乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物
阅读说明：本技术 乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物 (Biomarkers for breast cancer metastasis and prognostic diagnosis ) 是由 李中伟 王典典 白津 郑骏年 侯平甫 李敏乐 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物,所述生物标志物为meR342-EZH2,发明人通过一系列实验,发现并证实meR342-EZH2能够促进乳腺癌的EMT进程和乳腺癌细胞的体外侵袭转移和体内远端转移,通过对乳腺癌患者的病例分级、转移和预后等相关分析,发现meR342-EZH2高表达和乳腺癌患者肿瘤变大、分级较高以及更多的远端转移灶点都呈现正相关,meR342-EZH2高表达预示着乳腺癌患者的较低五年生存率。因此可将meR342-EZH2用于制备或者筛选乳腺癌转移诊断试剂和乳腺癌预后诊断试剂,为乳腺癌转移和预后提供了新的诊断及评估方法。(The invention relates to a biomarker for breast cancer metastasis and prognosis diagnosis, wherein the biomarker is meR342-EZH2, the inventor discovers and proves that meR342-EZH2 can promote the EMT process of breast cancer and the in vitro invasion and metastasis and in vivo far-end metastasis of breast cancer cells through a series of experiments, and through the relevant analysis of case grading, metastasis, prognosis and the like of a breast cancer patient, the inventor discovers that meR342-EZH2 high expression and the tumor enlargement, higher grading and more far-end metastasis foci of the breast cancer patient all show positive correlation, and meR342-EZH2 high expression indicates lower five-year survival rate of the breast cancer patient. Therefore, meR342-EZH2 can be used for preparing or screening a breast cancer metastasis diagnostic reagent and a breast cancer prognosis diagnostic reagent, and a novel diagnosis and evaluation method is provided for breast cancer metastasis and prognosis.)
技术领域
本发明涉及一种乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物，属于生物医学技术领域。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，位居女性恶性肿瘤发病率的第一位。在中国，乳腺癌是女性发病率最高的癌症，而且发病率增长速度是世界平均水平的2倍，死亡数量占全世界的9.6％。由转移引发乳腺癌患者的死亡占所有死亡病例的90％以上，乳腺癌的恶性转移已经成为致死的重要原因。临床数据表明，大量肿瘤转移患者在其原位肿瘤尺寸很小的时候，就已经发生了转移，但是由于不容易检测，从而不能被及时的治疗。目前市面上还没有用于预测乳腺癌转移和有效预后评估的分子靶点和产品，因此深入探索乳腺癌转移的预后新靶点，具有十分重要的临床意义。
EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)是一个重要的组蛋白甲基转移酶，能够催化其靶基因的组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化修饰(H3K27me3)。PRC2就是通过EZH2蛋白的SETDomain使组蛋白发生H3K27me3修饰，从而导致下游的靶基因转录沉默。目前已经有很多EZH2的靶基因被发现和报道，主要是一些经典的抑制癌症发生发展和转移的抑癌基因，如E-cadherin、HOXA9、HOXA10和DAB2IP等。
本发明人研究发现：EZH2的R342位点能够被PRMT1进行非对称性二甲基化修饰(meR342-EZH2)，而且meR342-EZH2能够增强EZH2的蛋白稳定性。但是关于meR342-EZH2表达在临床肿瘤中是否有显著变化，以及meR342-EZH2是否在乳腺癌患者中恶化转移中起重要作用，目前还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物。
技术方案
一种乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物，所述生物标志物为meR342-EZH2(EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰)。
发明人结合乳腺癌临床数据，在生化、分子、细胞水平、动物模型和临床组织样本等层面上探索了meR342-EZH2的表达与乳腺癌转移的关系以及分子机制，发现并证实了meR342-EZH2能够促进乳腺癌的EMT进程，并且促进乳腺癌细胞的体外侵袭转移和体内远端转移，并通过对meR342-EZH2表达高低与乳腺癌患者的病例分级、转移和预后等相关分析，发现meR342-EZH2高表达和乳腺癌患者肿瘤变大、分级较高以及更多的远端转移灶点都呈现正相关；最后通过meR342-EZH2表达高低与乳腺癌患者的预后关系进行统计，同样发现meR342-EZH2高表达预示着乳腺癌患者的较低五年生存率。
上述生物标志物meR342-EZH2在制备或者筛选乳腺癌转移诊断试剂中的用途。
上述生物标志物meR342-EZH2在制备或者筛选乳腺癌预后诊断试剂中的用途。
一种用于检测生物标志物meR342-EZH2的抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1(TAERIKTPPKRPGGC)所示。
所述meR342-EZH2的抗体在制备乳腺癌转移诊断试剂及乳腺癌预后诊断试剂中的用途。
本发明的有益效果：本发明人提供了一种乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物meR342-EZH2，通过一系列的实验研究发现meR342-EZH2的表达与乳腺癌转移及预后相关，因此可将meR342-EZH2用于在制备或者筛选乳腺癌转移诊断试剂和乳腺癌预后诊断试剂，为乳腺癌转移和预后提供了新的诊断及评估方法，另外，本发明的生物标志物meR342-EZH2还可用于筛选治疗乳腺癌转移和预后的药物。
附图说明
图1为meR342-EZH2在乳腺癌旁组织、原位乳腺癌组织和乳腺癌转移灶中表达量的检测结果；
图2为qRT-PCR检测MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在转录水平的mRNA表达情况；
图3为Western blot检测MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在蛋白水平的表达情况；
图4为qRT-PCR检测Snail、Twist和ZEB1在转录水平的mRNA表达情况；
图5为MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞的迁移能力的Transwell测试结果；
图6为MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞的迁移能力的划痕实验测试结果；
图7为MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K细胞在裸鼠肺部的转移情况测试结果；
图8为尾静脉注射MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K细胞后的裸鼠肺组织的转移灶点统计结果；
图9为meR342-EZH2在MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K三组乳腺癌肺组织中的表达情况测试结果；
图10为meR342-EZH2的表达情况和肿瘤大小的关系的测试结果；
图11为meR342-EZH2高表达和乳腺癌患者病理分级的关系的测试结果；
图12为meR342-EZH2甲基化高表达和乳腺癌转移的关系的测试结果；
图13为meR342-EZH2的表达情况和乳腺癌患者***转移数目的关系的测试结果；
图14为meR342-EZH2表达的高低和乳腺癌患者的整体生存率的关系的测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，所用的材料来源如下：
实验中用到的质粒：
pGEX-4T-1载体的GST、GST-PRMT1、GST-EZH2(1-522AA)、GST-EZH2(523-746AA)质粒；pLKO.1载体的shEZH2-3'UTR质粒；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的3xFlag-EZH2-WT质粒均来自于徐州医科大学；
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的3xFlag-EZH2-R342K质粒构建过程如下：
(1)设计并合成如下R342K的点突变引物：
上游引物：5’-ACCGCTGAGAAGATAAAGACC-3’,
下游引物：5’-GGTCTTTATCTTCTCAGCGGT-3’。
(2)以3xFlag-EZH2-WT质粒为模板，以R342K的点突变上下游引物为引物，通过购买的天根生物科技公司的快速定点突变试剂盒(KM101)，按照试剂盒说明说，进行PCR，获得突变质粒，并转化入感受态细胞中。
(3)待菌落长出后，进行挑菌，摇菌提质粒，进行测序验证突变，测序结果表明突变序列结果正确。从而构建好pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的的3xFlag-EZH2-R342K质粒。
PAX和PMD-2G的包装质粒：均是从addgene购买获得，产品目录号：PAX 12260；PMD-2G 12259。
实验中用到的抗体：
一抗：anti-Flag M2 affinity gel来自Bimake公司(货号#B23101)；鼠源Flag和GST标签抗体来自SUNGENE BIOTECH公司(货号#KM8004和#KM8005)；鼠源EZH2抗体来自CST公司(货号#3147)；鼠源GAPDH抗体来自Proteintech公司(货号#60004-1)，兔源Ubiquitin抗体来自CST公司(货号#3933)；兔源E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗体来自CST公司(货号依次为#3195，#13116和#5741)；鼠源IgG抗体来自CST公司(货号#5415)。
二抗：辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗购买自北京中杉金桥生物技术有限公司(货号#ZB-2305和#ZB-2301)。
实验中用到的细胞及培养基：
HEK293T细胞、MCF7乳腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞均从ATCC(美国模式培养物集存库)购买(货号依次是#CRL1573、#HTB22、#HTB129)；MDA-MB-231-luc乳腺癌细胞系购自上海中科院细胞库(货号#CBP30106L)；胎牛血清从北京全式金生物技术有限公司购买(货号#FS201-02)；细胞培养所用的细胞培养基均来自Sigma公司(货号DMEM培养基#D7777；RPMI-1640培养基#D7755；L15培养基#L4386)。
实验中用到的组织样本：
所使用的临床乳腺癌组织样本，有徐州医科大学附属医院收集的367例；还有购自西安艾丽娜公司的100例乳腺癌组织芯片(货号#TMA-BR1008a)。
其它试剂耗材：
qRT-PCR使用
其它材料如无特殊说明，均可从商业途径得到，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1检测meR342-EZH2的抗体的制备
用于检测meR342-EZH2的抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1(TAERIKTPPKRPGGC)所示。
用于检测meR342-EZH2的抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用多肽合成技术，合成氨基酸序列如SEQ ID No.1所示抗体的多肽，使多肽纯度在85％以上，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；
(2)将抗原与完全佐剂(CFA)或者不完全佐剂(IFA)等体积混合后注入动物体内，免疫8次，取动物全血，进行纯化后，得到抗体。
步骤(2)中，所述动物为新西兰大白兔，取两只从维通利华公司购买来的成年雄性新西兰大白兔(编号分别为RB11081和RB11082)，分别按如下方法进行免疫，所述免疫的方法：将新西兰大白兔进行阴性血采集及第一次免疫(0天)，将0.5mL，0.25mg多肽抗原与CFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第两周进行第二次免疫，将0.5mL,0.25mg多肽抗原与CFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第四周进行第三次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第五周进行第四次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第六周进行第五次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第七周进行第六次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第八周进行第七次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第九周进行第八次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；最后在第十周取动物全血。
步骤(2)中，所述纯化方法为：
①取抗原亲和层析柱，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
②柱床平衡完毕，将需纯化抗体按1-2ml/min的速度上样于相应的层析柱，反复上样4-5遍使能与多肽发生特异性结合的抗体吸附在柱床上。
③上样完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床。
④用洗脱液glycine buffer以1-2ml/min的速度洗脱结合在柱床上的抗体。
⑤样品收集完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床。
⑥用洗脱液glycine buffer清洗柱床。
⑦再次用TE buffer平衡柱床，至于4℃保存。
⑧将洗脱得到的抗体用PBS buffer透析48h，得到纯化后的抗体。
实施例2 meR342-EZH2的表达和乳腺癌转移的关系
取100例乳腺癌组织(其中，癌旁组织10例，原位乳腺癌组织50例，***转移乳腺癌组织40例)，采用实施例1制得的抗体，通过免疫组化实验(使用中杉金桥的IHC试剂盒操作完成(中杉金桥PV600))，来检测meR342-EZH2的在正常乳腺组织、原发乳腺癌样本以及转移乳腺癌样本中的表达情况。
免疫组化实验的操作如下：
⑴常规石蜡切片，脱蜡至水，3％H2O2室温孵育10min，消除内源过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，5min/次，然后用抗原修复液(EDTA/柠檬酸钠)高压锅煮沸5min,自然冷却到室温，PBS冲洗3次，5min/次。
⑵加封闭液，室温封闭30min，PBS洗3次，5min/次。
⑶滴加适当比例稀释的meR342-EZH2抗体工作液，37℃孵育1h，PBS冲洗3次，5min/次。
⑷加山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30min。
⑸PBS冲洗3次，5min/次，再进行DAB显色，显色后用PBS洗去DAB。
⑹苏木精染料复染细胞核，水洗充分，PBS浸泡2min。。
⑺不同浓度梯度的酒精脱水处理。
⑻透化：二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min。
⑼用中性树脂封片，烘干，正置显微镜拍照。
通过上述免疫组化(IHC)实验，检测meR342-EZH2在癌旁组织、原位乳腺癌组织和***转移的乳腺癌组织中表达，对表达情况进行评分量化，结果见图1。图1是meR342-EZH2在乳腺癌旁组织、原位乳腺癌组织和乳腺癌转移灶中表达量的检测结果，可以看出，meR342-EZH2在癌旁组织、原位乳腺癌组织和***转移的乳腺癌组织中表达是有差异的，meR342-EZH2在乳腺癌旁组织中表达最少，在原位乳腺癌灶点表达稍微变多，而***转移的乳腺癌灶点中表达量最多。这说明meR342-EZH2和乳腺癌的转移可能有正相关性。
实施例3 meR342-EZH2促进乳腺癌细胞EMT进程和乳腺癌细胞的侵袭和迁移
(1)meR342-EZH2促进乳腺癌细胞EMT进程
1)慢病毒包装：前一天将293T细胞铺到6cm细胞培养板中，使转染前细胞密度达到80％；慢病毒包装的相关质粒以及转染试剂比例为核心质粒(shEZH2-3'UTR/Vector/Flag-EZH2-WT/Flag-EZH2-R342K)：PAX：PMD2G：PEI＝4：3：1：3，6cm板转染病毒质粒总量为8μg；在dorf管中加入DMEM无血清培养基，加入质粒和PEI后，轻轻吹混匀，室温静置15min；转染6h后，吸弃培养基，换成3ml DMEM完全培养基，转染48h后收集第一批病毒液，此后每24h收集一次，每次收集完换新鲜DMEM完全培养基3ml，一般收集3到4次，可储存在50ml离心管内4℃保存，然后浓缩病毒-80℃保存。
2)病毒侵染细胞步骤：将MCF7细胞铺在3.5cm细胞培养板中，密度控制在30％左右；在病毒管(分别取步骤1)三种病毒液进行侵染)中加入900μl完全培养基，混合均匀，吸弃旧培养基后，将相应的病毒混合液加入到细胞培养板中继续培养；72h后通过收取蛋白样Western blot检测侵染效率是否高效，如果效果不理想，可按照上述步骤追加侵染1次；得到MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞。
3)提取三种细胞(MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞)的RNA，逆转录后，通过qRT-PCR检测三种细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在转录水平的mRNA表达情况，通过Westernblot实验，检测MCF7-Vector对照组、MCF7-Flag-EZH2-WT野生型组和MCF7-Flag-EZH2-R342K突变组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在蛋白水平的表达情况，并通过qRT-PCR实验，检测EMT相关的转录因子(Snail、Twist和ZEB1)在转录水平的mRNA表达情况。
qRT-PCR反应程序：94℃预变性1min，94℃变性10s，60℃1min，循环数：40～50个。25μl反应体系为：ddH2O6.5μl，DNA模板3μl，引物2μM3μl，SYBR Green Mix12.5μl。qRT-PCR使用的引物如下表所示：
实验结果见图2和图3，其中，图2为qRT-PCR检测MCF7-Vecto、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况，图3为Westernblot检测MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在蛋白水平的表达情况，由图2和3可以看出，与MCF7-Vector相比，在转录水平和蛋白水平，MCF7-Flag-EZH2-WT细胞EMT间质Marker(N-cadherin和Vimentin)均明显上调，EMT上皮Marker E-cadherin有明显下调，而MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞的EMT间质Marker(N-cadherin和Vimentin)上调不明显，对应的EMT上皮MarkerE-cadherin下调也不明显。
图4为qRT-PCR检测Snail、Twist和ZEB1在转录水平的mRNA表达情况，可以看出，只有Flag-EZH2-WT过表达能够明显增强EMT相关的转录因子表达，而过表达Flag-EZH2-R342K的细胞并没有明显上调。这些结果说明meR342-EZH2在EZH2促进乳腺癌细胞EMT进程中发挥着重要作用，如果EZH2的R342位点没有被PRMT1进行非对称性二甲基化修饰(R342K突变型EZH2)，将会明显降低EZH2促进乳腺癌细胞EMT进程的能力。
(2)meR342-EZH2促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移实验
上述实验结果证实了meR342-EZH2促进乳腺癌细胞EMT进程，而EMT进程往能够增强细胞的侵袭和迁移能力。因此对MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞，通过划痕实验和Transwell小室检测meR342-EZH2对细胞侵袭和迁移能力的影响。
Transwell检测细胞的迁移能力测试：
(1)提前用无血清培养基饥饿处理细胞(MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞)12h，消化完细胞后用PBS洗2遍，去除血清的影响，最后用含0.1％的BSA重悬细胞。
(2)在24孔板中加入500μl含血清的完全培养基，把饥饿处理的细胞计数，取适量细胞(侵袭实验2x105细胞，迁移实验2x104细胞)重悬制备成200μl细胞悬液加入到Transwell小室中，注意小室与下层培养基间不能产生气泡，否则影响实验结果(侵袭实验需要提前在小室上室底部铺一层基质胶)。
(3)根据不同细胞侵袭迁移能力，在细胞培养箱内正常培养24-48h。
(4)加入500μl 0.1％结晶紫染液进行细胞染色，室温避光染色15min，然后用PBS漂洗，用棉棒擦Transwell小室内部，倒置等到小室晾干后，用倒置荧光显微镜拍照，计数统计细胞数。
图5为Transwell实验检测结果，可以看出，与MCF7-Vector以及MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞系相比较，MCF7-Flag-EZH2-WT细胞的侵袭和迁移能力明显增强。
划痕实验检测细胞的迁移能力：将MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞分别取5x105细胞铺到六孔板中，24小时后，进行用白枪尖进行划痕，用尺子辅助划线，然后用PBS冲洗去除细胞碎片，加入含1％血清的培养基，倒置显微镜拍照，检测细胞运动情况，此时时间点算作为0h起始，培养24h后，倒置显微镜下拍照，倒置显微镜下再进行拍照，作为24小时的划痕宽度，观察比较三者细胞系的迁移能力。
图6为MCF7-Vector、MCF7-Flag-EZH2-WT和MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞的迁移能力的划痕实验测试结果，可以看出：和MCF7-Vector以及MCF7-Flag-EZH2-R342K细胞相比较，MCF7-Flag-EZH2-WT细胞的愈合宽度最多，说明MCF7-Flag-EZH2-WT细胞迁移能力最强，从而说明说明meR342-EZH2对乳腺癌细胞迁移能力增强有重要作用。
实施例4 meR342-EZH2促进乳腺癌细胞体内的远端转移
实验方法：为了探索meR342-EZH2甲基化的功能，首先在带有荧光素酶(luciferase，luc)能够进行活体成像的MDA-MB-231-luc乳腺癌细胞系(购自上海中科院细胞库，货号#CBP30106L)中，通过shEZH2-3'UTR病毒侵染沉默掉内源的EZH2，构建出MDA-MB-231-luc-shEZH2-3'UTR细胞系，再通过Vector、Flag-EZH2-WT和Flag-EZH2-R342K病毒侵染MDA-MB-231-luc-shEZH2-3'UTR细胞，构建出过表达对照Vector、Flag-EZH2-WT和Flag-EZH2-R342K的MDA-MB-231-luc-shEZH2-3'UTR相应细胞系(简称为MDA-MB-231-Vector细胞、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K细胞)。建立尾静脉转移模型，实验设立3个组(MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K)，每组6只裸鼠，裸鼠从北京维通利华公司购买)，在六周龄的雌性Babl/C裸鼠中，分别通过尾静脉注射MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K细胞(2x106/只)，八周后，利用小鼠活体成像仪器，通过活体成像并统计分析荧光信号，检测相应的细胞在裸鼠肺部的转移情况。然后解剖小鼠，取出其肺组织进行观察，统计转移灶点数目，最后用采用meR342-EZH2抗体，通过免疫组化实验，测试meR342-EZH2在三组乳腺癌肺组织中的表达情况。
图7为MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K细胞在裸鼠肺部的转移情况测试结果，可以看出，MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT细胞的信号值最大，这表明meR342-EZH2对促进乳腺癌细胞的远端转移有重要作用。
图8为尾静脉注射MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K细胞后的裸鼠肺组织的转移灶点统计结果，可以看出，注射MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT细胞的肺组织转移灶点最多，MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K的灶点较少，而MDA-MB-231-Vector转移灶点最少。这表明meR342-EZH2对乳腺癌的远端转移有促进作用。
图9为meR342-EZH2在MDA-MB-231-Vector、MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT和MDA-MB-231-Flag-EZH2-R342K三组乳腺癌肺组织中的表达情况测试结果，注射MDA-MB-231-Flag-EZH2-WT细胞的meR342-EZH2最多，这说明meR342-EZH2在促进乳腺癌细胞体内远端转移过程中有重要作用。
实施例5 meR342-EZH2与乳腺癌恶性程度和不良预后成正相关
采用meR342-EZH2抗体，对从徐州医科大学附属医院收集的367例乳腺癌组织样本，通过免疫组化实验(运用中杉金桥免疫组化试剂盒(PV600))，检测meR342-EZH2在乳腺癌组织样本中的表达情况。然后通过对表达高低进行评分，并统计分析meR342-EZH2和乳腺癌患者的肿瘤大小、病理分级和转移的关系进行分析，结果见图9和图10。
图10为meR342-EZH2的表达情况和肿瘤大小的关系的测试结果，图11为meR342-EZH2高表达和乳腺癌患者病理分级的关系的测试结果，可以看出，meR342-EZH2表达越高，患者的肿瘤越大；同样发现：在乳腺癌患者的I级、II级和III级病例中，随着I级、II级和III级级数增高，meR342-EZH2在相应的乳腺癌患者中表达呈现递增趋势，这表明：meR342-EZH2和乳腺癌患者肿瘤大小以及病理分级呈现正相关。
发明人通过获得的乳腺癌患者的转移有否，以及***转移灶个数，进行统计分析，结果如图12所示：可以看出，在发生转移的乳腺癌患者中，73.1％的患者呈现meR342-EZH2甲基化EZH2高表达，在没有转移的乳腺癌患者中，54.6％的患者呈现meR342-EZH2甲基化EZH2高表达，这也说明meR342-EZH2甲基化高表达和乳腺癌转移可能呈现高度正相关性。
发明人进一步根据meR342-EZH2表达高低，分成meR342-EZH2低表达组和meR342-EZH2高表达组乳腺癌患者，统计这两组乳腺癌患者中相对于的***转移灶点数目，进行分析，结果如图13所示，可以看出，和meR342-EZH2低表达组的乳腺癌患者相比较，meR342-EZH2高表达组的乳腺癌患者***转移数目明显较多，从而进一步说明：meR342-EZH2和乳腺癌患者发生远端转移呈现正相关。
最后，发明人通过分析meR342-EZH2表达的高低和乳腺癌患者的整体生存率的关系。如图14所示，可以看出，在meR342-EZH2高表达(meR342-EZH2 High)的乳腺癌患者组中，其五年总体生存率明显低于meR342-EZH2低表达(meR342-EZH2 High)的乳腺癌患者组。这说明：me R342-EZH2高表达会导致乳腺癌患者的不良预后。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 乳腺癌转移和预后诊断的生物标志物
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 组蛋白甲基转移酶(Enhancer of Zeste Homolog 2)
<400> 1
Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly Cys
1 5 10 15