环状rna作为诊治肺癌的分子靶标
阅读说明:本技术 环状rna作为诊治肺癌的分子靶标 (Circular RNA as molecular target for diagnosis and treatment of lung cancer ) 是由 李磊 李晓平 李明江 张亮 廉洁 杨波 杨盼 张卫东 于 2019-12-18 设计创作,主要内容包括:本发明公开了环状RNA作为诊治肺癌的分子靶标。本发明实验证明与对照相比,hsa_circ_0089974在肺癌组织中的表达上调,故其可作为诊断肺癌的标志物。本发明利用体外细胞实验证明干扰hsa_circ_0089974可抑制癌细胞增殖,故可根据环状RNA的性质开发治疗肺癌的药物。(The invention discloses a circular RNA as a molecular target for diagnosing and treating lung cancer. The experiment of the invention proves that hsa _ circ _0089974 is up-regulated in lung cancer tissue compared with the control, so that hsa _ circ _0089974 can be used as a marker for diagnosing lung cancer. In vitro cell experiments prove that the interference hsa _ circ _0089974 can inhibit the proliferation of cancer cells, so that the medicine for treating lung cancer can be developed according to the property of circular RNA.)
技术领域
本发明涉及生物医学领域,更具体地,环状RNA作为诊治肺癌的分子靶标。
背景技术
环状RNA(circRNA)是最近发现的一类特殊的非编码RNA,它大量存在于真核细胞胞质内,要由mRNA前体(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生。
与传统线性RNA不同,circRNA是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴的闭合环状结构,绝大部分circRNA由外显子序列构成,且在不同的物种中具有一定的保守性。目前circRNA的相关研究已受到越来越多研究者们的关注。
随着对circRNA研究的深入,circRNA与疾病的相关性也越来越多的受到研究者们的关注。肿瘤是一种机体在致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。目前,肿瘤是全球疾病致死的重要元凶之一,因此对于其发病机制及治疗的相关研究仍是医学的重大课题之一。
2013年Hansen等研究者已证实circRNAs作为miRNA sponges可与miRNAs结合并抑制其功能,在Ghosal等人的进一步研究中发现通过circRNA与miRNA的相互作用可影响大量下游mRNAs的生物学行为,涉及到的相关疾病可能多达90多种,其中肿瘤相关性疾病所占比例甚高。例如CDR1as可通过调控miR-7的功能,对miR-7下游的重要肿瘤相关蛋白进行调控影响肿瘤的发生发展,包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),胰岛素受体底物-1(Insulin receptor substrate 1,IRS-1),胰岛素受体底物-2(Insulin receptor substrate2,IRS-2),Raf1蛋白激酶,P21蛋白活化激酶1(p21-activated kinase-1,Pak1),活化CDC42激酶1(Activated CDC42 kinase 1,Ack1),蛋白酶体激活因子PA28gama,转录因子Yin-Yang1(YY1),***1受体(insulin-likegrowth factor 1receptor,IGF1R),磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(phosphoinositide-3kinase,catalytic subunit delta,PIK3CD)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)。除此之外,Zheng Q等研究者还发现circHIPK3在乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌及肾癌等肿瘤组织中表达丰度明显高于其正常组织,且circHIPK3可与miR-124结合从而调控肿瘤的增殖,敲低该circRNA可明显抑制肿瘤细胞的增殖。
基于circRNA肿瘤的重要作用,本申请意在研究肺癌相关circRNA,以便寻找能作为肺癌诊治标志物的circRNA,为临床诊断肺癌以及治疗肺癌提供理论基础。
本发明的目的之一在于提供一种hsa_circ_0089974在制备肺癌诊断产品中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种诊断肺癌的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种治疗肺癌的药物。
本发明的目的之四在于提供一种诊断肺癌的方法。
为了实现上述目的,本发明首先提供了检测hsa_circ_0089974在制备肺癌诊断产品中的用途。
优选地,hsa_circ_0089974在肺癌患者中表达上调。
进一步,所述诊断产品包括hsa_circ_0089974的诊断试剂。
更进一步,所述诊断试剂包括通过实时荧光定量PCR方法检测hsa_circ_0089974表达水平使用的试剂。
优选地,所述实时荧光定量PCR方法包括SYBRGreen法和TaqMan探针法。
本发明还提供了一种检测肺癌的试剂盒,所述试剂盒包括特异性扩增hsa_circ_0089974的引物。
优选地,引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。
优选地,所述试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq酶、和dNTPs。
优选地,所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
本发明还提供了一种治疗肺癌的药物组合物。所述药物组合物包含抑制hsa_circ_0089974表达的试剂。
优选地,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体,这类载体包括(但并不限于):稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型,包括但不限于,片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物组合物的施用途径不受限制,只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可,包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肺癌的药物联用,多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
优选地,抑制hsa_circ_0089974表达的试剂包括针对hsa_circ_0089974的干扰RNA,包括但不限于siRNA、shRNA。
本发明的抑制hsa_circ_0089974表达的试剂可以用于抑制内源性的hsa_circ_0089974表达,通过降低内源性产物的表达,从而治疗因内源性产物过度表达导致的肺癌。
本发明提供了一种诊断肺癌的方法,所述方法包括检测受试者样品中hsa_circ_0089974表达水平。
本发明还提供了一种治疗肺癌的方法,所述方法包括抑制hsa_circ_0089974表达。
本发明还提供了hsa_circ_0089974在制备治疗肺癌的药物中的应用。
定义
术语“检测”在本文中以最广义使用,包括靶分子的定性和定量测量二者。检测包括仅仅鉴定样品中靶分子的存在以及测定该靶分子是否以可检测水平存在于该样品中。
如本文中使用的术语“生物标志物”指能在样品中检测的指示物,例如预测性,诊断性,和/或预后性的。生物标志物可充当由某些分子,病理学,组织学,和/或临床特征表征的特定亚型的疾病或病症(例如癌症)的指示物。在一些实施方案中,生物标志物是基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA),多核苷酸拷贝数目改变(例如DNA拷贝数),多肽,多肽和多核苷酸修饰(例如翻译后修饰),碳水化合物,和/或基于糖脂的分子标志物。
术语“表达水平”指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码的和/或表观遗传的)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此,如本文中使用的,“表达”可以指转录成多核苷酸,翻译成多肽,或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸,翻译的多肽,或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的,无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或降解的转录物,或者是源自多肽的翻译后加工,例如通过蛋白水解。
如本文中使用的“扩增”一般指生成想要的序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”指至少两个拷贝。“拷贝”并不必然意味着与模板序列的完全序列互补性或同一性。例如,拷贝可以包括核苷酸类似物诸如脱氧肌苷,有意的序列改变(诸如经由包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变),和/或扩增期间发生的序列错误。
如本文中可互换使用的,“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物,而且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,经过修饰的核苷酸或碱基,和/或它们的类似物,或可以由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸,诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在的话,对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸的序列可以由非核苷酸构件中断。多核苷酸可以在合成之后进一步修饰,诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”,将一个或多个天然发生核苷酸用类似物替代,核苷酸间修饰诸如例如那些具有不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯,磷酸三酯,磷酰胺酯(phosphoamidate),氨基甲酸酯,等)和具有带电荷的连接(例如硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,等)的,那些含有悬垂模块(pendantmoiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶,毒素,抗体,信号肽,聚L-赖氨酸,等)的,那些具有嵌入剂(例如吖啶,补骨脂素,等)的,那些含有螯合剂(例如金属,放射性金属,硼,氧化性金属,等)的,那些含有烷化剂的,那些具有经过修饰的连接(例如α端基异构核酸(anomericnucleic acid),等)的,以及未修饰形式的多核苷酸。而且,通常存在于糖中的任何羟基基团可以用例如膦酸(phosphonate)基团,磷酸(phosphate)基团替换,用标准保护基团保护,或活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接,或者可缀合至固体或半固体支持物。可磷酸化或用胺或1至20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端OH。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的糖核糖或脱氧核糖的类似物形式,包括例如2’-O-甲基-,2’-O-烯丙基-,2’-氟-或2’-叠氮-核糖,碳环糖类似物,α-端基异构糖,差向异构糖诸如***糖,木糖或来苏糖,糖吡喃糖,糖呋喃糖,景天庚酮糖,无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可以用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下的实施方案,其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate)),P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate)),(O)NR2(“酰胺酯”(amidate)),P(O)R,P(O)OR’,CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替换,其中每一个R或R’独立是H或取代或未取代的烃基(1-20个C),任选含有醚(-O-)连接,芳基,烯基,环烷基,环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是同一的。前面的描述适用于本文中提到的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。
术语“引物”指能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离的3’-OH基团)的单链多核苷酸。
术语“诊断”在本文中用于指对分子或病理学状态,疾病或状况的鉴定或归类。
如本文中使用的,术语“样品”指自感兴趣的受试者和/或个体获得或衍生的组合物,其含有要例如基于物理,生化,化学和/或生理特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如,短语“疾病样品”或其变型指自感兴趣的受试者获得的任何样品,其预期会或已知含有要表征的细胞和/或分子实体。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系,细胞上清液,细胞裂解物,血小板,血清,血浆,玻璃体液,淋巴液,滑液,滤泡液,***,羊水,乳,全血,血液衍生的细胞,尿液,脑脊髓液,唾液,痰,泪液,汗液,粘液,和组织培养液,组织提取物诸如匀浆化组织,细胞提取物和其组合。
“组织样品”或“细胞样品”意味着自受试者或个体的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织如来自新鲜的,冷冻的和/或保存的器官,组织样品,活检,和/或抽吸物;血液或任何血液组分诸如血浆;体液诸如脑脊髓液,羊水,腹膜液,或间质液;来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地,组织或细胞样品是自疾病组织/器官获得的。组织样品可含有在自然界中并不天然与组织混杂的化合物,诸如防腐剂,抗凝血剂,缓冲剂,固定剂,营养物,抗生素,等等。
如本文中使用的,“治疗”指试图改变所治疗的个体的自然进程的临床干预,而且可以在临床病理学的进程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和免除或改善预后。
附图说明
图1显示利用QPCR检测hsa_circ_0089974在肺癌患者与正常人中的表达情况;
图2显示利用QPCR检测siRNA的干扰效率统计图;
图3显示MTT法检测干扰hsa_circ_0089974表达对肺癌细胞增殖的影响图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 利用QPCR检测在肺癌患者中差异表达
1、纳入标准和排除标准
1.1纳入标准
1)术后病理诊断为非小细胞肺癌;2)患者临床资料及随访数据完整;3)无手术禁忌症;4)患者年龄不低于18岁;5)预计寿命不低于6个月;6)ECOG评分小于等于1。
1.2排除标准
1)术前接受新辅助化疗或放疗;2)术前接受祀向治疗、细胞免疫治疗等;
2)术后一月内死亡病例;4)同时合并其他类型恶性肿瘤的病例;5)合并严重的全身性基础疾病,如,冠心病、心律失常、心力衰竭、严重呼吸功能不全、肝功能不全(或肝硬化)、慢性肾功能不全、血液系统疾病(凝血功能异常)、严重感染、活动性肺结核及不稳定的神经、精神系统症状。
2、病理标本收集
收集了60例新鲜冷练保存的非小细胞肺癌组织,每一例对应一例正常癌旁组织,所有新鲜样本都采取立刻采取液氮保存。
其中男性35例,女性25例,年龄23-71岁,平均年龄54岁。术后常规病理类型分布为:鱗癌32例、腺癌28例。在进行本研究前,两位病理科医师重新核对了组织,复核了诊断,肺癌组织的病理学分型按照2004年世界卫生组织标准重新分类。
3、QPCR
1)按照常规方法利用Trizol提取组织总RNA。
2)RNA反转录为cDNA
使用TAKARA反转录试剂盒(DRR036A)进行。配置反转录反应体系如表1所示。
表1反转录体系
反转录条件如下:
37℃ 15min(反转录反应);
85℃ 5s(反转录酶的失活反应);
4℃ 冷却后冻存。
3)按照TAKARA qPCR(SYBR)试剂盒说明书进行扩增(引物序列见表2),采用7500system SDS software(ABI,USA)软件分析扩增曲线,手动设定阈值(manualthresholds)获得各样品扩增的Ct值。以β-actin作为内参,以2-△△Ct法计算肺癌组织中hsa_circ_0089974表达量相对于对照组表达量的变化倍数。
表2引物序列
4、结果
结果如图1显示,与正常对照相比,肺癌组织中hsa_circ_0089974表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 hsa_circ_0089974对肺癌细胞生长的影响
1、细胞培养
1640培养基+10%小牛血清(北京鼎国)+160万单位庆大霉素/ml,37℃,5%CO2条件培养。细胞长满后按1:10传代。
2、siRNA序列
(https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)网站进行hsa_circ_0089974siRNA的设计,siRNA-hsa_circ_0089974序列如下:sense 5’-UGAAAAAUUGCGGCAGAGGUUTT-3’(SEQ ID NO.5),antisense 5’-ACUUUUUAACGCCGUCUCCAATT-3’(SEQ ID NO.6)。委托上海吉玛制药技术有限公司合成并购入通用型阴性对照(siRNA-NC)。
3、细胞转染
1)转染前一天,将适量A549细胞接种至6孔板。
2)细胞换液:转染2h前,弃原1ml培养液,加入400μl新鲜的完全培养基DMEM。
3)转染:对照组转入siRNA-NC 40nmol,实验组转入siRNA-hsa_circ_008997440nmol每孔。
转染试剂Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)按与siRNA剂量1:1转入每孔。
方法:
A:1μl RNAi MAX+49μl opti-MEM培养基=50μl,混匀后室温静置5min。
B:1μl siRNA+49μl opti-MEM培养基=50μl,混匀后室温静置5min。
C:A+B轻轻混匀,共100μl每孔,静置15-20min后加入细胞中,培养基终体积500μl。
4)siRNA转染6h后更换新鲜完全培养基。
转染后须时刻观察细胞状态,48h后收取细胞行后续实验。
4、干扰效率检测
QPCR步骤同实施例1。
结果如图2所示,siRNA-hsa_circ_0089974可使得hsa_circ_0089974相对表达量下调,P<0.05,差异具有统计学意义。
5、MTT
(1)MTT商品名为噻唑蓝,3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetra zoliumromide。用PBS稀释成5mg/ml冻于-20℃储存。
(2)接种A549于96孔板内,按照前面所述的方法进行siRNA转染,每组细胞每个时间点设置3个复孔。
(3)细胞转染24h、48h、72h及96h行MTT检测。
(4)吸弃培养基,加入稀释后MTT(用无抗培养基稀释10倍)100μl,放入37℃孵箱孵育4h。
(5)吸掉上清,加入100μl DMSO(二甲基亚砜),震荡5min,使结晶物充分混匀。
(6)应用酶标仪在490nm波长检测,得到A值。
结果如图3所示,转染siRNA-hsa_circ_0089974组细胞增殖明显受到抑制,表明抑制hsa_circ_0089974表达可以抑制肺癌细胞增殖,即抑制hsa_circ_0089974表达可用于治疗肺癌。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 天津市第一中心医院
<120> 环状RNA作为诊治肺癌的分子靶标
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagtagacac ggaaggata 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatagtgac agacatagc 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctcgcct ttgccga 17
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtgcctg gggcg 15
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugaaaaauug cggcagaggu utt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acuuuuuaac gccgucucca att 23
具体实施方式
图1显示利用QPCR检测hsa_circ_0089974在肺癌患者与正常人中的表达情况;
图2显示利用QPCR检测siRNA的干扰效率统计图;
图3显示MTT法检测干扰hsa_circ_0089974表达对肺癌细胞增殖的影响图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 利用QPCR检测在肺癌患者中差异表达
1、纳入标准和排除标准
1.1纳入标准
1)术后病理诊断为非小细胞肺癌;2)患者临床资料及随访数据完整;3)无手术禁忌症;4)患者年龄不低于18岁;5)预计寿命不低于6个月;6)ECOG评分小于等于1。
1.2排除标准
1)术前接受新辅助化疗或放疗;2)术前接受祀向治疗、细胞免疫治疗等;
2)术后一月内死亡病例;4)同时合并其他类型恶性肿瘤的病例;5)合并严重的全身性基础疾病,如,冠心病、心律失常、心力衰竭、严重呼吸功能不全、肝功能不全(或肝硬化)、慢性肾功能不全、血液系统疾病(凝血功能异常)、严重感染、活动性肺结核及不稳定的神经、精神系统症状。
2、病理标本收集
收集了60例新鲜冷练保存的非小细胞肺癌组织,每一例对应一例正常癌旁组织,所有新鲜样本都采取立刻采取液氮保存。
其中男性35例,女性25例,年龄23-71岁,平均年龄54岁。术后常规病理类型分布为:鱗癌32例、腺癌28例。在进行本研究前,两位病理科医师重新核对了组织,复核了诊断,肺癌组织的病理学分型按照2004年世界卫生组织标准重新分类。
3、QPCR
1)按照常规方法利用Trizol提取组织总RNA。
2)RNA反转录为cDNA
使用TAKARA反转录试剂盒(DRR036A)进行。配置反转录反应体系如表1所示。
表1反转录体系
反转录条件如下:
37℃ 15min(反转录反应);
85℃ 5s(反转录酶的失活反应);
4℃ 冷却后冻存。
3)按照TAKARA qPCR(SYBR)试剂盒说明书进行扩增(引物序列见表2),采用7500system SDS software(ABI,USA)软件分析扩增曲线,手动设定阈值(manualthresholds)获得各样品扩增的Ct值。以β-actin作为内参,以2-△△Ct法计算肺癌组织中hsa_circ_0089974表达量相对于对照组表达量的变化倍数。
表2引物序列
4、结果
结果如图1显示,与正常对照相比,肺癌组织中hsa_circ_0089974表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 hsa_circ_0089974对肺癌细胞生长的影响
1、细胞培养
1640培养基+10%小牛血清(北京鼎国)+160万单位庆大霉素/ml,37℃,5%CO2条件培养。细胞长满后按1:10传代。
2、siRNA序列
(https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)网站进行hsa_circ_0089974siRNA的设计,siRNA-hsa_circ_0089974序列如下:sense 5’-UGAAAAAUUGCGGCAGAGGUUTT-3’(SEQ ID NO.5),antisense 5’-ACUUUUUAACGCCGUCUCCAATT-3’(SEQ ID NO.6)。委托上海吉玛制药技术有限公司合成并购入通用型阴性对照(siRNA-NC)。
3、细胞转染
1)转染前一天,将适量A549细胞接种至6孔板。
2)细胞换液:转染2h前,弃原1ml培养液,加入400μl新鲜的完全培养基DMEM。
3)转染:对照组转入siRNA-NC 40nmol,实验组转入siRNA-hsa_circ_008997440nmol每孔。
转染试剂Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)按与siRNA剂量1:1转入每孔。
方法:
A:1μl RNAi MAX+49μl opti-MEM培养基=50μl,混匀后室温静置5min。
B:1μl siRNA+49μl opti-MEM培养基=50μl,混匀后室温静置5min。
C:A+B轻轻混匀,共100μl每孔,静置15-20min后加入细胞中,培养基终体积500μl。
4)siRNA转染6h后更换新鲜完全培养基。
转染后须时刻观察细胞状态,48h后收取细胞行后续实验。
4、干扰效率检测
QPCR步骤同实施例1。
结果如图2所示,siRNA-hsa_circ_0089974可使得hsa_circ_0089974相对表达量下调,P<0.05,差异具有统计学意义。
5、MTT
(1)MTT商品名为噻唑蓝,3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetra zoliumromide。用PBS稀释成5mg/ml冻于-20℃储存。
(2)接种A549于96孔板内,按照前面所述的方法进行siRNA转染,每组细胞每个时间点设置3个复孔。
(3)细胞转染24h、48h、72h及96h行MTT检测。
(4)吸弃培养基,加入稀释后MTT(用无抗培养基稀释10倍)100μl,放入37℃孵箱孵育4h。
(5)吸掉上清,加入100μl DMSO(二甲基亚砜),震荡5min,使结晶物充分混匀。
(6)应用酶标仪在490nm波长检测,得到A值。
结果如图3所示,转染siRNA-hsa_circ_0089974组细胞增殖明显受到抑制,表明抑制hsa_circ_0089974表达可以抑制肺癌细胞增殖,即抑制hsa_circ_0089974表达可用于治疗肺癌。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 天津市第一中心医院
<120> 环状RNA作为诊治肺癌的分子靶标
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagtagacac ggaaggata 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatagtgac agacatagc 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctcgcct ttgccga 17
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtgcctg gggcg 15
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugaaaaauug cggcagaggu utt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acuuuuuaac gccgucucca att 23