阅读说明：本技术 一种南五味子药材uplc特征图谱的构建方法及其鉴别方法 (Construction method and identification method of UPLC (unified Power level liquid chromatography) characteristic spectrum of kadsura longepedunculata medicinal material ) 是由 陈芳 梁月仪 刘晓霞 李乐 孙冬梅 王利伟 陈向东 魏梅 程学仁 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种南五味子药材UPLC特征图谱构建方法及其鉴别方法,所述的南五味子药材UPLC特征图谱的构建方法包含如下步骤：(1)精密称取南五味子药材,制备得到南五味子药材供试品溶液；(2)将南五味子药材供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析,得到南五味子药材UPLC特征图谱。本发明采用UPLC法能从根本上快速、准确的鉴别和区分南五味子,具有一定的特征性；本发明所述的方法稳定且专属性强,基线平稳,为南五味子药材质量控制提供科学的新方法；本发明使南五味子药材的质量控制从原来的某几个成分含量测定,上升为对整个药品的品质检测,避免了单一的化学成分检验的缺陷。(The invention relates to a construction method and an identification method of UPLC (ultra performance liquid chromatography) characteristic spectrum of kadsura longepedunculata medicinal material, wherein the construction method of the UPLC characteristic spectrum of the kadsura longepedunculata medicinal material comprises the following steps: (1) precisely weighing the kadsura longepedunculata medicinal material, and preparing a kadsura longepedunculata medicinal material test solution; (2) analyzing the sample solution of the Kadsura longepedunculata medicinal material by using an ultra-high performance liquid chromatograph to obtain a UPLC characteristic spectrum of the Kadsura longepedunculata medicinal material. The method adopts a UPLC method, can fundamentally, quickly and accurately identify and distinguish the kadsura longepedunculata, and has certain characteristics; the method is stable, has strong specificity and stable baseline, and provides a scientific new method for controlling the quality of the kadsura longepedunculata medicinal material; the invention improves the quality control of the kadsura longepedunculata medicinal material from the original content measurement of certain components to the quality detection of the whole medicine, and avoids the defect of single chemical component detection.)

一种南五味子药材UPLC特征图谱的构建方法及其鉴别方法

技术领域

本发明属于中药鉴别领域，具体涉及一种南五味子药材UPLC特征图谱的构建方法及其鉴别方法。

背景技术

《中国药典》2015年版一部收载南五味子来源为木兰科植物华中五味子的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采摘，晒干，除去果梗和杂质。《本经》记载：“南五味子主益气，咳逆上气，劳伤赢瘦，补不足，强阴，益男子精”。南五味子中药功效在于滋补强壮之力，药用价值极高，具有益气生津、敛肺滋肾、止泻、涩精、安神等功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、气短脉虚、内热、消渴、心悸失眠等证。南五味子主要含有五味子甲素、五味子酯甲、乙、丙、丁、戊等木脂素类及挥发油类成分。现代药理研究表明，南五味子具显著的抗氧化、抗癌、抗病毒、护肝等作用，可用于治疗糖尿病、小儿泄泻、失眠、顽固性荨麻疹等病症。

近年来，由于中药有效成分多样性及复杂性，过往单一成分含量测定不足以说明中药材的质量，亦缺乏专属性。中药指纹图谱既能全面反映中药个体之间的共性，亦能反映中药种群之间的唯一性。运用中药指纹图谱控制中药质量，比目前沿用的方法提供的信息更为全面、丰富，可以为南五味子质量控制提供全面的质量控制手段。

目前，鉴别方法包括传统方法和与现代科技结合的色谱方法。现阶段，传统的眼看、口尝、鼻闻、手摸等简便方法由于主观性强，在中药材鉴别已非常局限，而色谱方法诸如UV、IR、NIR、TLC中存在大量的假阳性和假阴性问题，容易导致结论的偏差。目前文献研究关于南五味子的指纹图谱研究并不多，因此，本发明采用超高效液相色谱法（UPLC法）建立南五味子特征图谱，能快速，准确的鉴别南五味子药材。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种南五味子药材的UPLC特征图谱的构建方法及其鉴别方法，该方法快速、稳定且专属性强，能够更全面的反应南五味子药材的特征，为南五味子药材质量控制提供科学的新方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：

一种南五味子药材UPLC特征图谱的构建方法，其包含如下步骤：

（1）精密称取南五味子药材，制备得到南五味子药材供试品溶液；

（2）将南五味子药材供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析，得到南五味子药材UPLC特征图谱。

作为一种优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05~0.15%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.25~0.35mL/min，柱温为25~35℃，检测波长为210~250nm，进样量为0.6~1.8μl。

作为一种最优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，检测波长为230nm，进样量为1μl。

作为一种优选方案，梯度洗脱条件为：0~10min，流动相A的体积分数变化为2~10%，流动相B的体积分数变化为98~90%；10~11min，流动相A的体积分数变化为10~51%，流动相B的体积分数变化为90~49%；11~26min，流动相A的体积分数变化为51~54%，流动相B的体积分数变化为49~46%；26~40min，流动相A的体积分数变化为54~95%，流动相B的体积分数变化为46~5%；40~40.01min，流动相A的体积分数变化为95~2%，流动相B的体积分数变化为5~98%；40.01~45min，流动相A的体积分数为2%，流动相B的体积分数为98%。

作为一种优选方案，所述的供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到：取南五味子粉末0.3~0.7g，精密称定，置具容器中，精密加入60~80%乙醇40~60ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用60~80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种最优选方案，所述的供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到：取南五味子粉末0.5g，精密称定，置具容器中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

本发明还提供了一种南五味子药材的鉴别方法，包括如下步骤：

（1）精密称取待鉴别南五味子药材，制备得到待鉴别南五味子药材样品溶液；

（2）精密吸取待鉴别南五味子药材样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得待鉴别南五味子药材UPLC特征图谱；

（3）将测得的UPLC特征图谱与构建出的南五味子药材UPLC特征图谱进行比对，若与南五味子药材UPLC特征图谱一致，则为质量合格的南五味子药材。

作为一种优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05~0.15%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.25~0.35mL/min，柱温为25~35℃，检测波长为210~250nm，进样量为0.6~1.8μl。

作为一种最优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，检测波长为230nm，进样量为1μl。

作为一种优选方案，梯度洗脱条件为：0~10min，流动相A的体积分数变化为2~10%，流动相B的体积分数变化为98~90%；10~11min，流动相A的体积分数变化为10~51%，流动相B的体积分数变化为90~49%；11~26min，流动相A的体积分数变化为51~54%，流动相B的体积分数变化为49~46%；26~40min，流动相A的体积分数变化为54~95%，流动相B的体积分数变化为46~5%；40~40.01min，流动相A的体积分数变化为95~2%，流动相B的体积分数变化为5~98%；40.01~45min，流动相A的体积分数为2%，流动相B的体积分数为98%。

作为一种优选方案，所述的供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到：取南五味子粉末0.3~0.7g，精密称定，置具容器中，精密加入60~80%乙醇40~60ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用60~80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种最优选方案，所述的供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到：取南五味子粉末0.5g，精密称定，置具容器中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

有益效果：（1）本发明采用UPLC法能从根本上快速、准确的鉴别和区分南五味子，具有一定的特征性；（2）本发明所述的方法稳定且专属性强，基线平稳，为南五味子药材质量控制提供科学的新方法；（3）本发明通过对13批不同产地南五味子药材进行测定，共确定了7个特征峰，对7个共有峰进行了化学成分的指认，以1号峰为原儿茶酸峰，2号峰为五味子酯丙峰，3号峰为五味子酯甲峰，4号峰为五味子酯乙峰，5号峰为安五脂素峰，6号峰为五味子甲素峰，7号峰为五味子酯丁峰，以第3号峰五味子酯甲为参照峰，制订了南五味子药材特征图谱分析方法的参考数据；（4）本发明从南五味子药材特有的指纹图谱角度，选取特征峰，计算特征峰的相对保留时间与相对峰面积，构成南五味子药材特征图谱的全貌，是南五味子药材的质量控制从原来的某几个成分含量测定，上升为对整个药品的品质检测，避免了单一的化学成分检验的缺陷。

附图说明

图1为13批南五味子药材UPLC特征图谱叠加图；

图2为13批南五味子药材UPLC对照特征图谱；

图3为南五味子药材UPLC色谱峰对照品指认图；

图4为五味子酯甲化学结构图；

图5为五味子酯乙化学结构图；

图6为五味子酯丙化学结构图；

图7为五味子酯丁化学结构图；

图8为五味子甲素化学结构图；

图9为原儿茶酸化学结构图；

图10为安五脂素化学结构图；

图11为待鉴别南五味子药材UPLC特征图谱。

图中标记：1号峰为原儿茶酸峰，2号峰为五味子酯丙峰，3号峰为五味子酯甲峰，4号峰为五味子酯乙峰，5号峰为安五脂素峰，6号峰为五味子甲素峰，7号峰为五味子酯丁峰，A：供试品溶液；B五味子酯甲；C：五味子酯乙；D：五味子酯丙；E：五味子酯丁；F：原儿茶酸；G：安五脂素。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

南五味子药材特征图谱的构建

本实施例13批（批号S1至S13）南五味子药材来自各大药店，且经过相关机构检测合格。

试验方法

对照品溶液的制备

取五味子酯甲对照品，加甲醇溶解制成每1ml含100μg的对照品溶液；取五味子甲素对照品，加甲醇溶解制成每1ml含110μg的对照品溶液；取五味子酯乙对照品，加甲醇溶解制成每1ml含80μg的溶液；取五味子酯丙对照品，加甲醇制成每1ml含80μg的对照品溶液；取五味子酯丁对照品，加甲醇溶解制成每1ml含40μg的对照品溶液；取安五脂素对照品，加甲醇溶解制成每1ml含80μg的对照品溶液；取原儿茶酸对照品，加甲醇溶解制成每1ml含50μg的对照品溶液，即得。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，检测波长为230nm，进样量为1μl。

梯度洗脱条件为：0~10min，流动相A的体积分数变化为2~10%，流动相B的体积分数变化为98~90%；10~11min，流动相A的体积分数变化为10~51%，流动相B的体积分数变化为90~49%；11~26min，流动相A的体积分数变化为51~54%，流动相B的体积分数变化为49~46%；26~40min，流动相A的体积分数变化为54~95%，流动相B的体积分数变化为46~5%；40~40.01min，流动相A的体积分数变化为95~2%，流动相B的体积分数变化为5~98%；40.01~45min，流动相A的体积分数为2%，流动相B的体积分数为98%。

南五味子药材供试品溶液的制备：取南五味子粉末0.5g，精密称定，置具容器中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

特征图谱方法学考察

精密度试验

随机取南五味子药材S1~S13号样品，制备成供试品溶液，在规定的色谱条件下连续进样6次，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，所得共有峰的相对峰面积与相对保留时间RSD<2%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验

随机取南五味子药材S1~S13号样品，制备成供试品溶液，在规定的色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12h进样测定，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，并计算RSD值。所得共有峰的相对峰面积与相对保留时间RSD<2%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

重复性试验

随机取南五味子药材S1~S13号样品，制备供试品溶液6份，在规定的色谱条件下，进样测定，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，并计算RSD值。所得共有峰的相对峰面积和相对保留时间RSD<2%，表明该方法重复性良好。

样品测定

取13批南五味子药材样品，制备供试品溶液，在规定的色谱条件下，记录UPLC图谱。南五味子药材色谱峰叠加图谱见图1。

南五味子药材特征图谱共有峰的确定

采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)”对13批南五味子药材UPLC图谱进行结果分析，共确定7个共有峰，见图2。经对照品对照，如图3所示，7个共有峰中，1号峰为原儿茶酸峰，2号峰为五味子酯丙峰，3号峰为五味子酯甲峰，4号峰为五味子酯乙峰，5号峰为安五脂素峰，6号峰为五味子甲素峰，7号峰为五味子酯丁峰。其化学成分结构如图4~图10所示，第3号峰咖啡酸峰分离度好，峰形对称，故以第3号峰（五味子酯甲峰）为参照峰（即为S峰），分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各样品共有峰的相对保留时间RSD在合理区间内，表明共有峰选择的准确性；而不同样品各共有峰的峰面积相差比较大，表明不同产地的南五味子药材共有峰含量存在一定的差异，见表1、表2。

表1 13批南五味子药材特征图谱相对保留时间

表2 13批南五味子药材特征图谱相对峰面积

南五味子药材特征图谱相似度评价

采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012.0版本)”对S1～S13号南五味子药材样品特征图谱进行叠加，进行共有峰标识，并生成对照图谱，考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价，结果见、表3。结果表明13批不同产地南五味子药材样品的相似度均在0.9以上，说明样品特征图谱与对照图谱的相似度较高，7个共有峰在各样品中均能稳定出现，且吻合度较好，因此该图谱可做为南五味子药材的特征图谱。

表3 不同南五味子样品的相似度

实施例2

南五味子药材鉴别方法，鉴别步骤如下：

（1）精密称取待鉴别南五味子药材，制备得到待鉴别南五味子药材样品溶液；

（2）精密吸取待鉴别南五味子药材样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得待鉴别南五味子药材UPLC特征图谱；

（3）将测得的UPLC特征图谱与构建出的南五味子药材UPLC特征图谱进行比对，若与南五味子药材UPLC特征图谱一致，则为质量合格的南五味子药材。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，检测波长为230nm，进样量为1μl。

梯度洗脱条件为：0~10min，流动相A的体积分数变化为2~10%，流动相B的体积分数变化为98~90%；10~11min，流动相A的体积分数变化为10~51%，流动相B的体积分数变化为90~49%；11~26min，流动相A的体积分数变化为51~54%，流动相B的体积分数变化为49~46%；26~40min，流动相A的体积分数变化为54~95%，流动相B的体积分数变化为46~5%；40~40.01min，流动相A的体积分数变化为95~2%，流动相B的体积分数变化为5~98%；40.01~45min，流动相A的体积分数为2%，流动相B的体积分数为98%。

待鉴别南五味子药材样品溶液的制备

取南五味子粉末0.5g，精密称定，置具容器中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

样品测定

取待鉴别南五味子药材样品，制备供试品溶液，在规定的色谱和质谱条件下，记录UPLC图谱，见图11。

将测定的南五味子药材特征图谱与构建出的南五味子药材特征图谱进行比较，与构建出的南五味子药材特征图谱一致，则该待鉴别南五味子药材质量合格。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。