阅读说明：本技术 一种l-丙氨酸异丙酯中对映异构体含量的检测方法 (Method for detecting content of enantiomer in isopropyl L-alanine ) 是由 沙薇 杨苗苗 吕艳歌 于 2018-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物分析领域,具体涉及一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中对映异构体含量的高效液相色谱检测方法。所述方法包括：照高效液相色谱法测定,用冠醚手性色谱柱,以pH1.0的高氯酸水溶液为流动相。本发明可以有效地分离L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体,能够更准确地检测对映异构体的含量。本方法采用反相方法,等度洗脱,简单易操作,且峰形较好,分离度合格；方法学验证显示本方法专属性强,灵敏度高,准确度、耐用性均良好。(The invention belongs to the field of pharmaceutical analysis, and particularly relates to a high performance liquid chromatography detection method for content of an enantiomer in L-alanine isopropyl ester hydrochloride. The method comprises the following steps: performing high performance liquid chromatography, and using crown ether chiral chromatographic column and perchloric acid aqueous solution with pH of 1.0 as mobile phase. The method can effectively separate L-alanine isopropyl ester hydrochloride and the enantiomer thereof, and can more accurately detect the content of the enantiomer. The method adopts a reverse phase method, isocratic elution, is simple and easy to operate, has better peak shape and qualified separation degree; the methodological verification shows that the method has strong specificity, high sensitivity, good accuracy and good durability.)

一种L-丙氨酸异丙酯中对映异构体含量的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中对映异构体含量的高效液相色谱检测方法。

背景技术

L-丙氨酸异丙酯盐酸盐：分子式为C₆H₁₄ClNO₂，分子量为167.63，其化学结构为：

L-丙氨酸异丙酯盐酸盐为替诺福韦艾拉酚胺合成过程中的一种重要的起始原料，具有一个手性中心，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的对映异构体杂质是替诺福韦艾拉酚胺手性杂质来源之一，需严格地控制L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映体的含量。

目前L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体无药典等法定标准。因此，有必要开发一种检测L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中对映异构体的方法，该方法必须能够有效分离L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体。有鉴于此，本发明提供了一种方法，能够满足该要求，该方法能够有效分离L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体，保证检测的有效性，能够准确严格地控制L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的质量。

发明内容

本发明为解决该问题提供了一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中对映异构体含量的高效液相色谱检测方法，该方法能够有效分离L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体，保证检测的有效性，能够准确严格地控制替诺福韦艾拉酚胺的质量，该方法专属性强，灵敏度高，准确度与耐用性良好。

本发明提供了一种L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中对映异构体含量的高效液相色谱检测方法。所述方法包括：照高效液相色谱法测定，用冠醚手性色谱柱，以pH1.0的高氯酸水溶液为流动相，在一定条件下进行等度洗脱。包括以下步骤：

在高效液相色谱仪上进行检测

色谱柱填充剂：硅胶表面涂敷有手性冠醚

柱温：15℃~25℃

流速：0.3mL/min~0.7 mL/min

检测波长：203nm~207nm

流动相：酸性水溶液

稀释液：纯化水

系统适用性溶液配制：分别取杂质TN-SM2-R2对照品、对映异构体对照品和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐各适量，加纯化水溶解并稀释制成每1ml中约含杂质TN-SM2-R2和对映异构体各50μg，含L-丙氨酸异丙酯盐酸盐2.5mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

样品溶液配制：取本品适量，精密称定，置量瓶中，加纯化水溶解并稀释制成每1ml约含5mg的溶液。

对照溶液配制：取样品溶液适量，加纯化水稀释制成每1ml约含25μg的溶液。

所述色谱柱以硅胶表面涂敷有手性冠醚为填充剂，优选CROWNPAKCR（+）（4.0mm×150mm，5μm）。

所述流动相流动相为pH1.0~2.0的高氯酸水溶液，pH优选1.0。

所述柱温为15℃~25℃，优选20℃。

所述流速为0.3 mL/min~0.7mL/min，优选0.5 mL/min。

所述波长为203nm~207nm，优选205nm。

所述的系统适用性溶液中各峰之间均能够达到基线分离,分离度≥1.5。

所述的对映异构体的计算方法为自身对照法。

采用本发明提供的检测方法，能够使L-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体有效分离，保证检测的有效性，能够准确严格地控制L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的质量，该方法专属性强，灵敏度高，准确度与耐用性良好。

具体实施方式

为对本发明进行详细说明，下面结合具体实施例做进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的保护范围。凡是依据本发明的技术实质对以下实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明要求保护的范围。

实施例1

专属性试验

采用本发明中的方法。

色谱柱：CROWNPAKCR（+）（4.0mm×150mm，5μm）

流动相：pH1.0的高氯酸水溶液

流速：0.5ml/min

柱温：20℃

检测波长：205nm

进样体积：20μl

实验步骤：

空白溶剂：纯化水

系统适用性溶液配制：分别取杂质TN-SM2-R2对照品、对映异构体对照品和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品各适量，加纯化水溶解并稀释制成每1ml中约含杂质TN-SM2-R2和对映异构体各50μg，含L-丙氨酸异丙酯盐酸盐2.5mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

样品溶液配制：取本品适量，精密称定，置量瓶中，加纯化水溶解并稀释制成每1ml约含5mg的溶液。

对照溶液配制：取样品溶液适量，加纯化水稀释制成每1ml约含25μg的溶液。

取上述各溶液20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

空白溶剂的结果见附图1。

系统适用性溶液的结果见附图2。

样品溶液的结果见附图3。

对照溶液的结果见附图4。

结果：空白溶剂不干扰L-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其对映异构体的检测，该方法专属性良好。附图2中从左往右峰依次为TN-SM2-R2、对映异构体、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐，其分离度分别为13.18和6.59，均大于1.5，能够达到基线分离。

实施例2

检测限和定量限试验。

采用实施例1中的色谱方法。

实验步骤：

空白溶剂：纯化水

检测限和定量限溶液：取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐和对映异构体对照品适量，分别加无水纯化水配制成一系列浓度的溶液，依法测定。以信噪比判定物质的定量限和检测限。

结果见下表1。

实施例3

线性关系与范围

采用实施例1中的色谱方法。

实验步骤：

空白溶剂：纯化水

线性溶液：取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐和对映异构体对照品适量，分别加纯化水配制成一系列浓度的溶液，依法测定。

结果：L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体在0.5214μg/ml-20.8560μg/ml浓度范围内线性关系良好，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐在0.5410μg/ml-21.6560μg/ml浓度范围内线性关系良好。具体结果见下表2，线性关系图见附图5、图6。

实施例4

回收率试验

采用实施例1中的色谱方法。

实验步骤：

精密称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，置量瓶中，精密加入L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体贮备液适量，用纯化水溶解并稀释至刻度，配制成相对浓度分别50%、100%、150%的溶液，摇匀，作为供试品溶液。每个浓度平行制备3份。另精密称定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，用纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为空白样品溶液。另精密量取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体贮备液适量，用纯化水定量稀释制成合适浓度的溶液，作为对照品溶液。精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。计算回收率。

结果：各浓度下L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体的回收率均符合药典规定，本方法准确度良好。具体数据见下表3。

实施例5

耐用性试验

采用实施例1中的色谱方法。

实验步骤：

系统适用性溶液配制：分别取杂质TN-SM2-R2对照品、对映异构体对照品和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品各适量，加纯化水溶解并稀释制成每1ml中约含杂质TN-SM2-R2和对映异构体各50μg，含TNh2.5mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

样品溶液配制：取本品适量，精密称定，置量瓶中，加纯化水溶解并稀释制成每1ml约含5mg的溶液。

对照溶液配制：取样品溶液适量，加纯化水稀释制成每1ml约含25μg的溶液。

精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。

结果：在色谱条件微小改变的情况下，对映异构体的含量基本无差异，各条件下系统适用性溶液的分离度均大于1.5，能够达到基线分离，本方法耐用性良好。具体结果见下表4。

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附图说明：

空白溶剂的结果见附图1；

系统适用性溶液的结果见附图2；

样品溶液的结果见附图3；

对照溶液的结果见附图4；

线性关系图见附图5、图6。