一种流感新冠联合疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种流感新冠联合疫苗及其制备方法 (Influenza new corona combined vaccine and preparation method thereof ) 是由 阮承迈 高春润 刘淑惠 高辉 李新旺 高金榜 张靖丽 崔艳 李凤凯 于 2021-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种流感新冠联合疫苗,包括以下质量浓度的原料：含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗1-100μg/mL；含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗1-50μg/mL；含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗1-50μg/mL；含B型流感病毒的流感亚单位疫苗1-50μg/mL；氢氧化铝溶液,其中铝离子在流感新冠联合疫苗中的终浓度为0.5-2.0mg/mL；余量为PBS磷酸缓冲液。制备方法：称取各原料；将四种疫苗分别用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合；按照等体积比例混合,即得。本发明为含铝佐剂的新型冠状病毒疫苗和含铝佐剂的流感亚单位疫苗的联合疫苗,联合后,两种抗原组分疫苗之间没有相互抑制,能很好兼容。(The invention discloses an influenza Xinguan combined vaccine, which comprises the following raw materials in mass concentration: 1-100 mug/mL of recombinant new crown vaccine containing RBD-Fc fusion protein; 1-50 mug/mL of influenza subunit vaccine containing H1N1 type influenza virus; 1-50 mug/mL of influenza subunit vaccine containing H3N2 type influenza virus; 1-50 mug/mL of influenza subunit vaccine containing B type influenza virus; the final concentration of aluminum ions in the influenza new crown combined vaccine is 0.5-2.0 mg/mL; the balance was PBS phosphate buffer. The preparation method comprises the following steps: weighing the raw materials; diluting the four vaccines with PBS phosphate buffer solution respectively, and mixing with aluminum hydroxide solution; mixing according to equal volume proportion. The combined vaccine of the novel coronavirus vaccine containing the aluminum adjuvant and the influenza subunit vaccine containing the aluminum adjuvant is combined, and after the combined vaccine is combined, two antigen component vaccines are not mutually inhibited, so that the two antigen component vaccines can be well compatible.)
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，更具体的说是涉及一种流感新冠联合疫苗及其制备方法。
背景技术
新冠肺炎传播速度快、病死率高，迫切需要一种有效的疫苗来控制这一大流行。
截至2020年12月，全球已有基于灭活疫苗、核酸疫苗(包括DNA疫苗和mRNA疫苗)、载体疫苗、蛋白亚单位疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗等6种不同技术路线的60个候选疫苗被批准进入临床试验，其中7个疫苗（灭活疫苗3个、mRNA核酸疫苗2个、载体疫苗2个）获批紧急使用或附合条件上市。
目前，新冠病毒蛋白亚单位疫苗共有18项进入临床试验，占进入临床试验疫苗的30%，是在研数量最多的疫苗类型。在这些疫苗中，一种NVX-CoV2373疫苗已经进入南非的IIb阶段试验和英国的III阶段试验，NVX-CoV2373含有一种稳定的全长尖峰蛋白，辅以专有的皂素佐剂。在I期试验的所有参与者中诱导了中和抗体，还观察到了佐剂的剂量节约效应。与安慰剂组和无佐剂组相比，辅以佐剂的试验组诱导的中和抗体效价显著升高。另一种进入III期试验的疫苗是安徽智飞龙康的重组新型冠状病毒疫苗，该疫苗没有使用全长S蛋白，而只含有SARS-CoV-2 S蛋白的RBD。到目前为止，还没有提供进一步的数据。
就在全球科学家积极研发新冠疫苗的时候，英国的一项研究发现，新冠肺炎患者体内的抗体会在数月内消失，而疫苗提供的抗体可能也会如此。因此，新冠病毒可能会和普通感冒一样让人们每年重复被感染。该研究者表示，感染通常会让身体产生最强的抗体反应，所以如果感染后的抗体水平在两到三个月后消退，疫苗可能也会如此。因此人们可能需要注射新冠疫苗加强针，持续加强免疫。
流感疫苗是指用来预防流行性感冒病毒引起的流行性感冒（简称流感）的疫苗，属自费接种疫苗。目前的流感疫苗是流感病毒灭活疫苗，由3种病毒组成。流感疫苗是预防和控制流感的主要措施之一，于流感流行季节前或期间进行预防接种，可以减少接种者感染流感的机会或者减轻流感症状。
由于新冠病毒可能存在的重复被感染特性，若能将流感疫苗与新冠疫苗进行联合开发制备，则可以节省大量的人力物力，利国利民。
佐剂是免疫佐剂的简称，即非特异性免疫增强剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。疫苗中加入佐剂，不仅能增强抗原的免疫原性，节省疫苗用量，还能扩大疫苗诱导免疫应答的范围，诱导交叉保护。铝佐剂是经典的人用流感疫苗佐剂，能提高抗原特异性抗体滴度，诱导强的体液免疫应答，但是铝佐剂在流感新冠联合疫苗中的应用还未见报道。
因此，如何提供一种含铝佐剂的流感新冠联合疫苗是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种流感新冠联合疫苗及其制备方法，以解决现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种流感新冠联合疫苗，包括以下质量浓度的原料：含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗，质量浓度为1-100μg/mL；含H1N1型流感病毒的亚单位疫苗，质量浓度为1-50μg/mL；含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗，质量浓度为1-50μg/mL；含B型流感病毒的流感亚单位疫苗，质量浓度为1-50μg/mL；氢氧化铝溶液，铝离子在流感新冠联合疫苗中的终浓度为0.5-2.0mg/mL；余量为PBS磷酸缓冲液。
进一步，上述含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗的质量浓度为5-80μg/mL。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选RBD-Fc融合蛋白
的重组新冠疫苗是具有新冠病毒SARS-CoV-2 S蛋白的受体结构域与人lgG Fc结构域融合的重组亚单位疫苗，该疫苗可以保护机体免受新冠病毒感染，Fc段可以促进抗原呈递，与其他类型的疫苗相比，该疫苗具有更高的安全性和更高的成本效益。
进一步，上述含H1N1型流感病毒的亚单位疫苗的质量浓度为5-20μg/mL；含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为5-20μg/mL；含B型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为5-20μg/mL。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选含H1N1型、H3N2型和B型的三价流感病毒亚单位疫苗是在流感病毒裂解疫苗的基础上，选用新裂解工艺和纯化技术制备出的高纯度流感疫苗，其抗原纯度达到85%以上，进一步去除了核蛋白和M蛋白，只保留具有免疫原性的抗原，接种副反应低，抗体上升快，维持时间长，具有很好的免疫效果，同时有更高的生物安全性。
进一步，上述氢氧化铝溶液中，铝离子在流感新冠联合疫苗中的终浓度为0.6-1.0mg/mL。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，氢氧化铝是一种铝佐剂，抗原通过表面吸附驻留在氢氧化铝表面，能够提高抗原特异性抗体滴度，诱导强的体液免疫应答，节省疫苗用量。FDA对在临床中使用的预防性疫苗铝佐剂含量设定为以铝离子计不超过0.85mg/剂，《中国药典》三部（2015版）规定，含铝佐剂的疫苗中铝含量最大值为1.04mg/mL，将氢氧化铝中铝离子与氢氧化铝的分子量之比为1:2.89进行折算，本发明的流感新冠联合疫苗中的铝离子终浓度为0.6-1.0mg/mL。
上述流感新冠联合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）按上述流感新冠联合疫苗的质量分数称取各原料；
（2）将含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，得到疫苗A，备用；
（3）将含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，得到疫苗B，备用；
（4）将含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，得到疫苗C，备用；
（5）将含B型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，得到疫苗D，备用；
（6）将疫苗B、疫苗C和疫苗D按照等体积比例混合后，再与疫苗A按照等体积比例混合，即得流感新冠联合疫苗。
进一步，上述氢氧化铝溶液的制备方法为：
①称取62.05g氯化铝和6.8g醋酸钠溶于1L蒸馏水中，通过0.2μm的过滤膜过滤除菌，得到溶液A，20-30℃储存备用；
②称取10.25g氢氧化钠溶于1L蒸馏水中，通过0.2μm的过滤膜过滤除菌，得到溶液B，20-30℃储存备用；
③将溶液B加入到混合容器中，然后以40-60rpm的速度连续搅拌，并加入无菌蒸馏水，得到溶液C；
④将溶液A以1-2L/min的速率加入溶液C中，并控制溶液pH值为5.5-6.5，得到溶液D；
⑤向溶液D中加入无菌蒸馏水调节至最终体积，并将悬浮液混合2h，最后加入5mol/L NaOH和/或5mol/L乙酸调整pH为5.9-6.1，即得氢氧化铝溶液。
更进一步，上述步骤③中，溶液B的加入量为氢氧化铝溶液体积的20%，无菌蒸馏水的加入量为氢氧化铝溶液体积的50-55%；上述步骤④中，溶液A的加入量为氢氧化铝溶液体积的20%。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供了一种含铝佐剂的新型冠状病毒疫苗和含铝佐剂的流感亚单位疫苗的联合疫苗，联合后，两种抗原组分疫苗之间没有相互抑制，能很好兼容。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法。
本发明所涉及的含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗原液以及含H1N1型、H3N2型和B型的三价流感病毒亚单位疫苗原液均由中逸安科生物技术股份有限公司提供。
实施例1
流感新冠联合疫苗，包括以下质量浓度的原料：含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗，质量浓度为80μg/mL；含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗，质量浓度为18μg/mL；含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗，质量浓度为18μg/mL；含B型流感病毒的流感亚单位疫苗流感病毒亚单位疫苗，质量浓度为18μg/mL；氢氧化铝溶液，铝离子在流感新冠联合疫苗中的终浓度为0.6mg/mL；余量为PBS磷酸缓冲液。
上述流感新冠联合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）按上述流感新冠联合疫苗的质量分数称取各原料；
其中，氢氧化铝溶液的制备方法为：
①称取62.05g氯化铝和6.8g醋酸钠溶于1L蒸馏水中，通过0.2μm的过滤膜过滤除菌，得到溶液A，25℃储存备用；
②称取10.25g氢氧化钠溶于1L蒸馏水中，通过0.2μm的过滤膜过滤除菌，得到溶液B，25℃储存备用；
③将溶液B（占最终氢氧化铝溶液体积的20%）加入到混合容器中，然后以50rpm的速度连续搅拌，并加入无菌蒸馏水（占最终氢氧化铝溶液体积的50%），得到溶液C；
④将溶液A（占最终氢氧化铝溶液体积的20%）以1L/min的速率加入溶液C中，并控制溶液pH值为6.0，得到溶液D；
⑤向溶液D中加入无菌蒸馏水调节至最终体积，并将悬浮液混合2h，最后加入5mol/L NaOH和/或5mol/L乙酸调整pH为6.0，即得氢氧化铝溶液；
（2）将含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗的质量浓度为80μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗A，备用；
（3）将含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为18μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗B，备用；
（4）将含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为18μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗C，备用；
（5）将含B型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含B型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为18μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗D，备用；
（6）将疫苗B、疫苗C和疫苗D按照等体积比例混合得到疫苗E，再与疫苗A按照等体积比例混合，即得流感新冠联合疫苗。
实施例2
流感新冠联合疫苗，包括以下质量浓度的原料：含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗，质量浓度为5μg/mL；含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗，质量浓度为20μg/mL；含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗，质量浓度为20μg/mL；含B型流感病毒的流感亚单位疫苗流感病毒亚单位疫苗，质量浓度为20μg/mL；氢氧化铝溶液，铝离子的终浓度为0.6mg/mL；余量为PBS磷酸缓冲液。
上述流感新冠联合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）按上述流感新冠联合疫苗的质量分数称取各原料；
其中，氢氧化铝溶液的制备方法为：
①称取62.05g氯化铝和6.8g醋酸钠溶于1L蒸馏水中，通过0.2μm的过滤膜过滤除菌，得到溶液A，25℃储存备用；
②称取10.25g氢氧化钠溶于1L蒸馏水中，通过0.2μm的过滤膜过滤除菌，得到溶液B，25℃储存备用；
③将溶液B（占最终氢氧化铝溶液体积的20%）加入到混合容器中，然后以50rpm的速度连续搅拌，并加入无菌蒸馏水（占最终氢氧化铝溶液体积的50%），得到溶液C；
④将溶液A（占最终氢氧化铝溶液体积的20%）以1L/min的速率加入溶液C中，并控制溶液pH值为6.0，得到溶液D；
⑤向溶液D中加入无菌蒸馏水调节至最终体积，并将悬浮液混合2h，最后加入5mol/L NaOH和/或5mol/L乙酸调整pH为6.0，即得氢氧化铝溶液；
（2）将含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含RBD-Fc融合蛋白的重组新冠疫苗的质量浓度为5μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗A，备用；
（3）将含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含H1N1型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为20μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗B，备用；
（4）将含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含H3N2型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为20μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗C，备用；
（5）将含B型流感病毒的流感亚单位疫苗用PBS磷酸缓冲液稀释后与氢氧化铝溶液混合，使得含B型流感病毒的流感亚单位疫苗的质量浓度为20μg/mL，铝离子的终浓度为0.6mg/mL，余量为PBS磷酸缓冲液，得到疫苗D，备用；
（6）将疫苗B、疫苗C和疫苗D按照等体积比例混合后得到疫苗E，再与疫苗A按照等体积比例混合，即得流感新冠联合疫苗。
性能测试
1、实施例1流感新冠联合疫苗免疫原性分析
选取SFP级6-8周雌性BALB/c小鼠25只，随机分为5组，各组分别通过腹腔注射的方式免疫实施例1制得的流感新冠联合疫苗（80μg/mL含铝佐剂的新冠疫苗＋18μg/mL含铝佐剂的流感亚单位疫苗）、实施例1制得的疫苗A（80μg/mL含铝佐剂的新冠疫苗）、实施例1制得的疫苗E（18μg/mL含铝佐剂的流感亚单位疫苗）和18μg/mL流感亚单位疫苗（与实施例1疫苗E的区别仅在于不含氢氧化铝溶液），同时做PBS磷酸缓冲液对照组，免疫体积为0.5mL。
初次免疫14天时以相同的疫苗蛋白浓度和体积加强免疫一次，初次免疫35天时，采集血液分离血清，通过血凝抑制法测定小鼠血清中的抗流感抗体
滴度。结果如表1所示。
表1 实施例1流感新冠联合疫苗免疫后抗流感抗体水平
组别
H1N1抗体均值（GMT）
H3N2抗体均值（GMT）
B抗体均值（GMT）
实施例1流感新冠联合疫苗
6144
8192
3584
实施例1疫苗A
<5
<5
<5
实施例1疫苗E
7424
6272
704
18μg/mL流感亚单位疫苗
4352
10240
224
PBS磷酸缓冲液对照组
<5
<5
<5
注：表1内值为血清稀释倍数（n=5）。
由表1可知，免疫后35天，与实施例1疫苗E免疫后相比，实施例1流感新冠联合疫苗免疫后，小鼠外周血血清中的抗流感抗体滴度中，H1N1型流感病毒抗体滴度稍微下降，H3N2型流感病毒抗体滴度稍微上升，B型流感病毒抗体滴度明显升高。以上试验说明，新冠疫苗组分对流感疫苗组分没有抑制作用。
免疫后35天后，与不含铝佐剂的18μg/mL流感亚单位疫苗免疫后相比，含铝佐剂的实施例1疫苗E免疫后，小鼠体内抗流感抗体滴度中，H1N1型流感病毒抗体滴度明显升高，H3N2型流感病毒抗体滴度稍微下降，B型流感病毒抗体滴度明显升高。以上试验说明，铝佐剂对流感疫苗有免疫促进作用。
2、实施例2流感新冠联合疫苗免疫原性分析
选取SFP级6-8周雌性BALB/c小鼠20只，随机分为4组，各组分别通过腹腔注射的方式免疫实施例2制得的流感新冠联合疫苗（5μg/mL含铝佐剂的新冠疫苗＋20μg/mL含铝佐剂的流感亚单位疫苗）、实施例2制得的疫苗A（5μg/mL含铝佐剂的新冠疫苗）和20μg/mL新冠疫苗（不含氢氧化铝溶液），同时做PBS磷酸缓冲液对照组，免疫体积为0.5mL。
初次免疫14天时以相同的疫苗蛋白浓度和体积加强免疫一次，初次免疫35天时，采集血液分离血清，通过小鼠抗新型冠状病毒（2019-nCoV）S-RBD蛋白IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）测定小鼠血清中的抗新冠抗体滴度。结果如表2所示。
表2 实施例2流感新冠联合疫苗免疫后抗新冠抗体水平
组别
抗新冠抗体水平（GMT）
实施例2流感新冠联合疫苗
4842
实施例2疫苗A
1902
20μg/mL新冠疫苗
1024
PBS磷酸缓冲液对照组
阴性
注：表2内值为血清稀释倍数（n=5）。
由表2可知，免疫后35天，与实施例2疫苗A免疫后相比，实施例2流感新冠联合疫苗免疫后，小鼠外周血血清中的抗新冠抗体滴度有明显升高。以上试验说明，流感疫苗各组分对新冠疫苗组分没有抑制作用。
与高剂量的20μg/mL新冠疫苗免疫后相比，含铝佐剂的5μg/mL低剂量新冠疫苗免疫后，小鼠体内抗新冠抗体滴度升高。以上试验说明，铝佐剂能节省疫苗用量，对疫苗有免疫促进作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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