具体实施方式

通常，本文使用的术语和短语具有其领域公认的含义，其可以通过 参考标准文本、期刊参考文献和本领域技术人员已知的上下文找到。提 供以下定义以阐明它们在本说明书上下文中的具体用途。

“氨基酸”是蛋白的分子构建块。“氨基酸残基”是蛋白链或肽的最 简单的离散单元或单体。

在本说明书的上下文中，术语“基本上纯化的”是指至少50％，优 选至少70％，更优选至少85％，还更优选至少95％的纯度状态，并且其 中具有生理活性的肽在基本上不存在具有生理活性的其它肽或蛋白的情 况下存在。

具有保守氨基酸取代的肽在本发明的范围内。蛋白和肽化学的公认 原理是，在不改变蛋白或肽的构象或功能的情况下，通常可以在蛋白或 肽中进行称为“保守”氨基酸取代的某些氨基酸取代。这些改变包含用 异亮氨酸(L)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)中的任一种取代这些氨基酸中 的任一种；天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q) 取代天冬酰胺(N)，反之亦然；丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。 上述取代不是唯一可以被认为是“保守”的氨基酸取代。其它取代也可 以被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境。例如，甘氨酸(G)和 丙氨酸(A)通常可以互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可以互换。 甲硫氨酸(M)相对疏水，通常可与亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)互换， 有时可与缬氨酸(V)互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)在其氨基酸残 基的显著特征是两个氨基酸残基的不同pK值不显著，其电荷位置经常是 可互换的。当半胱氨酸形成二硫键的能力是不期望的或不需要时，半胱 氨酸(C)通常可以被丝氨酸(S)替代。其它变化在特定环境中可被认 为是“保守的”。

编码肽的核酸

本文公开的肽可以由分离的核酸编码。如本文所用，术语“核酸” 包含DNA和RNA两者以及单链和双链形式两者；如果是双链的，也包 含DNA-RNA杂合体。根据普遍接受的碱基配对沃森-克里克法则，单链 核酸序列的列举还包含其互补体。编码这些肽的核酸可以是DNA或 RNA；然而，在许多应用中，优选DNA。

术语“分离的”在本文中用于表示核酸以与不编码本文公开的肽的 核酸分子基本上分离的形式存在。在本说明书的上下文中，术语“分离 的”是指至少50％，优选至少70％，更优选至少85％，并且还更优选至 少95％的纯度状态。

然而，可以将核酸掺入到更大的核酸分子中，例如用于转染合适的 宿主细胞和产生肽的载体(vector)，并且术语“分离的”不应被解释为 排除这种掺入到天然不存在的更大的、基因工程化的分子中。

根据常规三联遗传密码选择核酸序列以编码特定肽的氨基酸序列。 由于由核酸序列中的三联密码子指定氨基酸的遗传密码是兼并的，而且 许多氨基酸由不止一个密码子指定，所以可以使用密码子的所有可能替 代。然而，在一些情况下，核酸序列的转录和/或翻译效率可受到密码子 选择的影响。在这种情况下，优选使用能提高核酸序列转录和/或翻译效 率的密码子。

载体和宿主细胞

还考虑了包括与至少一个影响DNA表达的控制元件可操作连接的 DNA的载体。这些控制元件可以是启动子、操纵子、增强子或其它影响 DNA表达的核酸序列。载体可以衍生自原核或真核来源。载体可以包括 染色体、非染色体或合成DNA序列的序列。通常，这些载体包含一个或 多个克隆位点，克隆位点含有易于被特异性限制性核酸内切酶切割的限 制性核酸内切酶序列。通常优选这些限制性核酸内切酶产生粘性或“粘 性的”末端，以更有效地克隆所需序列。一些合适的原核克隆载体包含 来自大肠杆菌的质粒，例如colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM 或RP4。原核载体还包含噬菌体DNA的衍生物如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。可以使用其它载体，例如杆状病毒载体。

有用的表达控制序列的实例是lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、 λ噬菌体的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖酵 解启动子(例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子)、酵母酸性磷酸酶的启动子 (例如Pho5)、酵母α交配因子的启动子、以及来自多瘤病毒、腺病毒、 逆转录病毒和猿猴病毒的启动子(例如SV40的早期和晚期启动子)以及 其他已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的序列。可 获得用于酵母的载体。合适的实例是2μ质粒就是一个很好的例子。用于 动物细胞的载体也是已为人所知的。这些载体包含SV40的衍生物、腺病 毒，逆转录病毒衍生的DNA序列，以及由如上所述的功能性哺乳动物载 体(如上述载体)组合而成的穿梭载体，以及功能性质粒和噬菌体DNA。另一种合适的载体是杆状病毒载体。然而，通常优选适合在大肠杆菌(E. coli)中表达的载体。

将载体插入宿主细胞用于表达。通常，通过本领域熟知的方法将这 些载体插入宿主细胞中，例如转染、转化、电穿孔、直接注入DNA、脂 质转染和其它熟知的方法。所使用的方法可以根据所选择的宿主细胞以 及DNA的大小和构象来选择。一些有用的表达宿主细胞包含熟知的原核 和真核细胞。一些合适的原核宿主包含例如大肠杆菌、例如大肠杆菌 SG-936、大肠杆菌HB101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌·1776、E coli· 2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCI。可以使用其它细菌和真菌宿主 细胞，如假单胞菌属、芽孢杆菌属物种如枯草芽孢杆菌和链霉菌属。可 以使用的其它宿主细胞是真核细胞如酵母和其它真菌、昆虫细胞、动物 细胞如COS细胞和CHO细胞、人类细胞和组织培养中的植物细胞。

肽的制备方法

固态肽合成

可以通过标准的固态肽合成方法来合成肽，例如在M.Bodanszky， “《肽合成原理》(Principles of Peptide Synthesis)”(施普林格出版社 (Springer-Verlag)，柏林，第二版，1993)中描述的那些。这涉及在不溶 性聚合物例如衍生的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上合成。使用的反应顺序 是标准的。

基因工程

肽可通过基因工程制备。通常，生产具有生理活性的基本上纯化的 肽的方法包括以下步骤：(1)培养用包括编码肽的DNA的载体转染的宿 主细胞，DNA可操作地连接至影响DNA表达的至少一个控制元件；以 及(2)分离由宿主细胞产生的肽以产生基本上纯化的肽。

表达方法描述于例如D.V.Goeddel，“《基因表达技术》(Gene ExpressionTechnology)”(学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥， 1991)。通常，这样的方法是本领域熟知的。

一旦表达，可通过标准蛋白分离技术分离肽，标准蛋白分离技术包 含在树脂如二乙基氨基乙基纤维素或羧甲基纤维素上的离子交换层析、 在尺寸排阻介质上的层析(凝胶过滤)、等电聚焦、层析聚焦和其它标准 方法，例如R.K.Scopes，“蛋白纯化：原理与实践(Protein Purification: Principles and Practice)”(第3版，(施普林格出版社(Springer-Verlag)， 纽约，1994)中所述的那些。

如果针对这些肽制备多克隆或单克隆抗体，则这些抗体可通过标准 方法如上述Scopes书中的那些方法用于亲和层析。用于制备多克隆抗体 或单克隆抗体的此类方法是本领域熟知的并且不需要在此进一步详细描 述。通常，通过将肽与或不与合适的佐剂例如弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)一起注射到产生抗体的哺乳动物例如大鼠、兔、绵羊 或山羊中来产生多克隆抗体。肽可与载体(carrier)蛋白如匙孔戚血蓝蛋 白偶联。一旦产生多克隆抗体，可以通过标准技术将产生这种多克隆抗 体的细胞与适当的融合配偶体融合以获得产生具有确定特异性的单克隆 抗体的杂交瘤。

一种腐植酸的制备方法

腐植酸可以从任何含有分解良好的有机物的物质中提取出来，方法 是用氢氧化钠溶液处理该物质以溶解有机物。然后逐滴加入酸以将pH降 低至约2，并且絮凝至顶部的有机材料可以与液体部分机械分离。絮凝的 材料是腐植酸，当被干燥，并且任选地被压碎和筛分时形成称为腐植酸 盐的黑色固体。

腐植酸也可购自商业供应商。

使用方法

本文公开的腐植酸和肽组合物可以多种方式使用。当用作药物时， 组合物通常以胶囊、片剂、乳剂、酊剂、糖浆或食品添加剂的形式口服 施用。当用作表面消毒剂时，组合物通常溶解或分散在溶剂中以产生用 于接触(例如，擦拭、喷洒或以其它方式浸入)表面的溶液或混合物。

优选的药物剂量为每天约30mg/kg的腐植酸和多肽，重量比约为 50000。待施用的剂量可以由本领域的普通技术人员根据问题的临床严重 性、患者的年龄和体重、患者暴露在可能影响感染机会的条件下、是否 存在潜在的全身性问题(例如糖尿病、循环障碍和免疫受损状态)以及 本领域中通常理解的其他药代动力学因素(例如肝和肾代谢)来确定。E.J.Freireich等人在“小鼠、大鼠、仓鼠、狗、猴子和人中抗癌药毒性的 定量比较(Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse,Rat,Hamster,Dog,Monkey and Man)”，”《癌症化学治疗剂》 (Cancer Chemother.Rep.)，50：219-244(1966)中描述了基于mg/kg的 各种大小和物种的动物与人的剂量的相互关系。可调整剂量方案以优化 预防和/或治疗反应。剂量可以按日分配和施用，也可以根据治疗情况按 比例减少剂量。

活性成分通常与生理学上可耐受的并且与活性成分相容的稀释剂或 赋形剂混合。合适的稀释剂和赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油等 或其组合。此外，如果需要，组合物可以含有少量的辅助物质，例如润 湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂等。对于前述的更详细的描述，参见 标准药学文本，例如《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)，Mack出版公司。easton，Pa.(1970)。

根据本发明的方法可用于治疗人类或社会或经济上重要的动物物 种，例如狗、猫、马、绵羊、牛、山羊或猪。根据本发明的方法不限于 在人类中使用。

药物组合物

通常，本文公开的药物组合物包括：(1)腐植酸；(2)SEQ ID NO：1 的肽；(3)可选地药学上可接受的载体。

生理有效量可以由本领域普通技术人员参考上述剂量来确定。

本领域已知的常规药学上可接受的载体(carrier)可包含醇，例如乙 醇、血清蛋白、胆固醇、人血清白蛋白、脂质体、缓冲剂例如磷酸盐、 水、无菌盐水或其它盐、电解质、甘油、羟甲基纤维素、丙二醇、聚乙 二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇，其它表面活性剂、植物油和常规抗细菌 剂或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞 等。药学上可接受的载体(carrier)符合关于无菌性、等渗性、稳定性和 非致热性的工业标准。

通过以下实施例说明本发明。这些实施例仅用于说明目的，并不旨 在限制本发明。

实施例

实施例1：腐植酸(HA)和肽(CZV2.14)组合物对流感症状的疗效

该实施例使用Amar，S.，Ecovar，Y.2018年9月2日的“随机、双 盲、安慰剂对照、平行组试点研究中调查腐植酸对流感症状的影响(A Randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled,Parallel-Group Pilot Study to Investigate the Effects of HumicAcid on Symptoms of Influenza)”中描述 的方案，将包括腐植酸+肽的组合物对流感症状的疗效与单独使用腐植酸 的结果进行比较。

20名参与者被分成治疗组和安慰剂组，每组10人。表1-4显示了腐 植酸研究对比腐植酸+肽研究的结果。

表1.流感症状评分。

表2.第2周TNF-α和IL-8标志物的百分比变化。

表3.每周视觉模拟量表(VAS)。

用于研究的心理反应量表：Wewers等人，1994。

与单独HA相比，在HA+肽中观察到VAS评分增加。在单独HA组 中，观察到基线时症状的严重程度更大，VAS评分更低。

从基线到第1周和第2周，HA+肽组和安慰剂组的VAS评分有统计 学意义的增加(p</＝0.001)，与安慰剂组相比，从筛选到第1周和第2周， HA+肽组中受试对象的增幅更大。

表4.第2周CD4+和CD8+标志物的变化百分比。

CD4+和CD8+T细胞是免疫活性受损以及鉴定体内抗体应答不足的 有用生物标记。研究者已经发现许多个体具有异源亚型特异性CD4+和 CD8+T细胞，其帮助识别不同血清型共有的保守内部表位；并且，在这 种异源亚型T细胞存在下，流感个体的免疫力、疾病严重程度和感染持 续时间降低。在本研究中，在用腐植酸或安慰剂治疗的受试对象中，在 治疗两周后测量血清中的CD4+和CD8+中的T淋巴细胞的细胞计数。虽 然没有统计学上的显著差异，但从筛选到第2周，服用腐植酸的受试对 象的CD4+细胞绝对数增加了3％，而服用安慰剂的受试者CD4+细胞计数 下降了3％。在本研究中发现腐植酸治疗实际上增加了CD4+和CD8+细 胞，表明腐植酸治疗可能在调节人类免疫系统应答中发挥作用。

实施例2：腐植酸和多肽(CZV2.14)的体外抗病毒特性评价

将包括Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Lys-Asp-Ala-Gly-Lys (SEQ IDNO：1)序列的肽(CZV2.14)与腐植酸混合。腐植酸和多肽 体外抗病毒特性评价表明，由噬斑试验测定，腐植酸和多肽在第3天对 HSV-1的杀毒活性为100％，在第3天对HSV-2的杀毒活性为60％。此外， 如通过病毒产量测定所测量，第3天对CMV和RSV-2有完全杀毒附着抑 制(100％)。在不受理论束缚的情况下，认为HA+CZV2.14混合物的多 肽部分与病毒的刺突蛋白(S-糖蛋白)结合，HA与多肽缔合(例如通过静 电吸引)，在病毒周围形成腐植酸“壳”，从而在化学和物理上阻断病毒 进入细胞并防止感染。

实例3：包括腐植酸和肽(CZV2.14)的组合物的体内评价

病例#1

新加坡，2020年2月：一家6口被救护车送往医院住院，年龄20-54 岁。COVID-19检测全部呈阳性。

测定-24小时处理窗口(PCR)

治疗：包括腐植酸和包括SEQ ID NO：1的肽的组合物的片剂或胶囊 2片或2粒，每天3次，共3天。

排放标准——阴性测定×2，间隔24小时

第一次测定，初始治疗后24小时-阴性

第二次测定，初始治疗后48小时-阴性

所有家庭成员均出院，#3无并发症发生

病例#2

香港，2020年3月/4月：

背景：中心经理1(CM1)在经销商的营业点接触到一名已知感染 COVID-19的客户。CM1正在服用腐植酸和CZV2.14产品(Product)，没 有患病，但一名已知没有未服用Product该产品(CM2)的同事(CM2) 与CM1掺和在一起，客户确实出现了发烧、寒战和呕吐的症状。她最终 被检测为COVID-19检测呈阳性，并入院住院治疗。

住院过程：CM2拒绝在医院服用腐植酸和CZV2.14产品，因为她的 主要治疗提供者正在接受另一种药物治疗，她担心意外的相互作用；然 而症状恶化。经销商获得了CM2的同意，于2020年4月2日开始服用 治疗剂量的腐植酸和CZV2.14产品，每天三次，每次3片。在完成初始 治疗剂量后24小时，发烧就消失了。截至2020年4月4日，CM2没有 任何症状。

注：香港的惯例是在公共记录中公布COVID-19感染者的姓名。CM2 的信息发布于2020年4月2日。

雇主回应：经销商于2020年3月31日意识到CM2感染，并关闭了 当地业务4天。在此时，所有的员工都被指示服用治疗剂量的腐植酸和 CZV2.14产品，每天三次，每次3片。经销商在所有员工返回工作岗位 之前对他们进行PCR检测。所有员工还参加了一个每晚举行的网络研讨 会，在那里他们可以了解COVID-19并询问有关腐植酸和CZV2.14产品 的问题，以获得腐植酸和CZV2.14产品预防性剂量的合规性。

产品说明

预防指导：每天两次服用1片片剂/1粒胶囊

预防发病方法：每天3次服用1片片剂/1粒胶囊

慢性疾病——糖尿病、心脏病

自身免疫性疾病-类风湿性关节炎、IBD、狼疮

过度肥胖

基因组诱因(NLRP3、CCL2、IL-1A)

治疗，COVID-19(+)：口服2片片剂/2粒胶囊，每日3次

治疗，COVID-19(+)发病：口服3片片剂/3粒胶囊，每日3次

实施例4：以IC50和IC90为基准，体外测量CZV2.14和CZV2.14+ 腐植酸对SARS-CoV-2的病毒融合抑制和杀毒活性

用包括不同剂量的腐植酸(HA)和多肽(CZV2.14)的组合物治疗20例 SARS-CoV2阳性患者。研究结果如下所示。

¹高峰热＝第1天；AF＝无发热的＝温度为98.6℉(37℃)或更低

²tid＝每天三次

³逐渐减量＝750mg tid×1-4天，500mg bid×1-3天，250mg tid×1-2 天

⁴COVID-19Ab初始日期+状态＝第0天

⁵S＝有症状，AS＝无症状

¹Chang D.等人，新型冠状病毒感染中病毒清除和症状解决的时间动 力学(TimeKinetics of Viral Clearance and Resolution of Symptoms in Novel CoronavirusInfection)《美国呼吸与重症护理医学》(Am J Respir Crit Care Med.)2020年；201(9):1150-1152。

doi:10.1164/rccm.202003-0524LE

观察和结论

Chang报告的患者人群入院。HA+肽组在门诊环境中接受治疗。在这 项研究进行时，中国的实践标准是通过住院对感染者进行隔离。无论怎 样，两个研究之间的症状表明它们是合理匹配的(例如发热，咳嗽和呼 吸困难)；然而，HA+肽组(19-72岁)的年龄范围比常组(24-43岁)更 宽。

在HA+肽组中的7个个体中记录到高烧(大于或等于102℉)。其中 5名年龄在50岁以上。HA+肽组有1名患者(67岁)出现残留症状，而 Chang报告的16名中有8名出现残留症状。

在Chang的数据中，有50％的人口在达到COVID阴性状态后出现残 留症状。在HA+肽组中，根据6名无症状临床病程的患者进行调整后， 7.1名患者出现残留症状。

观察#1：HA+肽组中9名患者为50岁以上。HA+肽组中TNF-α(以 及IL-6)的降低可能提供了病毒炎症反应更快的临床降级。

观察#2：考虑到生理适应能力随年龄的变化，HA+肽组中年龄超过 50岁的9名患者会有更多的残留症状。HA+肽的抗炎活性，除了其增强 免疫系统的能力之外，可能对这一改善结果起到了作用。

在Chang的数据中，使用24-43岁之间的HA+肽的人比其年龄匹配 的群组提前1.5天达到病毒阴性。整个HA+肽组，年龄在19-72岁之间， 在Chang报告的数据前近1天实现病毒阴性。

HA+肽组的平均发热天数比Chang报告中的少1.7天。在HA+肽和 流感人群中也观察到了类似的发现。HA+肽对TNF-α的抑制和免疫系统 的增强可能对个体的恢复有利。

关于通过引用和变更并入的声明

本申请中引用的所有参考文献，例如专利文献，包含发行或授权的 专利或等同物；专利申请出版物；和非专利文献或其他来源材料；其通 过引用整体并入本文，如同单独地通过引用并入。

本文中已经使用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且使用 这些术语和表达并非意图排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部 分，但是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内各种修改是可能的。 因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案、示例性实施方案和任选 特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进 行修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在由所附权利要求限定的 本发明的范围内。本文提供的特定实施方案是本发明的有用实施方案的 实例，并且对于本领域的技术人员显而易见的是，可以使用本说明书中 阐述的装置、装置部件和方法步骤的大量变化来执行本发明。如本领域 技术人员将显而易见的，可用于本方法和装置的方法和装置可包含大量 任选的组合物和处理元件和步骤。

当本文公开一组取代基时，应理解该组的所有单个成员和所有子组 分别公开。当在本文中使用马库什组或其他组时，该组的所有单个成员 以及该组的所有可能的组合和亚组合旨在单独地包含在本公开中。

必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”和 “所述”包含复数引用，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，提 及“一肽”包含多种这样的肽和本领域技术人员已知的其等同物，等等。 同样地，术语“一”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使 用。还应当注意，术语“包括”，“包含”和“具有”可以互换使用。表 述“根据权利要求XX-YY中任一项”(其中XX和YY是指权利要求编 号)旨在以替代形式提供多项从属权利要求，并且在一些实施方案中是 与表述“如权利要求XX-YY中任一项”可互换的。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属 领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践 或测试中可使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但还 是描述了优选的方法和材料。本文中的任何内容都不应被解释为承认本 发明由于先前公开而无权先于这种发明。

无论何时在说明书中给出范围，例如，整数范围、温度范围、时间 范围、组成范围或浓度范围，所有中间范围和子范围，以及包含在给出 的范围中的所有单个值意图包括在本公开中。如本文所用，范围具体包 含作为范围的端点值提供的值。如本文所用，范围具体包含该范围的所 有整数值。例如，1至100的范围具体包含端点值1和100。应当理解， 包含在本文的说明书中的范围或子范围内的任何子范围或单个值可从本 文的权利要求中排除。

如本文所用，“包括”是与“包含”或“含有”或“特征在于”同义 的并且可互换使用，且是包括性的或开放式的，且不排除另外的、未列 举的要素或方法步骤。如本文所用，“由...组成”排除权利要求元件中未 指明的任何元件、步骤或成分。如本文所用，“基本上由…组成”不排除 实质上不影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每种情况下，术语“包括”，“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个 可以用另外两个术语中的任一个代替。本文说明性地适当描述的本发明 可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限 制的情况下实施。

所有本领域已知的材料和方法的功能等效物旨在包含在本公开中。 已经使用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且使用这些术语和 表达并非意图排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，但是应 认识到，在所要求保护的本发明的范围内各种修改是可能的。因此，应 当理解，尽管已经通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但 是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变化，并且这样的 修改和变化被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> C·扎维拉

林明盛

<120> 用于治疗或预防病毒感染的组合物和方法

<130> 9-20 US

<150> US 63/015,376

<151> 2020-04-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 1

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Lys Asp Ala Gly Lys

1 5 10