吲达帕胺原料药中dcu的检测方法
阅读说明：本技术 吲达帕胺原料药中dcu的检测方法 (Detection method of DCU in indapamide bulk drug ) 是由 练城 张萍 朱婷 王芝 龚明峰 陈小波 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种吲达帕胺原料药中DCU的检测方法。其是利用气相色谱对吲达帕胺原料药中DCU进行检测,包括以下步骤：(1)配制吲达帕胺原料药供试品溶液；(2)配制DCU的对照品溶液；(3)进样,按以下条件对步骤(1)供试品溶液和步骤(2)中的对照品溶液分别进行检测：色谱条件：固定相为100％聚二甲基硅氧烷的毛细管柱,规格：30m×0.25mm×0.25μm,载气为惰性气体,进样口温度为310-350℃,检测器温度为330℃,分流比为1-50：1,初始柱流速为1.0-2.0ml/min,升温程序为：初始温度45-80℃,保持2min,以25-70℃/min的速率升温至230℃,保持5min,再继续以40℃/min的速率升温至280℃,保持15min。本发明使用的试剂毒性小,杂质干扰少,检测方法可靠稳定,对吲达帕胺原料药的质量控制具有重要意义。(The invention relates to a method for detecting DCU in indapamide bulk drug. The method is used for detecting DCU in indapamide bulk drug by using gas chromatography, and comprises the following steps: (1) preparing a test solution of the indapamide bulk drug; (2) preparing a DCU reference substance solution; (3) and (3) injecting samples, and respectively detecting the sample solution in the step (1) and the reference substance solution in the step (2) according to the following conditions: chromatographic conditions are as follows: the stationary phase is a capillary column of 100% polydimethylsiloxane, and the specification is as follows: 30m is multiplied by 0.25mm is multiplied by 0.25 mu m, the carrier gas is inert gas, the injection port temperature is 310-: 1, the initial column flow rate is 1.0-2.0ml/min, and the temperature rise program is as follows: the initial temperature is 45-80 deg.C, maintaining for 2min, heating to 230 deg.C at 25-70 deg.C/min, maintaining for 5min, heating to 280 deg.C at 40 deg.C/min, and maintaining for 15 min. The reagent used in the invention has low toxicity, less impurity interference and reliable and stable detection method, and has important significance for quality control of the indapamide bulk drug.)
技术领域
本发明涉及一种吲达帕胺原料药中DCU的检测方法。
背景技术
吲达帕胺为磺胺类利尿药，具有利尿和钙拮抗作用，是一种强效、长效的降压药，临床上还用于充血性心力衰竭时水钠潴留的治疗。DCC(二环己基碳二亚胺)和DCU(二环己基脲)为吲达帕胺合成工艺中的残留物，其残留浓度可能会造成产品严重的质量后果。目前国标HG/T5320-2018中仅公开了DCC质量分数的测定方法，但没有建立关于DCU含量的检测方法。进一步的，国内也没有其他专利或者文献公开关于DCU含量的检测方法。而欧洲药典和美国药典中，也没有建立关于吲达帕胺中DCU含量的检测方法，仅仅是在其他类型药物中(洛莫司汀原料药)建立了采用高效液相色谱测定DCU含量的方法。综上所述，建立一种吲达帕胺原料药中DCU含量的测定方法实为必要。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种吲达帕胺原料药中DCU的检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：吲达帕胺原料药中DCU的检测方法，利用气相色谱对吲达帕胺原料药中DCU进行检测，包括以下步骤：
(1)配制吲达帕胺原料药供试品溶液；
(2)配制DCU的对照品溶液；
(3)进样，按以下条件对步骤(1)供试品溶液和步骤(2)中的对照品溶液分别进行检测：
色谱条件：固定相为100％聚二甲基硅氧烷的毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm，载气为惰性气体，优选为氮气，进样口温度为310-350℃，检测器温度为330℃，分流比为1-50：1，初始柱流速为1.0-2.0ml/min,升温程序为：初始温度45-80℃，保持2min，以25-70℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min。
其中，柱流速为1.0-2.0ml/min保持11.5min，以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min。
其中，进样口温度为320℃。
优选地，分流比为2-4：1。
优选地，初始柱温为45-80℃。
更优选地，初始柱温为45-50℃。
其中，色谱条件中进样量为1μL。
其中，步骤(1)中吲达帕胺原料药的浓度为1-10mg/ml。
其中，步骤(2)中DCU的浓度为1.5-15μg/ml。
本发明中，所涉及到的计算公式如下：
加标样品中DCU本底含量(mg)＝加标样品供试品称样量(mg)×本底中DCU含量(mg/mg)
其中：A供试品＝本底供试品中DCU峰面积；
C对照＝对照溶液中DCU的浓度，单位：mg/ml；
A对照＝对照溶液中DCU的峰面积；
W供试品＝本底供试品称样量，单位：mg；
A加标样＝加标样品中DCU峰面积；
V＝加标样品或本底样品稀释体积，单位：ml。
1、本发明对气相色谱条件中的初始柱温进行了优化：
优化时：色谱柱：Elite-1，30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气,流速为1.5ml/min保持11.5min,以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min；进样口温度为320℃；检测器温度为330℃；进样量为1μl；分流进样，分流比3：1。
取加标样品溶液在初始柱温分别为40℃、45℃、50℃、55℃、80℃，保持2min，以40℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min，分别进样检测，初始柱温为40℃时降温较慢，其他温度时DCU色谱峰峰型以及与其他相邻色谱峰的分离度均较良好，均能达到DCU检测要求。
2、本发明对气相色谱条件中的分流比进行了优化：
优化时，色谱柱：Elite-1，30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气,流速为1.5ml/min保持11.5min,以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min；初始柱温为50℃，保持2min，以40℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min；进样口温度为320℃；检测器温度为330℃；进样量为1μl。
改变分流比分别为1:1，2:1，3:1，6:1，10:1，20:1，40:1，50:1，取加标样品溶液分别进样检测，DCU色谱峰峰型以及与其他相邻色谱峰的分离度均较良好，均能达到DCU的检测要求，分流比为50:1时，DCU色谱峰的信噪比为18.9，接近定量要求的信噪比为10，所以分流比不得大于50:1。
3、本发明对气相色谱条件中的初始柱流速进行了优化：
优化时：色谱柱：Elite-1，30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气；初始柱温为50℃，保持2min，以40℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min；进样口温度为320℃；检测器温度为330℃；进样量为1μl，分流比为3:1。
取加标样品溶液在载气初始流量分别为1.0ml/min、1.5ml/min、2.0ml/min保持11.5min,以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min，分别进样检测，各流速条件下DCU色谱峰峰型以及与其他相邻色谱峰的分离度均较良好，均能达到DCU检测要求。
4、本发明对气相色谱条件中的升温速率进行了优化：
优化时：色谱柱：Elite-1，30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气，流速为1.5ml/min保持11.5min,以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min；初始柱温为50℃，保持2min，以40℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min；进样口温度为320℃；检测器温度为330℃；进样量为1μl，分流比为3:1。
初始柱温为50℃，保持2min，改变升温速率分别以25℃/min、30℃/min、35℃/min、40℃/min、45℃/min、50℃/min、60℃/min、70℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min，取加标样品溶液分别进样检测，各升温速率条件下DCU色谱峰峰型以及与其他相邻色谱峰的分离度均较良好，均能达到DCU检测要求。
本发明检测吲达帕胺原料药中DCU含量，线性范围在0.752-15.04μg/ml之间，检出限为0.376μg/ml,回收率大于98％。本发明所提供的吲达帕胺原料药中DCU含量的检测方法，使用的试剂毒性小，杂质干扰少，检测方法可靠稳定，对吲达帕胺原料药的质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中编号为1的供试品溶液的色谱图；
图2为实施例2中编号为2的供试品溶液的色谱图；
图3为实施例2中编号为3的供试品溶液的色谱图；
图4为实施例2中编号为4的供试品溶液的色谱图；
图5为实施例2中DCU对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
吲达帕胺原料药中DCU的检测方法，利用气相色谱对吲达帕胺原料药中的DCU含量进行检测，具体步骤如下：
1.仪器药品与试剂
仪器：气相色谱仪(Agilent7890B)
试剂：无水乙醇(默克，K50144627815)、DCU(阿拉丁，H1809065)。
2.实验方法
2.1供试品溶液的配制：取吲达帕胺原料药125mg至25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀,作为供试品溶液。
2.2对照品溶液的配制：取DCU对照品75mg至100ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml至100ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。
2.3色谱条件：
色谱条件：固定相为100％聚二甲基硅氧烷的毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气；
进样口温度为320℃；
检测器温度为330℃；
进样量为1μl；
分流进样，分流比3：1；
柱流速为1.5ml/min保持11.5min,以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min；升温程序为初始温度50℃，保持2min，以40℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min；
分析方法验证结果如下：
1.系统适用性
取DCU对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，结果如下：
表1系统适应性的验证结果
2.专属性
空白溶剂：无水乙醇；
加标样品溶液：取吲达帕胺原料药125mg至25ml容量瓶中，加对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；
分别取空白溶剂、对照品溶液、加标样品溶液注入气相色谱仪，记录色谱图，结果如下：
表2专属性的验证结果
3.线性关系
线性对照品储备液：取DCU对照品75mg至100ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取对照品储备液，按照下表配制不同浓度线性溶液。
表3线性关系中各梯度溶液的配制
水平
线性储备溶液体积(ml)
定容体积(ml)
LOQ(10％)
0.2
100
25％
0.5
200
50％
1
200
100％
1
100
150％
3
200
200％
2
100
分别取上述不同浓度的线性对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以DCU浓度为X轴，以峰面积为Y轴做线性回归，结果如下：
表4线性关系的验证结果
4.准确度
空白溶剂：无水乙醇；
加标样品溶液：取吲达帕胺原料药125mg9份分别至9个25ml容量瓶中，然后分别用50％、100％、200％的线性溶液(见线性关系下的溶液配制表格)溶解并稀释至刻度，摇匀，每个浓度水平平行配制3份；
本底样品溶液(配制两份)：取吲达帕胺原料药125mg至25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
分别取空白溶剂、对照品溶液、加标样品溶液、本底样品溶液注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算加标样品中DCU的回收率，结果如下：
表5准确度的验证结果
5.重复性
空白溶剂：无水乙醇；
加标样品溶液：取吲达帕胺原料药125mg至25ml容量瓶中，加对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标样品溶液。(配制6份)
本底样品溶液：取吲达帕胺原料药125mg至25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。(配制2份)
分别取空白溶剂、对照品溶液、加标样品溶液、本底样品溶液注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算加标样品DCU的回收率，结果如下图所示：
表6重复性的验证结果
6.中间精密度
更换另一实验员，在不同天按照重复性项下方法配制溶液，计算DCU回收率，结果如下：
表7中间精密度的验证结果
7.检测限
取对照品溶液逐步稀释，并注入气相色谱，记录色谱图。当信噪比约为3/1时的浓度即为检测限浓度。结果如下：
表8检测限的实验结果
8.定量限
取对照品溶液逐步稀释，并注入液相色谱仪，记录色谱图。当信噪比约为10/1时的浓度即为定量限浓度。结果如下：
表9定量限的实验结果
9.溶液稳定性
加标样品溶液：取吲达帕胺原料药125mg至25ml容量瓶中，加对照品溶液并稀释至刻度，摇匀。
取DCU对照品溶液及100％加标样品室温放置，并在不同时间点进样，记录色谱图峰面积，结果如下：
表10溶液稳定性的验证结果
10.耐用性
取溶液稳定性项下对照品溶液和加标样品溶液，分别改变色谱条件：初始柱温±5℃；载气流速±0.5ml/min；进样口温度±20℃；升温速率±5℃；分流比等条件测试DCU加标样品回收实验结果，并将测定结果与标准条件比较，结果如下：
表11耐用性的验证结果
耐用性条件
回收率(％)
与标准条件的绝对差值(％)
标准条件
100.4
/
初始柱温45℃
102.2
1.8
初始柱温50℃
98.7
1.7
载气流速1.0mL/min
103.5
3.1
载气流速2.0mL/min
103.1
2.7
进样口温度310℃
104.1
3.7
进样口温度350℃
97.7
2.7
升温速率35℃/min
101.3
0.9
升温速率45℃/min
102.3
1.9
分流比2:1
103.8
3.4
分流比4:1
101.8
1.4
上表的分析结果：说明本发明所提供的方法符合ICH方法学验证和中国药典2015版四部的相关指导原则要求，能够准确测定吲达帕胺原料药中的DCU含量，为该原料药的质量控制提供可靠的检测方法。
实施例2
取四种不同批次的吲达帕胺原料药配制成供试品溶液，分别编号为1-4，将上述四种供试品溶液和对照品溶液分别按照上述色谱条件进行进样检测，其中图1为编号为1的供试品溶液的色谱图，图2为编号为2的供试品溶液的色谱图，图3为编号为3的供试品溶液的色谱图，图4为编号为4的供试品溶液的色谱图，图5为DCU对照品溶液的色谱图，通过与对照品溶液中DCU物质峰面积的比较按照外标法计算得到供试品溶液中DCU的含量如下表所示：
表12不同批次吲达帕胺原料药中DCU的含量
1
2
3
4
含量(μg)
4.07
21.30
44.64
73.90
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。