Montanide Gel。

作为优选方案，所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。

水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂即构成本发明疫苗的佐剂Montanide Gel-Max。

作为优选方案，灭活的猪肺炎支原体破碎菌液，灭活前活菌数量不低于10⁹CCU/mL。

作为优选方案，灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液，灭活前活菌数不低于2.5×10⁹CCU/mL。

所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备方法，包括步骤：

1)采用灭菌的FBSM无机盐培养基培养毕赤酵母，甲醇诱导表达猪圆环病毒2型cap蛋白；利用发酵罐分别培养猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌；

2)分别灭活圆环cap蛋白浓缩纯化液和猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌浓缩液；

3)制备油相，将水性高分子聚合物佐剂灭菌备用；

4)制备水相，将复合多糖类免疫增强剂采用PBS溶液溶解，过滤除菌后后，加入经毕赤酵母表达获得且纯化的cap蛋白、灭活的猪肺炎支原体破碎液；

5)将步骤4)获得的水相置于乳化罐，搅拌下缓慢加入步骤3)制得的油相，搅拌均匀；

6)加入灭活的副猪嗜血杆菌菌液，搅拌均匀；

7)加入硫柳汞溶液，搅拌均匀，得所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗。

作为优选方案，猪圆环病毒2型抗原的制备方法为：

①将毕赤酵母细胞接种于培养基中进行种子培养；增殖后的种子液接种于发酵培养基中发酵；当菌液OD600为1.0时，加入甲醇诱导，收获菌液；

②酵母收获液经连续流离心去除上清，沉淀用0.01M PBS溶液重悬后破碎处理；破碎液经离心去除沉淀，收获上清；

③上清液经300KD超滤浓缩，获得猪圆环病毒2型抗原cap蛋白浓缩液；

④cap蛋白浓缩液经灭活处理，利用柱层析进行纯化。

作为优选方案，获取猪肺炎支原体抗原的方法为：

A)将猪肺炎支原体接种于支原体液体培养基中，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH下降至6.8时收获猪肺炎支原体菌液；

B)超滤浓缩猪肺炎支原体收获液，使得猪肺炎支原体活菌数达到10¹²-10¹³CCU/ml，加入原液体积1/2的0.01M的PBS缓冲液再次超滤，去除上清，菌体沉淀破碎处理，最后用0.01M的PBS重悬至原体积的1％；

C)将已浓缩的猪肺炎支原体破碎若干次，然后进行灭活处理。

作为优选方案，获取副猪嗜血杆菌抗原的方法为：

a)将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型、5型种子按1％量接种于TSB液体培养基，发酵罐中37℃，250转/分，培养16-18h，收获菌液；

b)采用切向流超滤菌体发酵液；菌体沉淀用等体积的含1％A试剂的0.01M的PBS溶液重悬，再次超滤去除上清，最后用PBS溶液重悬计数；

c)对超滤浓缩收获的菌体进行灭活处理。

作为优选方案，所述灭活处理加入终浓度为0.4％的甲醛溶液，置于2-8℃灭活处理24h，期间每隔2h摇匀一次。

本发明的有益效果为：

本发明提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，在预防此三种猪病，提高猪生产性能表现出明显优势。安全性试验表明，倍量及超量腹腔注射豚鼠后，连续观察一周，豚鼠精神状态良好，无死亡；超量免疫试验猪后，精神状态良好，无呕吐、注射部位红肿等异常临床反应。效力试验显示，免疫猪三联疫苗后，圆环抗体水平、支原体抗体水平及副猪嗜血杆菌抗体水平均能达到单苗水平，相互之间抗原组分无干扰。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为cap蛋白电泳图；其中，1：Marker；2:28kd标准蛋白；3-7为五批纯化后的cap蛋白。

图2本发明的三联苗对支原体强度攻毒后各组肺部病变减少率；

图3本发明的三联疫苗免疫仔猪与非免疫组平均日增重对照图；

图4为本发明的三联疫苗免疫仔猪与非免疫组转群成活率对照图；

图5本发明制备猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备，如图5所示：

1.猪圆环病毒2型半成品抗原制备

1)将优选的含有圆环病毒2型cap蛋白的真核表达质粒电转化至毕赤酵母细胞(X-33,购自购自美国Invitrogen公司)中。筛选出阳性克隆种子，接种于250ml的BMGY液体培养基中，30℃，250r/min振荡培养16h-24h；后将增殖的250ml种子液加入到灭菌的FBSM无机盐培养基中，在发酵罐中进行扩大培养。当菌液OD600为1.0时，加入1％的甲醇诱导80h-96h，收获菌液。

2)酵母收获液经连续流离心去除上清，沉淀用0.01M PBS溶液重选后破碎处理；破碎液经离心去除沉淀，收获上清；

3)上清液经300KD超滤浓缩，获得猪圆环病毒2型抗原cap蛋白浓缩液。

4)cap蛋白浓缩液经甲醛灭活处理，利用柱层析进行纯化。对洗脱的蛋白纯化液进行PAGE胶鉴定，结果表明纯化后cap蛋白纯度在90％以上，结果如图1所示。

5)纯化后的cap蛋白经BCA法测定蛋白浓度，加入终浓度0.4％的甲醛溶液，置于2-8℃灭活。

2.猪肺炎支原体半成品抗原制备

1)按照实验室现有工艺配方(MEM培养基4-8g/L、酵母粉3-7g/L、蛋白胨15-20g/L、葡萄糖5-12g/L、马血清蛋白冻干粉6-10g/L、转铁蛋白30-100μg/L、丙酮酸钠0.6-2.0g/L、氯化钠3-7g/L、磷酸二氢钾0.1-0.4g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、苯酚红0.005-0.02g/L)，配制猪肺炎支原体液体培养基，加入2％猪血清，用1M氢氧化钠调节培养液pH为7.5左右；

2)将猪肺炎支原体WH-39株(2016年从山东滨州分离的流行毒株)按照10％的量接种于支原体液体培养基，置37℃发酵罐培养36-48h，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，PH值下降至6.8时收获菌液；

3)超滤浓缩获取的猪肺炎支原体收获液，使得猪肺炎支原体活菌数达到10¹²-10¹³CCU/ml；加入原液体积1/2的0.01M的PBS缓冲液再次超滤，去除上清，菌体沉淀破碎处理，最后用0.01M的PBS重悬至原体积的1％；

4)加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，置于2-8℃灭活处理24h，期间每隔2h摇匀一次，保证灭活充分。

3.副猪嗜血杆菌半成品抗原的制备

1)将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型(BZ株，山东滨州分离获得)、5型(LZ株，来自山东省农科院)种子按1％量接种于TSB液体培养基，发酵罐中37℃，250转/分，培养16-18h，收获菌液；

2)采用切向流超滤菌体发酵液；菌体沉淀用等体积的含1％A试剂的0.01M的PBS溶液重悬，再次超滤去除上清，最后用PBS溶液重悬计数；

3)用0.4％的甲醛灭活上述超滤浓缩收获的菌体。

4.疫苗配制

1)制备油相，水性高分子聚合物Montanide Gel分装至灭菌瓶，121℃，30min高压湿热灭菌；

2)制备水相，用0.01M的PBS溶液溶解中药多糖复合物(黄芪多糖、灵芝多糖、玉竹多糖等其中一种或几种的组合物)，经0.45um、0.22um滤芯除菌过滤制备水相A溶液；向A溶液中加入灭活的酵母表达cap蛋白，使得cap蛋白含量≥150μg/ml，猪肺炎支原体蛋白浓度≥150μg/ml；

3)将水相加入乳化罐中，200转/分，搅拌30min；缓慢加入油相，使得佐剂终浓度为10％，300转/分，搅拌30分钟；后加入副猪嗜血杆菌灭活菌体，使得4型副猪嗜血杆菌菌体含量≥2.5×10⁹CFU/ml，5型副猪嗜血杆菌菌体含量均≥2.5×10⁹CFU/ml，180转/分，搅拌30min；

4)加入硫柳汞溶液，使得硫柳汞的终浓度为0.01％，搅拌均匀，得所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗。

实施例2猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的安全性检验

1.豚鼠安检：将180-220g的豚鼠分为两组，每组8只。其中试验组，每只豚鼠腹腔注射5ml猪三联疫苗；对照组每只豚鼠腹腔注射5ml生理盐水，连续观察7天，两组豚鼠全部健存，无局部或全身不良反应，结果如表1所示。

表1本发明的猪三联疫苗在豚鼠的安全检验结果

2.仔猪安检：筛选14-21天健康仔猪三窝，每窝选6头，颈部肌肉注射2ml本发明的猪三联疫苗，连续观察2小时，未见呕吐、呼吸急促等异常临床反应。连续观察14天，未见任何不良反应。

实施例3猪三联疫苗对圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌在小鼠上的攻毒保护效果

1.三联苗对圆环病毒2型攻毒保护效果

将30只18-22g的BALB/C小鼠饲喂适应一周，随即分成3组，即三联苗组、单圆环疫苗组和空白对照组。每只小鼠腹腔注射0.5ml疫苗，对照组注射同等剂量的PBS溶液，14天后，按照同等方法进行加强免疫，剂量为0.5ml/只。

BALB/c小鼠免疫后21日，连同对照小鼠10只，使用DBN-SX07株检验用毒(≥10^7.0TCID₅₀/ml)攻击，每只小鼠腹腔注射0.5ml，攻毒后21日，扑杀取脾脏进行病毒分离，分离到病毒即判为病毒分离阳性。脾脏研磨处理后接种Dulac细胞，利用免疫荧光判定是否感染细胞，连续传代三次，判定最终结果。

结果显示，猪三联攻毒组PCV2病毒分离阳性率1/10(9/10阴性)，对照组阳性率9/10，根据标准(对照组7/10以上病毒分离阳性，免疫组7/10以上病毒分离阴性，判定疫苗有较好的保护效果)，猪三联疫苗对小鼠有较好的保护效果，结果如表2所示。

表2用PVC2攻毒后各组小鼠病毒分离阳性率

注：—代表病毒分离阴性；+代表病毒分离阳性；

2.三联苗对副猪嗜血杆菌攻毒保护效果

将30只18-22g的BALB/C小鼠饲喂适应一周，随即分成3组，即三联苗组、副猪嗜血杆菌疫苗组和空白对照组。每只小鼠腹腔注射0.5ml，对照组注射同等剂量的PBS溶液，14天后，按照同等方法进行加强免疫，剂量为0.5ml。免后14d，进行攻毒，每只小鼠攻毒剂量为5×10⁹CFU/只，连续7天观察小鼠的存活情况。

结果表明，副猪嗜血杆菌攻毒小鼠后，攻毒剂量5×10⁹CFU/只，对照组100％死亡，单副猪嗜血杆菌疫苗组保护效果为80％，猪三联组保护效果也为80％，说明猪三联疫苗对副猪嗜血杆菌攻毒保护水平与单苗一致，结果如表3所示。

表3本发明的三联灭活疫苗副猪嗜血杆菌效力测定结果

实施例4猪三联疫苗对支原体在仔猪上的攻毒保护效果

筛选支原体抗体阴性的14-21天健康仔猪18头，分成三组，三联苗组、单支原体疫苗组、空白对照组；每组分别肌肉注射相应疫苗2ml,空白对照注射2ml生理盐水，14d后同样方法加强免疫一次。加免后14d，以支原体强毒CVCC354(兽药监察所)对各组进行攻毒，观察14d，无痛处死所有试验猪，统计各组肺部病变减少率。

结果显示，在支原体强毒攻毒后，空白对照组试验猪肺脏全部病变，肺部病变减少率为0％；支原体单苗组和猪三联疫苗组，肺部病变减少率相近，分别为86.5％和84.9％，说明三联苗效果与支原体单苗效果相当，结果如图2所示。

实施例5猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗对仔猪生产性能的影响

山东某规模化猪场(100头存栏母猪)，品系为二元，随机选取3个批次，每批次大约200头，分别在14日龄免疫圆支副三联苗，设置非免疫组，记录保育结束转育肥群时的重量(大约20kg以上)。结果显示，在保育期，圆支副三联灭活苗组仔猪平均日增重及转群成活率均高于非免疫组，如图3图4所示。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。