大蒜素在制备用于预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的应用
阅读说明：本技术 大蒜素在制备用于预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的应用 (Application of allicin in preparation of medicine for preventing and/or treating toxoplasma pneumonia ) 是由 周文良 张艺林 邱卓尔 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及大蒜素新用途领域,公开了大蒜素在制备用于预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的应用,所述弓形虫性肺炎包括弓形虫感染引起的气道上皮炎症反应,所述药物的给药方式包括气道内雾化给药。本发明首次发现了大蒜素(又称大蒜辣素,Allicin)在制备预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的用途,通过大蒜素雾化给药的方式能够明显抑制弓形虫感染引起的气道炎症,尤其是弓形虫感染引起的气道上皮炎症反应,能有效缓解症状,避免肺部受损,并有效解决了现有药物疗法中存在的起效时间慢、无法有效缓解急性症状的难点问题。(The invention relates to the field of new application of allicin, and discloses application of allicin in preparing a medicament for preventing and/or treating toxoplasma pneumonia, wherein the toxoplasma pneumonia comprises airway epithelial inflammatory reaction caused by toxoplasma infection, and the administration mode of the medicament comprises intra-airway atomized administration. The invention discovers the application of Allicin (also called Allicin) in preparing the medicine for preventing and/or treating toxoplasma pneumonia for the first time, can obviously inhibit airway inflammation caused by toxoplasma infection, in particular airway epithelial inflammatory reaction caused by toxoplasma infection by an Allicin atomization administration mode, can effectively relieve symptoms, avoid lung damage, and effectively solve the difficult problems of slow onset time and incapability of effectively relieving acute symptoms in the existing pharmacotherapy.)
技术领域
本发明涉及大蒜素新用途领域，特别是涉及大蒜素在制备用于预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的应用。
背景技术
弓形虫性肺炎，又称肺弓形虫病，是由刚地弓形虫(T.Gondii)引起的人畜共患疾病，呈世界性分布。猫科动物是弓形虫的唯一终末宿主，弓形虫卵囊会随着猫科动物的粪便一同排出体外。当卵囊混入灰尘后，可直接经肺部感染包括人在内的所有哺乳动物。弓形虫感染可导致多器官损伤，导致包括急性或慢性呼吸道感染，出现弓形虫性肺炎和支气管肺炎等病症。在免疫力正常时，弓形虫性肺炎患者多呈隐性感染而不致出现明显的临床症状。然而，患者一旦受其它疾病的侵害(如艾滋病)或免疫力降低时，则可导致急性弓形虫性肺炎。
急性刚地弓形虫性肺炎患者临床表现严重、病情发展迅速、诊断困难、病死率高。弓形虫性肺炎呈不规则发热，伴关节痛，轻至中度咳嗽，短暂胸痛，X线胸片表现为间质性肺炎或合并胸膜炎、胸腔积液，用高级抗菌素无明显疗效，只可采用针对弓形虫的特异性治疗。目前常见的治疗手段是通过药物来抑制弓形虫的复制繁殖，但是这种治疗手段的起效时间长，且无法有效缓解弓形虫性肺炎急性发病的严重症状。因此，临床急需更深入了解弓形虫性肺炎发生及发展的分子机理，寻找新的有效治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供大蒜素在制备用于治疗弓形虫性肺炎药物中的应用，通过深入研究弓形虫性肺炎的发生及发展分子机理，获得新的有效治疗弓形虫性肺炎的药物。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
大蒜素在制备用于预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的应用。
大蒜素(Allicin)是从葱科葱属植物大蒜的鳞茎(大蒜头)中提取的一种有机硫化合物，也存在于洋葱和其它葱科植物中，学名为二烯丙基硫代亚磺酸酯，化学式为C6H10OS2，CAS号：8008－99－9，化学结构式如下：
大蒜素有较强的抗菌作用，在极低浓度时即可抑制多种革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌，对霉菌、病毒、原虫、蛲虫等也有抑制作用，对大肠杆菌、痢疾杆菌的抑制效果明显。
作为上述方案的进一步改进，所述弓形虫性肺炎包括弓形虫感染引起的气道上皮炎症反应。
作为上述方案的进一步改进，所述药物含有大蒜素以及其药学上可接受的辅料。
作为上述方案的进一步改进，所述药物的剂型包括雾化剂型。
作为上述方案的进一步改进，所述药物的给药方式为气道内雾化给药。
作为上述方案的进一步改进，所述药物的剂型还包括片剂、胶囊剂、口服液体剂、口服颗粒剂或口服散剂。
本发明第二方面在于提供一种用于预防和/或治疗弓形虫性肺炎的药物，包括大蒜素以及其药学上可接受的辅料。
作为上述方案的进一步改进，所述弓形虫性肺炎包括弓形虫感染引起的气道上皮炎症反应。
作为上述方案的进一步改进，所述药物的剂型包括雾化剂型，给药方式为气道内雾化给药。
作为上述方案的进一步改进，所述药物的剂型还包括片剂、胶囊剂、口服液体剂、口服颗粒剂或口服散剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明首次发现了大蒜素(又称大蒜辣素，Allicin)在制备预防和/或治疗弓形虫性肺炎药物中的用途，通过大蒜素雾化给药的方式能够明显抑制弓形虫感染引起的气道炎症，尤其是弓形虫感染引起的气道上皮炎症反应，能有效缓解症状，避免肺部受损，并有效解决了现有药物疗法中存在的起效时间慢、无法有效缓解急性症状的难点问题。
附图说明
图1是本发明实施例1中各组的气道上皮细胞促炎细胞因子IL1B表达水平统计图；
图2(a)～(d)是本发明实施例1中的促炎细胞因子Il1b、Il6、Cxcl2、Tnf表达水平统计图；
图3(a)～(c)是本发明实施例1中各组的肺部炎症细胞浸润情况图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行，实施例中所用的各种常用化学试剂或样品，如无特别说明，均为市售产品。
本发明首次将大蒜素用于制备预防和/或治疗弓形虫性肺炎的药物，经细胞实验结果显示，大蒜素(Allicin)可以降低弓形虫感染引起的气道上皮细胞促炎细胞因子IL1B表达上调，表明大蒜素具有抗弓形虫所引起的气道炎症的作用；经体实验结果显示，大蒜素(Allicin)可抑制因弓形虫感染引起的促炎细胞因子Il1b、Il6、Cxcl2、Tnf表达上调与肺部炎症细胞浸润，表明大蒜素具有抗弓形虫性肺炎的作用。
在其中一个示例中，所述药物含有大蒜素以及其药学上可接受的辅料，所述大蒜素的化学结构式如下：
可以理解的是，本发明实施例所述的药物还可以通过添加不同的药物学上可接受的辅料从而制备成各种合适的临床剂型，这些临床剂型包括但不限于如下的剂型：片剂、胶囊剂、口服液体剂、口服颗粒剂或口服散剂等。所述的药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、润湿剂、黏合剂、闪崩剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、防腐剂、pH调节剂等。进一步地，稀释剂，包括如淀粉、蔗糖、纤维素类、无机盐类等；润湿剂，包括如水、乙醇等；黏合剂，包括如淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮、聚乙二醇等；崩解剂，包括如淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、联羧甲基纤维素钠、表面活性剂等；润滑剂，包括如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、聚乙二醇等；色香味调味剂，包括如色素、甜味剂、香料、胶浆剂等；溶剂，包括如水、甘油、乙醇等；增溶剂，包括如吐温类、卖泽类、硫酸化物、磺酸化物等；助溶剂，包括如有机酸(如枸橼酸)及其盐类、无机盐、聚乙二醇等；乳化剂，包括如司盘类、甘油脂肪酸酯、阿拉伯胶、明胶、琼脂、海藻酸钠等；抗氧剂，包括如亚硫酸盐、抗坏血酸、没食子酸及其盐类等；金属络合剂，包括如乙二胺四乙酸二钠、多羧酸化合物等；防腐剂，包括如尼泊金类、季铵类化合物、醋酸氯己定等；pH调节剂，包括如盐酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、枸橼酸盐等。
可以理解的是，本发明实施例所述的药物，基于不同的辅料、不同的剂型，相应的，其给药的方式也可以多样。
但特别说明，本发明实施例所述的药物优选剂型为雾化剂型，优选的给药方式为气道内雾化给药。
本发明拓展了大蒜素(Allicin)气道内雾化给药的新用途，为大蒜素应用于缓解弓形虫感染引发的肺部炎症的治疗提供了理论依据。如弓形虫肺炎患者可使用大蒜素(Allicin)雾化给药，缓解肺部炎症症状。与目前抗弓形虫的药物相比，大蒜素(Allicin)起效时间快，安全可靠，且给药操作方便。
实施例1：
1、材料与方法
1.1实验动物及实验分组
SPF级KM小鼠，雄性，周龄3～4周，体重25～30g，购自中山大学实验动物中心。实验共分3组，分别为阴性对照组(Control组)、模型组(T.Gondii组)、治疗组(T.Gongii+Allicin组)。其中，模型组给予T.Gondii(剂量为1×104个虫体/只动物，感染时间为7天)感染；治疗组在T.Gondii(剂量为1×104个虫体/只动物，感染时间为7天)感染后第1、3、5、7天气道雾化给予Allicin(剂量为200μM)处理30min。
1.2细胞及实验分组
人气道上皮细胞株BEAS－2B，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。实验共分4组，分别为阴性对照组(Control组)、模型组(T.Gondii组)、治疗组(T.Gongii+Allicin组)和药物对照组(Allicin组)。其中，模型组给予T.Gondii(剂量为MOI＝10，感染时间为12h)感染；治疗组在T.Gondii(剂量为MOI＝10，感染时间为12h)感染10h后，施加Allicin(剂量为200μM)处理2h；药物对照组给予Allicin(剂量为200μM)处理2h。
1.3实验试剂
SteadyPure Universal RNA Extraction Kit通用型RNA提取盒(AG21017)；EvoM－MLV反转录试剂盒II(AG11711)；SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(AG11701)，以上均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。大蒜素(allicin)(HY－N0315－50mg)购自MedChem Express公司。
1.4实时荧光定量PCR(Real－time quantitative PCR，qPCR)
为检测样本中目的基因的表达情况，利用SYBR Green I荧光染料对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)循环后产物总量进行测量，具体方法如下：
1)RNA的提取
使用离心柱型RNA提取试剂盒SteadyPure Universal RNA Extraction Kit通用型RNA提取盒(AG21017)，按照说明书中的操作指南对样本中的总RNA进行提取。获取RNA溶液后可通过使用分光光度计对RNA样品的浓度与纯度(以样品的OD 260/280值来判断)进行检测，并可通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
2)反转录
使用可以除去基因组DNA的反转录试剂盒Evo M－MLV反转录试剂盒II(AG11711)，按照说明书中的操作指南将样本中mRNA反转录为cDNA。得到的cDNA样品溶液保存于－80℃。
3)qPCR
使用SYBR Green I检测体系对步骤2)获得的cDNA中目的基因的相对含量进行检测。具体操作步骤为：
首先，设计合成IL1B、Il1b、Il6、Cxcl2、Tnf、HPRT1、Hprt1等目的基因的寡核苷酸引物片段(如表1所示)。
表1－目的基因的寡核苷酸引物信息
实验开始时，于冰上配制qPCR反应液(反应体系如表2所示)。
表2－qPCR反应液
反应液配制完成后，将其加至384孔板中。随后，用RNase Free H2O将步骤2)中所得的cDNA样品溶液进行稀释，稀释比例通常为1：2至1：10，具体比例可根据模板cDNA量进行调整。稀释完成后，将样品点样至384孔板中，每孔1μL。
点样完成后，封板，3000g离心5min。然后按以下反应条件进行qPCR反应：
阶段1：预变性
95℃30s；
阶段2：PCR反应(×40个循环)
95℃5s；
58℃10s；
73℃30s(信号采集)。
阶段3：融解曲线分析
反应完成后，使用二阶最大求导法获得各样本的循环阈值(cycle threshold，Ct)，并通过2-△△Ct法对目的基因的表达水平进行相对定量分析。
1.5石蜡切片与HE染色
1)取材：新鲜组织用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出后在通风橱内用手术刀将目的部位组织修理平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
2)脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次用梯度酒精进行脱水。75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯5～10min，二甲苯I 5～10min，二甲苯II 5～10min，65℃融化石蜡I 1h，65℃融化石蜡II 1h，65℃融化石蜡III 1h。
3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将熔化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框中并贴上对应的标签。之后于－20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4)切片：将修整好的蜡块，放入－20℃冻台冷却，再将冷却的蜡块置于石蜡切片机中切片，切成厚度4μm的薄片。将切片漂浮于摊片机上，用40℃温水将组织展平，之后用载玻片将组织捞起，于60℃烘箱内烤片。将水烤干、蜡烤化后取出，常温保存备用。
5)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 20min、二甲苯II 20min、无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、75％酒精5min、自来水洗。
6)苏木素染色：将切片放入苏木素染液中染3～5min，之后依次用自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，最后再用流水冲洗。
7)伊红染色：将切片依次放入85％、95％的梯度酒精中脱水各5min，再放入伊红染液中染色5min。
8)脱水封片：将切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇III5min、二甲苯I 5min、二甲苯II 5min，最后用透明中性树胶封片。
9)显微镜镜检，图像采集分析。
1.6数据处理
实验数据由平均值±标准差(mean±SD)的方式呈现。对于三组或以上数据，采用单因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)并使用Bonferroni法进行事后检验。设置P＜0.05为显著性差异。
2、实验结果
2.1大蒜素(Allicin)可降低弓形虫感染引起的气道上皮细胞炎症
如图1细胞实验(具体实验过程参见上述1.2细胞及实验分组)结果显示，大蒜素(Allicin)可以降低弓形虫感染引起的气道上皮细胞促炎细胞因子IL1B表达上调，表明了大蒜素具有抗弓形虫所引起的气道炎症的作用。
2.2大蒜素(Allicin)具有抗小鼠弓形虫性肺炎的作用
如图2(a)～(d)和图3(a)～(c)的体实验(具体实验过程参见上述1.1实验动物及实验分组)结果显示，弓形虫感染小鼠后，在第1、3、5、7天雾化给药大蒜素，可抑制因弓形虫感染引起的促炎细胞因子Il1b、Il6、Cxcl2、Tnf表达上调与肺部炎症细胞浸润情况，表明大蒜素具有抗弓形虫性肺炎的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。