黄芩素纳米制剂及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 黄芩素纳米制剂及其制备方法与应用 (Baicalein nanometer preparation and its preparing method and use ) 是由 丁文雅 张忠斌 王洋 王刚 郑家欣 罗美娇 李雨洋 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黄芩素纳米制剂,所述纳米制剂由黄芩素负载在壳聚糖-环糊精接枝聚合物上制备而成。本发明还公开了一种黄芩素纳米制剂的制备方法,包括以下步骤：1)用无水乙醇配置黄芩素标准溶液；2)配置壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液；3)往所述壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液中加入步骤1)配置的黄芩素标准溶液,搅拌,旋转蒸发去除乙醇,用超声波细胞破碎仪超声处理,离心后取上清,获得所述黄芩素纳米制剂。本发明还公开了所制备的黄芩素纳米制剂的应用,用于消除金黄色葡萄球菌生物被膜。本发明制备的黄芩素纳米制剂具有能够破坏生物被膜结构,增强药物生物被膜渗透性以及提高药物对被膜菌的杀灭能力等特点。(The invention discloses a baicalein nanometer preparation which is prepared by loading baicalein on a chitosan-cyclodextrin graft polymer. The invention also discloses a preparation method of the baicalein nanometer preparation, which comprises the following steps: 1) preparing baicalein standard solution with anhydrous ethanol; 2) preparing a chitosan-cyclodextrin graft polymer solution; 3) adding the baicalein standard solution prepared in the step 1) into the chitosan-cyclodextrin graft polymer solution, stirring, performing rotary evaporation to remove ethanol, performing ultrasonic treatment by using an ultrasonic cell disruption instrument, centrifuging, and taking a supernatant to obtain the baicalein nanometer preparation. The invention also discloses application of the prepared baicalein nanometer preparation for eliminating staphylococcus aureus biofilm. The baicalein nanometer preparation prepared by the invention has the characteristics of being capable of destroying the biofilm structure, enhancing the permeability of the drug biofilm, improving the killing capacity of the drug to the tunica mucosa bacteria and the like.)
技术领域
本发明属于中药制剂领域。更具体地说，本发明涉及黄芩素纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，简称金葡菌，是一种非运动性、凝固酶阳性的硬壁类球菌，为革兰氏阳性菌(Gram positive)。根据感染人群和场所的不同，金黄色葡萄球菌感染常表现出不同的临床症状。金黄色葡萄球菌多作为条件性致病菌，与人体皮肤菌群、鼻粘膜菌群共生，在医院内感染患者中，约有40％的感染病例与金黄色葡萄球菌有关，临床表现为化脓性肌炎、坏死性肺炎等炎症。而目前国内外学者认为，金黄色葡萄球菌之所以有极大的致病性和抗逆性，是因为其在体内外形成生物被膜，而这种生物被膜为金黄色葡萄球菌提供了保护性的生活方式，从而增加了细菌的耐药性和持续感染性。
细菌生物被膜(Bacterial Biofilms,BBF)是指由细菌自身形成的多糖蛋白聚合物、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹形成的细胞形态的结构菌落，其形如膜状，并且能够不可逆地附着于固体支持物上，细菌生物被膜的形成使细菌对各种因素的抵抗力增强了，能够引发许多持续性和慢性细菌感染。金黄色葡萄球菌感染的疾病存在反复感染、治愈困难的现象，其重要原因是金黄色葡萄球菌易形成生物被膜，当细菌形成生物被膜后，它对抗生素和宿主免疫具有很强的抗性，会出现慢性感染的临床症状。
普通的金黄色葡萄球菌感染经鉴定后可进行有效的治疗，然而一旦形成生物被膜，则治疗难度急剧增大。据报道，2006-2007年间，由金黄色葡萄球菌生物被膜引发的感染占美国医疗器材感染的56％。近年来，随着医疗技术的发展，留置医疗设备已成为现代医疗保健必不可少的组成部分，而这些植入医疗器械如植入的人造心脏瓣膜，导管和关节假体等将成为细菌生物被膜的重要定植部位。因此，研究开发能够有效消除细菌生物被膜药物制剂将对被膜病的临床治疗具有重要意义。
目前治疗因金黄色葡萄球菌感染引发的疾病首选抗生素，但是过多的使用抗生素容易使人体产生较大的依赖性与毒性，因此利用中药抗菌药治疗相关感染性疾病成为当今科研界的热门话题。黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科黄芩属多年生草本的干燥根，具有清热燥湿、清热泻火、清热解毒、止血、安胎的功效。现代研究表明黄芩具有较好的感染类疾病治疗效果，如尿路感染、呼吸道感染的治疗，其主要有效成份为黄酮类化合物，如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等，其中黄芩具有较强的抗菌、抗病毒作用。付璟等的研究表明黄芩素具有一定的体外抗菌与体内抗炎作用；张涛等的研究表明黄芩素具有抑菌效果；姜茗宸等研究表明黄芩素具有显著的抗病毒作用；张春辉等的研究表明黄芩素对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌均具有抗菌活性。可见，黄芩素因具有明显的抗菌效果和多种药效作用广泛应用于细菌感染的疾病中。但因黄芩素自身具有较强的疏水性和较高亲脂性的特点，使其存在药物溶解度低，治疗效果不理想等问题。因此，提高黄芩素水中溶解度、增强药物治疗效果，将对此药的临床应用具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种黄芩素纳米制剂，其能够破坏生物被膜结构，增强药物生物被膜渗透性以及提高细菌药物摄取能力。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种黄芩素纳米制剂，所述黄芩素纳米制剂由黄芩素负载在壳聚糖-环糊精接枝聚合物上制备而成。
优选的是，所述黄芩素纳米制剂的平均粒径为420～440nm，Zeta电位为40～50mV。
所述的黄芩素纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)用无水乙醇配置黄芩素标准溶液；
2)配置壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液；
3)往所述壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液中加入步骤1)配置的黄芩素标准溶液，搅拌，旋转蒸发去除乙醇，用超声波细胞破碎仪超声处理，离心后取上清，获得所述黄芩素纳米制剂。
优选的是，黄芩素标准溶液的浓度为1-5mg/mL。
优选的是，称取壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶解于体积分数为2％的冰醋酸中，配置成浓度为5-10mg/mL的壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液。
优选的是，步骤3)中，利用超声波细胞破碎仪超声处理10-20min。
优选的是，步骤3)中，在4000-5000r/min离心5-20min。
所述的黄芩素纳米制剂的应用，用于消除金黄色葡萄球菌生物被膜。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明的黄芩素纳米制剂可以明显提高药物对金黄色葡萄球菌生物被膜内细菌的杀伤效果，增强药物消除金黄色葡萄球菌生物被膜作用。
第二、本发明以壳聚糖-环糊精接枝聚合物(Chitosan grafted withβ-cyclodextrin，CD-CS)为载体，黄芩素为药物通探头超声制备而成，增加了药物的溶解性，并且利用CS-CD影响细胞壁的通透性，破坏生物被膜结构，增强药物生物被膜渗透性以提高细菌对药物摄取的能力。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明制备的黄芩素纳米制剂粒径的粒径分布图；
图2为本发明制备的黄芩素纳米制剂的电位分布图；
图3为本发明制备的黄芩素纳米制剂对金黄色葡萄球菌生物被膜消除情况图；
图4为本发明制备的黄芩素纳米制剂与细菌不同孵育时间对金黄色葡萄球菌生物被膜消除情况图；
图5说明的是菌落计数法考察黄芩素纳米制剂对被膜菌的杀伤情况图；
图6说明的是激光共聚焦法考察黄芩素纳米制剂对被膜菌的杀伤情况图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一种黄芩素纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)称取黄芩素放于10mL容量瓶，用无水乙醇定容，配成2mg/mL黄芩素标准溶液；
2)称取载体材料壳聚糖-环糊精接枝聚合物(CS-CD)30mg放于烧杯中，加2％冰醋酸5mL，于恒温搅拌器上在室温条件下搅拌溶解，获得壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液；
3)往所述壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液中缓慢滴加2mg/mL的黄芩素溶液，继续室温状态下搅拌5h；旋蒸除去乙醇，用纯水定容至5mL；利用超声波细胞破碎仪探头超声15min(超声2s/间隙2s)，然后将超声处理后的溶液用低速离心机离心，4000r/min离心10min，取出上清液，即得到黄芩素纳米制剂。
实施例2
一种黄芩素纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)称取黄芩素放于10mL容量瓶，用无水乙醇定容，配成1mg/mL黄芩素标准溶液；
2)称取载体材料壳聚糖-环糊精接枝聚合物(CS-CD)25mg放于烧杯中，加2％冰醋酸5mL，于恒温搅拌器上在室温条件下搅拌溶解，获得壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液；
3)往所述壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液中缓慢滴加1mg/mL的黄芩素溶液，继续室温状态下搅拌5h；旋蒸除去乙醇，用纯水定容至5mL；利用超声波细胞破碎仪探头超声10min(超声2s/间隙2s)，然后将超声处理后的溶液用低速离心机离心，5000r/min离心5min，取出上清液，即得到黄芩素纳米制剂。
实施例3
一种黄芩素纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)称取黄芩素放于10mL容量瓶，用无水乙醇定容，配成5mg/mL黄芩素标准溶液；
2)称取载体材料壳聚糖-环糊精接枝聚合物(CS-CD)50mg放于烧杯中，加2％冰醋酸5mL，于恒温搅拌器上在室温条件下搅拌溶解，获得壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液；
3)往所述壳聚糖-环糊精接枝聚合物溶液中缓慢滴加5mg/mL的黄芩素溶液，继续室温状态下搅拌5h；旋蒸除去乙醇，用纯水定容至5mL；利用超声波细胞破碎仪探头超声20min(超声2s/间隙2s)，然后将超声处理后的溶液用低速离心机离心，4500r/min离心20min，取出上清液，即得到黄芩素纳米制剂。
实施例4
实施例1-3中所用的壳聚糖-环糊精接枝聚合物的合成方法包括以下步骤：
a)往6.5mL二甲基亚砜中加入2.5g环糊精，将3.75g对甲基苯磺酰氯溶解于6mL的二甲基亚砜中，并逐滴滴入环糊精溶液中，在45℃的条件下搅拌24h，加入30mL的丙酮，溶液结晶释出白色沉淀物，过滤并用预冷的丙酮洗涤，获得单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精(6-OTs-β-CD)；
b)0.25g壳聚糖(摩尔质量150KD，脱乙酰度大于90％)溶解于体积分数为1％的醋酸溶液中，并加入步骤a)制备的6-OTs-β-CD，在45℃的条件下搅拌48h，然后在去离子水中透析7d，冷冻干燥，获得所述壳聚糖-环糊精接枝聚合物。
试验一黄芩素纳米制剂的粒径和电位检测
取实施例1制备的黄芩素纳米制剂1mL放于马尔文粒径、电位样品池中对其粒径及电位进行测量，结果表明，黄芩素纳米制剂的平均粒径为420～440nm，Zeta电位为40～50mV。黄芩素纳米制剂的粒径分布如图1所示，电位图如图2所示。
试验二不同浓度黄芩素纳米制剂对生物被膜消除情况的影响
挑取金黄色葡萄球菌单菌落接种于TSB液体培养基中，37℃恒温孵育，将对数生长期的菌液稀释至1x106cfu/mL，96无菌微孔板中每孔加入100μL稀释菌液，恒温培育24h；吸除菌液，孔中加入100μL 10倍最小抑菌浓度(MIC，浓度为12.5μg/mL)、6倍MIC、4倍MIC和2倍MIC浓度的实施例1制备的黄芩素纳米制剂，37℃恒温孵育12h，通过结晶紫染色法利用酶标仪在595nm处测定OD值，考察不同浓度黄芩素纳米制剂对金黄色葡萄球菌生物被膜的消除能力，结果如图3所示。黄芩素纳米制剂与黄芩素溶液组、阴性对照组对比具有显著性差异，黄芩素纳米制剂显著提高药物对金黄色葡萄球菌生物被膜的消除作用
试验三不同孵育时间对黄芩素纳米制剂消除生物被膜的影响
挑取金黄色葡萄球菌接种于TSB液体培养基中，37℃恒温孵育，将对数生长期的菌液稀释至1x106cfu/mL，96无菌微孔板中每个孔中加入100μL稀释菌液，恒温培育24h；吸除菌液，孔中加入100μL 6倍MIC浓度的黄芩素纳米制剂(实施例1制备)，37℃分别恒温孵育3h、6h、12h，通过结晶紫染色法测定595nm处OD值，测定不同孵育时间对黄芩素纳米制剂消除金黄色葡萄球菌生物被膜能力，结果如图4所示。与空白菌液对比黄芩素纳米制剂在3h时对金黄色葡萄球菌生物被膜明显的消除作用，相较于黄芩素溶液组效果显著，随着作用时间的延长，消除效果的变化极其微小。
试验四菌落计数法考察黄芩素纳米制剂对生物被膜菌的抑制情况
挑取金黄色葡萄球菌单菌落接种于TSB液体培养基中，37℃恒温孵育，将对数生长期的菌液稀释至1x106cfu/mL，将菌液稀释至1x106cfu/mL，96无菌微孔板每个孔中加入100μL稀释菌液，恒温孵育24h；吸除菌液，加入黄芩素纳米制剂(75μg/mL)(实施例1制备)，恒温孵育3h，同时设置原料药对照组和阴性对照组。移除溶液，加入一定体积的无菌生理盐水，小心刮下生物被膜装入5mL容量瓶中，用无菌生理盐水定容，转移至EP管中，无菌环境下超声波破碎仪超声1.5min。将超声过的菌悬液用无菌生理盐水采用等量递加法进行稀释，制剂组、黄芩素对照组与菌液对照组稀释104、106、108倍。将稀释好的菌悬液取3mL倒入熔化冷却至45℃的45mL肉膏蛋白琼脂培养基中，旋转摇匀后快速倒入平皿中，冷却固化后封好封口膜，恒温培养24h后，肉眼菌落平板计数，计算各组试剂菌落数，结果如图5所示。空白菌液组的菌落数远远高于制剂组与原料药组；黄芩素纳米制剂与黄芩素溶液组之间，其菌落数相对减少了55倍；黄芩素纳米制剂组菌落数、黄芩素溶液组与空白菌液组相比具有显著性差异(P＜0.01)。
试验五Live&Dead试剂盒观察制剂对生物被膜的渗入杀菌情况
挑取金黄色葡萄球菌单菌落接种于TSB液体培养基中，37℃恒温孵育，将对数生长期的菌液稀释至1x106cfu/mL，无菌玻璃培养皿中加入500μL稀释菌液，恒温培育24h；吸除菌液，加入黄芩素纳米制剂(实施例1制备)(75μg/mL)500μL，恒温孵育3h，并设置原料药对照组。移除溶液，纯水冲洗3遍，在避光环境下将稀释好的染色液500μL加入无菌玻底培养皿中，包上锡纸，黑暗中孵育15min后，利用LSCM(激光共聚焦扫描显微镜)观察黄芩素纳米制剂对金黄色葡萄球菌的致死情况，结果如图6所示。6-a为黄芩素原料药对照组，6-b为黄芩素纳米制剂组，原料药对照组的致死率仅有8.77％，而黄芩素纳米制剂组的致死率高达66.55％，黄芩素纳米制剂组对金黄色葡萄球菌生物被膜中的被膜菌的致死效果显著强于原料药黄芩素溶液组。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。