阅读说明：本技术 一种阿魏酸丁酯的制备方法及其在治疗或者预防阿兹海默症中的功能应用 (Preparation method of ferulic acid butyl ester and functional application of ferulic acid butyl ester in treating or preventing Alzheimer's disease ) 是由 石玉刚 吴煜 朱陈敏 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种阿魏酸丁酯的绿色制备方法及其应用,实验结果表明阿魏酸丁酯具有较好的预防和治疗阿兹海默症的效果。阿魏酸丁酯可以有效抑制β-淀粉样蛋白单体的聚集,同时,它能通过清除神经细胞内氧自由基和激活细胞内抗氧化应激系统的方式达到治疗效果。该制备方法首先以天然产物阿魏酸作为原料制备了一种生物相容性较好的功能性离子液体,再通过构建稳定离子液滴微反应器,将含有酶的离子液体与SiO<Sub>2</Sub>制备成Pickering乳液,并以此构建宏观连续流动柱式反应系统,突破了反应平衡、催化剂分离与传统间歇反应器的限制。操作简单、转化率高,且酶活耐久性高,重复利用率高,节约成本。(The invention discloses a green preparation method of ferulic acid butyl ester and application thereof, experimental results show that ferulic acid butyl ester has better effect of preventing and treating Alzheimer's disease, ferulic acid butyl ester can effectively inhibit β -amyloid monomer aggregation, and simultaneously, ferulic acid butyl ester can achieve treatment effect by removing oxygen free radicals in nerve cells and activating an intracellular antioxidant stress system 2 Preparing Pickering emulsion, constructing a macroscopic continuous flow column type reaction system by using the Pickering emulsion, and breaking through reaction balance, catalyst separation and traditional batch reactionThe limitation of the device. The method has the advantages of simple operation, high conversion rate, high enzyme activity durability, high repeated utilization rate and cost saving.)

一种阿魏酸丁酯的制备方法及其在治疗或者预防阿兹海默症 中的功能应用

技术领域

本发明为功能食品添加剂和医药等领域，涉及一种阿魏酸酯类化合物的制备以及用于预防和治疗阿兹海默症的功能用途。

背景技术

阿兹海默症(Alzheimer disease,AD)是一种常见的进行性的神经病变类疾病，是导致老年痴呆的主要原因。根据世界卫生组织(WHO)的研究，全球目前已有约四千万的阿兹海默症患者，然而目前还没有一种药物能够有效治疗病症。随着研究的深入，人们发现β-淀粉样蛋白在神经元细胞外的沉积和Tau蛋白的异常磷酸化所形成的神经元纤维缠结(NTFs)导致了神经细胞受损(Acta Neuropathol.1991,82,239-259)。β-淀粉样蛋白中，Aβ42具有神经毒性和较强的疏水性，更容易发生聚集(Neuron,2005,47191-199)。Aβ42的沉聚形成的低聚物和老年斑是导致细胞损伤的关键因素(Science,2002,297,353-356)。

目前，与AD相关的致病机理主要有：Aβ沉淀物的神经毒性作用，氧压和活性氧自由基(ROS)的形成。这其中，Aβ在脑部的非正常沉淀是是导致神经损伤的重要原因之一。过量的Aβ导致形成与Aβ相关的氧压升高，这将引起细胞内ROS堆积，这也是人类几种疾病的发病机理，如癌症和神经性疾病。因此，发展抗氧化剂策略，利用抗氧化剂俘获细胞内ROS，抑制或降低氧压，也因此成为一种预防与治疗AD的有效方法(Pharmaceutical Research,2011,28(11),2771-2779)。

阿魏酸是一种普遍存在于天然植物细胞壁中的酚酸，其具有良好的抗氧化、抗菌、抗癌等特性。本课题实验发现，通过将烷基链接枝在酚酸的羟基基团上，可有效地改变其在食品体系及细胞体系中的亲水亲酯性，从而加强抑菌效果(Journal of Agriculture andFood Chemistry,2018，66(45),12088-12101.)和抗氧化能力(Pharmaceutical Research,2013,30,1979-1989)。目前，阿魏酸烷基酯的应用研究主要集中在其在食品体系中的抗氧化性能。有关其在神经保护及预防或治疗阿兹海默症的研究有限，特别是相关机制研究更是少见。据报道，动物实验中阿魏酸具有保护由β淀粉样蛋白引起的神经损伤作用(Kim,H.S.,2004,27,120-121)。阿魏酸乙酯可以激活抗氧化相关蛋白的表达(Antioxidants&Redox Signaling,2004，6，811-818)，阿魏酸戊酯可以抑制β淀粉样蛋白的沉聚(EuropeanJournal of Medicinal Chemistry,2017，138，1066-1075)。本研究中制得的阿魏酸丁酯不仅体现和保留了阿魏酸的生物学特性，并且还增强了其抗氧化等能力。我们的研究结果表明，阿魏酸丁酯通过抑制Aβ42的沉聚，起到降低其毒性的效果，从而保护细胞不受损伤；通过清除细胞内过量的氧自由基(ROS)和激活细胞内抗氧化应激系统起到修复受损细胞的作用；阿魏酸丁酯也可激活神经细胞(PC12)内抗氧化应激系统，达到预防与治疗阿兹海默症的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种对阿魏酸丁酯的新应用，实验结果表明阿魏酸丁酯具有神经保护功效，作为预防和治疗阿兹海默症有很大的潜力。

本发明的技术方案如下：

一种阿魏酸丁酯在功能添加剂制备中的应用，所述的阿魏酸丁酯可用于预防和治疗阿兹海默症。

实验结果表明，阿魏酸丁酯可以抑制β-淀粉样蛋白沉聚以及降低细胞内ROS的积累，并激活抗氧化应激系统，保护神经细胞，达到预防和治疗阿兹海默症的效果。

本发明还提供了一种阿魏酸丁酯绿色高效的制备方法如下：

作为优选，通过Stoer法修饰二氧化硅纳米颗粒，取1g修饰后二氧化硅纳米颗粒于120℃下干燥4h，在超声辅助下均匀分散于12mL甲苯中。

向上述悬浮液中加入3mmol(CH₃)₂SiCl₂和6mmol CH₃(CH₂)₅NH₂并在氮气保护下恒温60℃搅拌4h。离心得到固体颗粒，用甲苯和甲醇冲洗固体颗粒得到二甲基修饰二氧化硅颗粒。

将0.01mol十二烷基甜菜碱溶于20mL甲醇中。向溶液中加入等摩尔量的阿魏酸，25℃下搅拌反应1h，用旋转蒸发除去甲醇，固体于25℃真空干燥24h，得[C₁₂Bet][Fal]。

将0.195g上述二甲基修饰二氧化硅颗粒均匀分散到2.4mL正辛烷中，再向此溶液中加入6.5g离子液体[C₁₂Bet][Fal]与80μL浓度为4mg/mL pH为8.0的南极假丝酵母酶(lipase CALB)，随后在均质器中均质(8000rpm，2min)，得到皮克林乳液。

将上述溶液加入到底部带有4.5-9μm孔径，内径为2cm的填充柱内，即得到离子液滴微反应器填充柱。

将0.4M正丁醇正辛烷溶液和0.1M阿魏酸的正辛烷溶液通过泵同时注入上述填充柱中，两者流速都控制在2mL/h，填充柱保持恒温45℃。收集流出物，然后以硅胶为固定相，石油醚/乙酸乙酯为流动相，按梯度洗脱，分离纯化目标产物阿魏酸丁酯(FAC4)。

实验结果表明，同现有技术阿魏酸相比，阿魏酸丁酯能更有效地抑制了β-淀粉样蛋白沉聚，在PC12神经瘤细胞中对由6-ODHA引发的胞内ROS具有更好的抑制效果，同时，在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS抑制效果更强，因此，可以作为一种更有潜力的预防和治疗阿兹海默症的功能添加剂。

附图说明

图1为本发明的阿魏酸及其阿魏酸酯系列衍生物对β-淀粉样蛋白沉聚抑制的实验结果。

图2为本发明的阿魏酸丁酯和阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由6-ODHA引发的胞内ROS抑制的实验结果；

图3为本发明的阿魏酸丁酯和阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS抑制的实验结果；

图4为本发明的阿魏酸丁酯和阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图；

图5为本发明的阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对抗由β-淀粉样蛋白作用下氧化应激系统激活的蛋白质免疫印迹图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1阿魏酸丁酯的绿色制备方法

通过Stoer法修饰二氧化硅纳米颗粒，取1g修饰后二氧化硅纳米颗粒于120℃下干燥4h，在超声辅助下均匀分散于12mL甲苯中。

向上述悬浮液中加入3mmol(CH₃)₂SiCl₂和6mmol CH₃(CH₂)₅NH₂并在氮气保护下恒温60℃搅拌4h。离心得到固体颗粒，用甲苯和甲醇冲洗固体颗粒得到二甲基修饰二氧化硅颗粒。

将0.01mol十二烷基甜菜碱溶于20mL甲醇中。向溶液中加入等摩尔量的阿魏酸，25℃下搅拌反应1h，用旋转蒸发除去甲醇，固体于25℃真空干燥24h，得[C₁₂Bet][Fal]。

将0.195g上述二甲基修饰二氧化硅颗粒均匀分散到2.4mL正辛烷中，再向此溶液中加入6.5g离子液体[C₁₂Bet][Fal]与80μL浓度为4mg/mL pH为8.0的南极假丝酵母酶(lipase CALB)，随后在均质器中均质(8000rpm，2min)，得到皮克林乳液。

将上述溶液加入到底部带有4.5-9μm孔径，内径为2cm的填充柱内，即得到离子液滴微反应器填充柱。

将0.4M正丁醇正辛烷溶液和0.1M阿魏酸的正辛烷溶液通过泵同时注入上述填充柱中，两者流速都控制在2mL/h，填充柱保持恒温45℃。收集流出物，然后以硅胶为固定相，石油醚/乙酸乙酯为流动相，按梯度洗脱，分离纯化目标产物阿魏酸丁酯(FAC4)。

实施例2阿魏酸酯衍生物(FAC2-FAC10)抑制β-淀粉样蛋白沉聚能力的对比研究

将100μL浓度为50μM的β-淀粉样蛋白加入至黑色底部透明的96孔板中。向孔中加入阿魏酸及阿魏酸酯系列衍生物(阿魏酸乙酯FAC2、阿魏酸丁酯FAC4、阿魏酸己酯FAC6、阿魏酸辛酯FAC8和阿魏酸癸酯FAC10)，使其最终浓度分别为5μM，置于37℃培养箱培养48h。向上述每孔中加入100μL浓度为10mM的硫磺素T溶液，暗处孵化1h，测定荧光值。

得到的阿魏酸及阿魏酸酯系列衍生物抑制β-淀粉样蛋白聚集情况见图1。

对比例1阿魏酸抑制了β-淀粉样蛋白沉聚

本对比例与实施例1相比，区别仅在于对比例所用的作用物为阿魏酸，结果见图1。

实施例3阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对由6-ODHA引发的胞内ROS的抑制

将PC12细胞接种至96孔板中，每孔细胞数为1×10⁴个，放置细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中，过夜培养，使细胞贴壁。过夜培养后，向孔中加入阿魏酸丁酯，使其孔中最终浓度分别为10,50,100μM(平行6组)，培养24h。再向每孔分别加入6-OHDA，孔中终浓度为20μM，培养24h。去除孔中培养基，加入DCFH-DA荧光探针，暗处孵化30分钟。用PBS洗去多余探针，测定其荧光值。

得到的不同浓度阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对由6-ODHA引发的胞内ROS抑制情况见图2。

对比例2阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由6-ODHA引发的胞内ROS的抑制

本对比例与实施例3相比，区别仅在于对比例所用的作用物为阿魏酸。得到的不同浓度阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由6-ODHA引发的胞内ROS抑制情况见图2。

实施例4阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的抑制

将PC12细胞接种至96孔板中，每孔细胞数为1×10⁴个，放置细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中，过夜培养，使细胞贴壁。过夜培养后，向孔中分别加入阿魏酸丁酯，使其孔中最终浓度分别为10,50,100μM(平行6组)，培养24h。再向每孔分别加入β-淀粉样蛋白，孔中终浓度为5μM，培养24h。去除孔中培养基，加入DCFH-DA荧光探针，暗处孵化30分钟。用PBS洗去多余探针，测定其荧光值。

得到的不同浓度阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS抑制情况见图3。

对比例3 PC12神经瘤细胞中由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS

本对比例与实施例4相比，区别仅在于对比例中不用阿魏酸丁酯处理。

得到PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS情况见图3。

对比例4阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的抑制

本对比例与实施例4相比，区别仅在于对比例中所用的作用物为阿魏酸。

得到的不同浓度阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS抑制情况见图3。

实施例5阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图

参照实施例4的操作步骤，在洗去荧光探针后，用高内涵成像系统进行拍照。

得到的不同浓度阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图见图4。

对比例5 PC12神经瘤细胞中胞内ROS的高内涵成像系统成像图

本对比例与实施例5相比，区别在于对比例不添加β-淀粉样蛋白和阿魏酸丁酯处理。

得到的PC12神经瘤细胞中的胞内ROS的高内涵成像系统成像图见图4。

对比例6 PC12神经瘤细胞中由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图

本对比例与实施例5相比，区别仅在于对比例不用作用物处理。

得到的PC12神经瘤细胞中由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图见图4。

对比例7阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图

本对比例与实施例5相比，区别仅在于对比例所用的作用物为阿魏酸。

得到的不同浓度阿魏酸在PC12神经瘤细胞中对由β-淀粉样蛋白引发的胞内ROS的高内涵成像系统成像图见图4。

实施例6阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对抗由β-淀粉样蛋白作用下氧化应激系统激活的蛋白质免疫印迹图

将PC12细胞接种至6孔板中，每孔细胞数5×10⁵个，放置细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中，过夜培养，使细胞贴壁。过夜培养后，向孔中分别加入阿魏酸丁酯，使其孔中最终浓度分别为0,5,10,50,100μM(平行6组)，培养24h。再向每孔分别加入β-淀粉样蛋白，使其孔中终浓度为5μM，培养24h。去除孔中培养基，提取细胞中蛋白。使用蛋白质免疫印迹技术，得到实验结果。

得到的不同浓度阿魏酸丁酯在PC12神经瘤细胞中对抗由β-淀粉样蛋白作用下氧化应激系统激活的蛋白质免疫印迹图见图5。

本发明以实施例1～6和对比例1～7的结果可知修饰过后阿魏酸丁酯对于细胞的保护和抑制β-淀粉样蛋白的沉聚相较于阿魏酸有更好的效果。