一种吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球及其制备方法
阅读说明：本技术 一种吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球及其制备方法 (Hydrogel microsphere for adsorbing growth factors in supernatant of stem cells and preparation method thereof ) 是由 周娟 李渊丽 陈皓 陈敬华 孙莹 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球及其制备方法,属于生物医药技术领域。本发明利用微流控装置以甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化肝素为原料,通过紫外光交联原理可以制备出不同直径以及不同比例的水凝胶微球,本发明所制备出的水凝胶微球具有良好的机械稳定性、吸附干细胞上清液中生长因子以及缓慢释放生长因子的能力,微球的制备方法简单,可进行批量生产,具有良好的应用前景。(The invention discloses a hydrogel microsphere for adsorbing growth factors in the supernatant of stem cells and a preparation method thereof, belonging to the technical field of biological medicines. The invention uses the methacryloylated hyaluronic acid and the methacryloylated heparin as raw materials by utilizing the microfluidic device, can prepare the hydrogel microspheres with different diameters and different proportions by the ultraviolet crosslinking principle, has good mechanical stability, and the capacity of adsorbing growth factors in the supernatant of stem cells and slowly releasing the growth factors, has simple preparation method, can be produced in batches, and has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及一种吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
生长因子(GFs)是组织再生过程中控制细胞命运的关键成分，它们调节细胞的增殖和分化以促进组织再生。生长因子作为细胞因子的一类，具有细胞因子的共同特点，主要包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)等。生长因子对细胞的增殖、组织或器官的修复和再生具有重要的促进作用，被广泛地应用于组织工程领域。由于体内的快速周转率，它们的受控递送具有挑战性。功能化水凝胶，如基于糖胺聚糖的水凝胶，在吸附和调节GFs释放方面显示出巨大潜力。
肝素是一种以其抗凝作用而广为人知的天然线性多糖，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、调节血脂、调节生长因子、抗肿瘤转移等多种生物学功能和药理作用。它由具有1→4连接的2-O-硫酸化醛酸和6-O-硫酸化的N-硫酸葡糖胺的交替的二糖单元组成。这些结构块每重复单元有三个硫酸盐部分，在任何已知生物分子中，肝素具有最高的负电荷密度。由于其高负电荷密度，肝素可以通过静电力捕获正电荷的常见蛋白质，例如GFs，其可用于从水凝胶中延长GFs的释放，肝素在体内具备的多种生物活性就是通过与生长因子和细胞因子等蛋白质的相互作用来发挥的。很多生长因子能够与肝素分子紧密结合到特定的ECM中,包括FGF、 VEGF、HGF以及TGF-β等，这些通常称为肝素亲和性生长因子。然而，肝素(5-15kDa)的低分子量和负电荷的排斥限制了它们的交联性，因此，基于肝素的系统需要另一种组分来作为改性肝素的基质以成功制备出水凝胶，如透明质酸，其已被广泛设计应用于伤口愈合和特应性皮炎等。
水凝胶微球的常用制作方法可分为批量乳化法、光刻法、电喷法、机械破碎法和微流控法等。批量乳化法是将不相容的液体混合在一起生成可交联的水凝胶液滴；光刻法是将光聚焦在掩模版或者模具上固化交联形成水凝胶微球；电喷法是在针头和接收液之间加上电压，使施加的电压克服针尖处的表面张力，形成了带电的液滴射流，在接收液中交联形成水凝胶微球；在机械破碎方法中，将预先形成的块状水凝胶通过机械破碎成水凝胶微球；微流控法将载有不相容液体通过微流道连接，在交汇处产生液滴，然后将液滴交联形成水凝胶微球，该方法适用于快速产生稳定的尺寸可控的微球。
此类3D支架具有较大的比表面积，可显著改善细胞生长因子-基质相互作用。使用微流体方法能够快速生成水凝胶微球。但是这种方法存在有一些缺点，限制了其生物医学应用。首先，微流体技术需要昂贵的毛细管装置或微通道芯片，这在组装上也存在技术挑战，并极大地影响实验结果。其次，由于微流体装置内部无法实现交联，因此水凝胶微滴只能在下游交联，在那里它们极有可能会发生融合并变得不稳定，微滴一旦发生融合将导致无法制备出粒径相对均匀的水凝胶微球，使得的微球尺寸分布范围较大。从而无法稳定地进行药物封装或释放；并且对生长因子的吸附能力以及释放也会因为微球大小不同、不均一而存在差异性，药物释放时会表现出明显的突释情况。此外，使用水凝胶微球进行细胞包封或者黏附时，不同大小的水凝胶微球对细胞数量的控制也不可控、存在挑战。因此，有必要设计一种新方法，以确保简单、快速的操作使微球交联，以制备出粒径相对均一的水凝胶微球。
发明内容
本发明是为了解决现有干细胞存活时间短，随着时间的延长，细胞不断凋亡，活力和效力都出现下降，严重限制了其临床应用等缺点，考虑到干细胞的治疗效果主要是通过它自分泌和旁分泌各种生长因子来实现的，所以本发明提供一种吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球及其制备方法，本发明使用微流控技术，以甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)和甲基丙烯酰化肝素(HepMA)为原料制备了一种吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球，其直径分布在100～500μm之间，粒径均匀，理化性质稳定，表面粗糙多孔，能够实现对生长因子的吸附以及缓慢释放。
可光交联的带有强负电荷的水凝胶在微流控设备中暴露于光线时可以实现稳定的交联，并表现出出色的吸附生长因子的能力。甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)和甲基丙烯酰化肝素(HepMA)是一种可生物降解且具有强负电荷的光交联水凝胶原料，可实现生长因子的吸附以及缓慢释放。
目前研究发现，间充质干细胞对于难愈性创面、特应性皮炎皮肤病以及头发再生均有很好的疗效，皮内、皮下的局部注射可促进皮肤创面的愈合。间充质干细胞的这种治疗效果主要是通过它的自分泌和旁分泌机制来完成的。但是细胞的存活时间在低温保存液保存下只有 24h左右，随着时间的延长，细胞不断出现凋亡，活力和效力都出现了下降，这限制了它的临床应用。单纯应用细胞培养无血清上清液也能起到相似的效果，而且应用更加方便，可以作为间充质干细胞治疗难愈性创面、皮肤病以及头发再生的替代方案，而使用带有负电荷的水凝胶微球将干细胞上清液中的生长因子吸附出来，不仅使用方便，而且治疗效果也更显著，是一种十分有前景的生物医学应用。
本发明的第一个目的是提供一种制备用于吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球的方法，该方法包括如下过程：
将含双键修饰的糖胺聚糖和光引发剂分散在水中，获得混合体系，作为分散相；将油相作为连续相，然后利用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得W/O乳液；最后将W/O乳液在紫外光下进行照射，制得水凝胶微球。
在本发明的一种实施方式中，所述含双键修饰的糖胺聚糖选自如下任意两种：甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化肝素(HepMA)、甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)。
在本发明的一种实施方式中，当含双键修饰的糖胺聚糖为甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化肝素时，所述混合体系中甲基丙烯酰化透明质酸与甲基丙烯酰化肝素的质量比为1： (1-10)；优选1：(1-3)；进一步优选1：2。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中甲基丙烯酰化透明质酸相对水的质量浓度为0.5％～2％。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中甲基丙烯酰化肝素相对水的质量浓度为 1％～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中还包括计入光引发剂。所述光引发剂相对水的质量分数为0.125％～0.25％。
在本发明的一种实施方式中，所述油相为蓖麻油。
在本发明的一种实施方式中，所述连续相在微通道的流速控制在10-20mL/h；分散相在微通道的流速控制在1～5mL/h。本发明通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。
在本发明的一种实施方式中，所述微流控装置选用双通道注射泵，芯片选用的是T型通道微流控芯片，连续相入口是点胶针头，0.8mm，分散相入口是毛细管，外径是1mm，内径是0.58mm。
在本发明的一种实施方式中，所述紫外光的照射功率为20-40mW cm-2；紫外光的波长为 365-405nm；照射时间为30-120s。
在一种实施方式中，涉及的经双键修饰的透明质酸(HAMA)和双键修饰的肝素(HepMA) 是通过如下方法制得：利用甲基丙烯酸酐与透明质酸以及肝素进行酰化反应，分别获得HAMA和HepMA。
在一种实施方式中，所述酰化反应是在pH＝8～9的环境中进行的，透明质酸与水的质量体积比(w/v)别为1～15mg/mL，肝素与水的质量体积比(w/v)为10～50mg/mL。
在一种实施方式中，具体是先将透明质酸或者肝素分散在水溶液中，然后搅拌20～120 min，实现溶解。
在一种实施方式中，使用0.5～5M的NaOH调节整个反应体系的pH至8～9。
在一种实施方式中，所述透明质酸和肝素与甲基丙烯酸酐的质量体积比(w/v)为0.05～1g/mL。
在一种实施方式中，透明质酸或者肝素充分溶解后，使用NaOH调节溶液的pH至8～9，酰化反应是在冰水浴、避光且剧烈搅拌条件下，缓慢加入甲基丙烯酸酐(MA)；MA滴加完成之后，使反应在冰水浴中、避光、充分搅拌且pH＝8～9条件下进行6～24h。
在一种实施方式中，酰化反应的过程具体为：称量透明质酸或者肝素，并量取一定量的蒸馏水放入圆底烧瓶中，在冰水浴中搅拌20-120min使其溶解，透明质酸或者肝素溶解后，调节其pH＝8～9，然后在避光并且剧烈搅拌条件下，缓慢加入MA；MA滴加完成之后，使反应在冰水浴中、避光、充分搅拌且pH＝8～9条件下进行6～24h。
在一种实施方式中，反应结束之后还需要进行醇沉、透析、干燥；醇沉是指将反应液倒入乙醇中，-20℃过夜，然后离心收集沉淀产物；透析是指使用分子量截止值为3500Da的透析袋对醇沉后的产物进行蒸馏水透析以除去未反应的MA；所述干燥是指使用冻干机进行冷冻干燥。
本发明的第二个目的是利用上述方法制备提供一种用于吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球。
本发明的第三个目的是提供上述水凝胶微球在制备用于头发再生、护肤美容、其他外科类药用产品、或医疗器械中的应用。
有益效果：
(1)本发明所制备的水凝胶微球采用HAMA和HepMA作为原料，具有良好的生物相容性、机械稳定性、粒径均一，水凝胶微球可以浸泡在干细胞上清液中，具有吸附以及释放生长因子的能力。
(2)本发明具有良好的溶胀性能，有利于生长因子的吸附和释放。
(3)本发明有良好的力学性能，不会因为外力而遭到破坏，具有一定的物理稳定性。
(4)本发明有良好的吸附生长因子的能力，能够将干细胞上清液中的生长因子吸附并洗脱下来。
(5)本发明具有良好的释放生长因子的能力，可以实现生长因子的缓慢释放。
(6)本发明使用的原料容易获得，成本较低，制备方法简单，适合大规模生产。
附图说明
图1为本发明的技术路线图；
图2为HAMA的FT-IR和1HNMR图；
图3为HepMA的FT-IR和1HNMR图；
图4为实施例3中使用微流控制备的水凝胶微球的粒径分布统计图；其中，A为连续相流速控制为10mL/h，改变分散相的流速(1mL/h-6mL/h)条件下分别制得的水凝胶微球的粒径分布统计图；B为分散相流速控制为1mL/h，改变连续相的流速(10mL/h-20mL/h)条件下分别制得的水凝胶微球的粒径分布统计图；
图5为本发明制备的HH水凝胶微球的溶胀结果图；其中，A为水凝胶微球的质量变化情况，B为水凝胶微球的体积变化情况；
图6为本发明制备HH水凝胶微球的机械性能测试结果图；
图7为本发明制备的HH水凝胶微球吸附生长因子能力测试结果图；
图8为本发明制备的HH水凝胶微球吸附生长因子经洗脱后，洗脱液的SDS-PAGE结果图；
图9为本发明制备的HH水凝胶微球释放生长因子测试结果图。
具体实施方式
透明质酸购自福瑞达公司，肝素和干细胞上清来源于实验室保存，蓖麻油来源于国药试剂，甲基丙烯酸酐购自麦克林，BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液均购自碧云天。
本发明首先在冰水浴、避光条件下进行透明质酸以及肝素和甲基丙烯酸酐的反应，利用二者上面的自由羟基进行接枝双键以进行后面的紫外交联成凝胶反应。透明质酸和肝素上的双键接枝率我们通过1H NMR来计算。
水凝胶微球的制备方法：为了制备HH微球，并且为了使微球能够吸附各种带正电荷的生长因子，我们选择了HAMA复配HepMA溶液，并且加入了适量的LAP(光引发剂)作为分散相，同时使用蓖麻油作为连续相。将两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相形成单分散液滴。通过调节水相和油相的流速，我们可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。水凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后我们使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至 -20℃。
本发明使用HH水凝胶微球吸附干细胞上清液中的生长因子，我们首先使用不同配比的冻干HH水凝胶微球，将其加入到干细胞上清液中使其充分吸附各种生长因子，为了对吸附的干细胞生长因子进行定量，使用不同的洗脱液对微球吸附的生长因子进行洗脱，随后对洗脱液中的生长因子使用BCA试剂盒进行定量。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1HAMA的合成及表征
HAMA的合成：
精密称量500mg透明质酸溶解于45mL的DMF/H2O(1/2，v/v)混合溶剂中，待透明质酸完全溶解后，使用3M的NaOH调节溶液的pH至8～9，然后在剧烈搅拌条件下，缓慢滴加4 mL甲基丙烯酸酐，在冰水浴中使反应进行24h，pH值在整个过程中一直维持在8～9之间。反应结束后，将反应液倒入500mL的乙醇中进行醇沉，-20℃过夜。醇沉结束后使用离心机在5000rpm速度下离心10min，收集HAMA沉淀产物，然后将HAMA沉淀物复溶于水，使用3500Da的透析袋透析2天，冷冻干燥得到纯HAMA产物，-20℃保存。
HAMA产物表征：
分别取少量的冻干产物HAMA和磨成粉的HA，使用傅里叶变换红外光谱仪在400-4000 波长范围内扫描其红外光谱。此外，甲基丙烯酰化前后的透明质酸使用1H NMR进行表征，分别取10mg HAMA和HA溶解于0.5mL D2O中，然后装入核磁管中使用核磁共振波谱仪进行测试，测试结果如图2所示。HAMA的接枝率(DS)使用如下公式进行计算：
其中a和b分别是指两个甲基丙烯酸酯乙烯基质子峰面积，c是指N-乙酰氨基葡糖甲基质子峰面积。
根据测得的核磁结果计算出甲基丙烯酰化透明质酸上的双键接枝率在40％～70％之间。
实施例2HepMA的合成及表征
HepMA的合成：
精密称量500mg肝素溶解于25mL的H2O中，待肝素完全溶解后，使用3M的NaOH 调节溶液的pH至8～9，然后在剧烈搅拌条件下，缓慢滴加4mL甲基丙烯酸酐，在冰水浴中使反应进行24h，pH值在整个过程中一直维持在8～9之间。反应结束后，将反应液倒入500 mL的乙醇中进行醇沉，-20℃过夜。醇沉结束后使用离心机在5000rpm速度下离心10min，收集HepMA沉淀产物，然后将HepMA沉淀物复溶于水，使用3500Da的透析袋透析2天，冷冻干燥得到纯HepMA产物，-20℃保存。
HepMA产物表征：
分别取少量的冻干产物HepMA和肝素，使用傅里叶变换红外光谱仪在400-4000波长范围内扫描其红外光谱。此外，甲基丙烯酰化前后的透明质酸使用1H NMR进行表征，分别取 10mg HepMA和肝素溶解于0.5mL D2O中，然后装入核磁管中使用核磁共振波谱仪进行测试，测试结果如图2-3所示。HepMA的接枝率(DS)使用如下公式进行计算：
其中a和b分别是指两个甲基丙烯酸酯乙烯基质子峰面积，c是指肝素的二糖重复单元质子峰面积。
根据测得的核磁结果计算出甲基丙烯酰化肝素上的双键接枝率在40％～60％之间。
实施例3水凝胶微球的制备
(1)利用实施例1所得HAMA分散在水中，配制得到1wt％的HAMA溶液，并且加入相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；
(2)将步骤(1)中的分散相、连续相两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制1mL/h流速注射，连续相控制14mL/h 流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例4水凝胶微球的制备
(1)利用实施例1所得HAMA配制1wt％的HAMA溶液，同时复配加入实施例2所得相对水质量的1wt％的HepMA，相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制1mL/h流速注射，连续相控制14mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例5水凝胶微球的制备
(1)利用实施例1所得HAMA配制1wt％的HAMA溶液，同时复配加入实施例2所得相对水质量的2wt％的HepMA，相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制1mL/h流速注射，连续相控制14mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例6水凝胶微球的制备
(1)利用实施例1所得HAMA配制1wt％的HAMA溶液，同时复配加入实施例2所得相对水质量的3wt％的HepMA，相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制1mL/h流速注射，连续相控制14mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例7HH水凝胶微球的溶胀实验
取一定质量的冻干微球样品，记下质量为W，并将样品放置到离心管中进行实验。在0min 称量样品+离心管的质量为W0。将样品浸泡在PBS中并放置到37℃，100rpm/min的环境中，在一定时间点，吸干水分并称重，记为Wt。每组至少三个平行实验，微球的溶胀率使用下列公式计算：
溶胀率(SR)＝(Wt-W0)/W×100％
实验结果：本发明的吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球溶胀测试结果如图5所示，每组微球样品均可以达到1200％以上的溶胀行为。其中实施例4与实施例3无显著性差异，实施例5和实施例6均与实施例3存在显著性差异，实施例6差异最显著，平衡溶胀率明显降低。
表1实施例3-6所得水凝胶微球在不同浸泡时间下的溶胀结果
实施例8HH水凝胶微球的机械性能测试
直接将与制备微球相同的原料添加到模具中制备出10mm×5mm圆柱形水凝胶，每组样品设置三个平行，使用万能试验机进行压缩。将样品分别放置到试验机平台上，以1mm/min 的固定应变率执行压缩测试，并使用250N的称重传感器测量施加的载荷，测量出应力-应变曲线，然后计算其弹性模量。
实验结果：本发明的吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球的机械性能测试结果如图6所示，结果显示，HAMA:HepMA＝1:0所制备的水凝胶的压缩模量是45.08Kpa，HAMA:HepMA＝1:1、1:2、1:3所制备的水凝胶的压缩模量分别是74.30Kpa、82.24Kpa和100.55 Kpa。HepMA的加入可以提高水凝胶的压缩模量，水凝胶的物理稳定性逐渐提高。
表2实施例3-6所得水凝胶微球的压缩模量结果
水凝胶微球
压缩模量(kPa)
实施例3
45.08
实施例4
74.30
实施例5
82.24
实施例6
100.55
实施例9HH水凝胶微球吸附干细胞上清液中生长因子能力测试
分别取实施例3-6所得水凝胶微球10mg浸泡在1.5mL脐带干细胞培养液上清液中，在37℃条件下浸泡24h以充分吸附上清液中的生长因子。吸附后的水凝胶微球分别用纯水(1mL) 洗1次、PBS(1mL)洗1次、0.5M NaCl(1mL)洗1次、1M NaCl(1mL)洗1次、5M NaCl (1mL)洗1次。每次均洗脱1h，每步均需收集洗脱液，然后收集的洗脱液直接使用BCA 试剂盒检测蛋白含量。
实验结果：本发明的吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球吸附生长因子的能力测试结果如图7所示，分别检测了实施例3-6在水、PBS、0.5M NaCl、1M NaCl、5M NaCl洗脱液中的蛋白含量，并将所有洗脱液蛋白含量进行加和，计算出了总蛋白含量。结果发现，随着HepMA的加入，微球吸附生长因子的能力提高，实施例5达到最高值，实施例6吸附的生长因子量下降。分析原因是HepMA的加入使得微球所带的负电荷更强，对带正电荷的生长因子吸附能力也更强，但随着加入的HepMA的增多，微球孔径更加致密，吸水溶胀能力降低，不利于干细胞上清液进入到微球内部，从而降低了生长因子的吸附能力。
表3实施例3-6所得水凝胶微球吸附干细胞上清液中生长因子能力测试结果
水凝胶微球
总蛋白量(μg)
实施例3
377
实施例4
416
实施例5
476
实施例6
324
实施例10HH水凝胶微球洗脱下的生长因子的SDS-PAGE结果
为了说明实施例3-6所得水凝胶微球能够成功吸附干细胞生长因子，我们使用SDS-PAGE对实施例9所得洗脱液中的生长因子进行了初步的评估。
实验结果：本发明的吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球洗脱下的生长因子的SDS-PAGE测试结果如图8所示，其中1是指纯水洗脱液、2是指PBS洗脱液、3是指 0.5MNaCl洗脱液、4是指1M NaCl洗脱液、5是指5M NaCl洗脱液、6是指脐带干细胞培养液的上清、7是指总洗脱液，结果显示洗脱液中出现了几条明显的条带，说明我们洗脱下来的物质中，是含有各种干细胞生长因子的。
实施例12HH水凝胶微球释放生长因子测试结果
分别取实施例3-6所得水凝胶微球20mg浸泡在1.5mL脐带干细胞培养液上清液中，在 37℃条件下浸泡24h以充分吸附上清液中的生长因子。吸附完成后吸干并洗去微球表面的上清液，然后分别加入2mL的PBS，放至37℃，100rpm的摇床中用于释放，在设定的时间点分别取出50μL释放液用于BCA测定，并补入新鲜的PBS，最后分别计算出实施例3-6所得水凝胶微球吸附生长因子的累计释放量。
实验结果：本发明的吸附干细胞上清液中生长因子的水凝胶微球释放生长因子的能力测试结果如图9所示，实施例3所得水凝胶微球生长因子的累计释放量在10小时左右达到最高值，而实施例4-6所得水凝胶微球生长因子的累计释放量在40小时左右达到最高值，说明 HepMA的加入，能显著减慢生长因子的释放。实施例3在7天的测试结果中释放的生长因子量最高，其次是实施例4，再次是实施例5，而实施例6释放的生长因子量最少，原因是不含 HepMA的水凝胶微球对生长因子的静电吸附能力较弱，生长因子很快释放出来，随着HepMA 的加入，生长因子的释放也越来越慢，随着时间的延长，生长因子能够缓慢释放出来。之所以累计释放量有所降低，可能是因为释放到PBS中的生长因子逐渐被降解掉。
表4实施例3-6所得水凝胶微球在经过不同时间后的生长因子释放量
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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