咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用 (Application of caffeic acid or chlorogenic acid in preparing AGEs (advanced glycation end products) -induced inflammatory reaction inhibitor ) 是由 李冰 张振辉 李琳 张霞 苏国莹 李晓玺 徐振波 苏健裕 于 2018-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明属于炎症反应抑制剂技术领域,公开了咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用。本发明技术方案主要为咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用。本发明中,咖啡酸或绿原酸可以直接抑制AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-κB信号通路,和/或通过与AGEs相互作用,形成复合物,影响AGEs与RAGE相互作用,从而抑制AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-κB信号通路,实现对炎症反应的抑制。本发明的咖啡酸与绿原酸是天然无毒副作用的物质,来源广泛,价格适宜。本发明应用抑制了AGEs诱导的炎症反应,加速了创口修复的速度,尤其是加速了糖尿病人创口修复的速度。(The invention belongs to the technical field of inflammatory reaction inhibitors, and discloses application of caffeic acid or chlorogenic acid in preparation of AGEs-induced inflammatory reaction inhibitors. The technical scheme of the invention mainly relates to the application of caffeic acid or chlorogenic acid in preparing AGEs-induced inflammatory reaction inhibitors. In the invention, caffeic acid or chlorogenic acid can directly inhibit AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-kB signal pathways and/or form a compound through interaction with AGEs to influence the interaction between AGEs and RAGE, thereby inhibiting AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-kB signal pathways and realizing the inhibition of inflammatory reaction. The caffeic acid and chlorogenic acid of the invention are natural substances without toxic and side effects, and have wide sources and proper price. The application of the invention inhibits AGEs-induced inflammatory reaction, accelerates the speed of wound repair, and particularly accelerates the speed of wound repair of diabetes patients.)
技术领域
本发明属于炎症反应抑制剂技术领域，特别涉及咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用。
背景技术
咖啡酸(caffeic acid,CA)是一种天然的，存在于许多植物食物中的酚酸，如胡萝卜、番茄、草莓和蓝莓，属于有机酸中的酚酸类物质，具有羟基苯丙烯酸结构，化学名是3,4-二羟基桂皮酸，分子式为C9H8O4，分子量为180.15。咖啡酸为黄色结晶物，热分解温度为223℃～235℃，不溶于冷水，溶于热水和有机溶剂。绿原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，异名咖啡单宁酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸，分子式：C16H18O9，分子量：354.30。咖啡酸与绿原酸是重要的生物活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗糖化、抗癌、抗肿瘤、抗HIV，改善肠胃、心脑血管、神经系统功能等多种活性功效。
晚期糖化终末产物(advancedglycation end products,AGEs)是美拉德反应后期产生的一类稳定性高的化合物，对人体有害，尤其是AGEs与RAGE相互作用引起的慢性炎症反应。现已发现，在创伤口处，AGEs与RAGE结合后，细胞内活性氧水平升高，进而激活细胞下游信号通路，引发炎症反应，创口修复过程中的炎症反应时间延长，创口修复功能受损。特别是对糖尿病患者，其体内AGEs的含量较正常人高，当糖尿病患者受到创伤时，血液中高浓度的AGEs与皮肤组织细胞RAGE结合，使得伤口不易愈合。因此，抑制AGEs与RAGE的相互作用，减弱创口处的炎症反应强度，对于加速创口修复具有重要的意义。
炎症反应是一种保护性免疫反应，是人在进化进程中保存下来的先天免疫系统应对有害刺激物(如病原体、死细胞、有害刺激物)的一种自我防御行为，受到宿主的严格调控。炎症不足会导致患者持续受到病原体的持续感染，而过度的炎症反应则会导致慢性或者全身性的炎症疾病，如AGEs诱导的持续的炎症反应，对人体有不利影响，必须加以控制。目前对创口炎症反应的抑制主要通过降低伤口处炎症介质的含量，或抑制炎症介质的过量表达来实现，如负压吸引治疗技术在清洁创口的同时，可以降低创口处TNF-α、IL-6以及NO等炎症介质的含量，从而实现对创口炎症反应的抑制。而研究表明，AGEs通过疏水相互作用和静电相互作用与人体内AGEs的模式识别受体RAGE发生特异性结合，提升细胞内氧化应激水平，造成细胞氧化压力提升和炎症介质的过量表达，因此抑制AGEs与RAGE的相互作用，也是抑制创口炎症反应的重要途径之一。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
咖啡酸或绿原酸在制备AGEs诱导的炎症反应抑制剂中的应用。
进一步的，所述的应用为将咖啡酸或绿原酸制备得到AGEs诱导的炎症反应抑制剂涂覆于创口处。
进一步的，所述咖啡酸或绿原酸的剂量范围为0.1～20μM。
本发明应用中，咖啡酸或绿原酸通过抑制创口修复过程中AGEs与RAGE的相互作用而实现抑制炎症反应的效果。
在本发明中，咖啡酸或绿原酸通过抑制AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-κB信号通路，进而抑制炎症反应。具体而言是，咖啡酸或绿原酸可以直接抑制AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-κB信号通路，和/或通过与AGEs相互作用，形成复合物，影响AGEs与RAGE相互作用，从而抑制AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-κB信号通路，实现对炎症反应的抑制。
当AGEs与RAGE结合后，会诱导细胞内生成大量的ROS，激活细胞内信号通路，导致相关激酶表达量上升，如MAPK、NF-κB等，诱导细胞产生炎症反应。NF-κB的活化可以提高炎症因子如TNF-α、IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1等的表达量，引发炎症反应，诱导伤口修复功能受损。
本发明研究发现，咖啡酸或绿原酸在0.1～20μM浓度范围内，对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)没有明显的细胞毒性，且能够显著地抑制由糖化牛血清蛋白(AGEs-BSA，一种蛋白结合的AGEs)诱导的ROS的产生，随着药物处理浓度的增加，抑制效果越强。此外，咖啡酸或绿原酸可以抑制由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞ICAM-1、VCAm-1和MCP-1mRNA的表达量升高，以及TNF-α和IL-1β蛋白质表达量升高，这表明咖啡酸或绿原酸可以阻断AGEs-RAGE的正反馈回路。咖啡酸或绿原酸还可以降低p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量，表明咖啡酸或绿原酸可以通过ROS/p38MAPK/NF-κB信号通路抑制AGEs-BSA诱导的HUVEC炎症反应。
本发明所述抑制剂通过抑制创口修复过程中AGEs与RAGE相互作用产生的AGEs-RAGE/ROS/MAPK/NF-κB信号通路和/或与AGEs相互作用形成复合物，阻断AGEs与RAGE相互作用而抑制炎症反应。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
1、本发明所涉及的抑制剂咖啡酸与绿原酸是天然无毒副作用的物质，来源广泛，价格适宜。
2、本发明拓展了咖啡酸与绿原酸在创口修复领域的应用，抑制了AGEs诱导的炎症反应，加速了创口修复的速度，尤其是加速了糖尿病人创口修复的速度。
附图说明
图1为不同浓度咖啡酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中ICAM-1、VCAm-1和MCP-1mRNA的表达量的影响。
图2为不同浓度咖啡酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中TNF-α和IL-1β蛋白质表达量的影响。
图3为不同浓度咖啡酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中RAGE mRNA表达量的影响。
图4为不同浓度咖啡酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中RAGE蛋白表达量的影响。
图5为不同浓度咖啡酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量的影响。
图6为不同浓度绿原酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中ICAM-1、VCAm-1和MCP-1mRNA的表达量的影响。
图7为不同浓度绿原酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中TNF-α和IL-1β蛋白质表达量的影响。
图8为不同浓度绿原酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中RAGE mRNA表达量的影响。
图9为不同浓度绿原酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中RAGE蛋白表达量的影响。
图10为不同浓度绿原酸对由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞中p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。
实施例1：材料和方法
(1)制备咖啡酸工作液：准确称取0.0364g咖啡酸于离心管中，加入1mL DMSO，过滤除菌，采用细胞完全培养基稀释进行稀释，制成浓度分别为5μM、10μM与20μM的咖啡酸工作液。
(2)制备AGEs-BSA工作液：50mg/mL的BSA与0.5M的葡萄糖溶解在pH＝7.4，0.5M的PBS溶液中，0.22μM的过滤器过滤除菌，灭菌封口后，37℃避光孵育60天。实验前，用0.1M，pH＝7.4的磷酸盐透析液，1000Da的透析袋，4℃透析12h。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白质浓度，AGEs-BSA的浓度为39.89mg/mL。将AGEs-BSA的浓度调整为1mg/mL荧光光谱扫描检测制备的AGEs-BSA的荧光吸收(激发波长370nm，发射波长为400～600nm)，AGEs-BSA样品在发射波长440nm处有特征吸收峰，表明葡萄糖与BSA充分反应，BSA被糖化成AGEs-BSA。将制备好的AGEs-BSA用无菌的PBS稀释为浓度16000μg/mL，制成AGEs-BSA储备液。然后取一定量的AGEs-BSA储备液，加入细胞完全培养基，配制浓度为200μg/mL的AGEs-BSA工作液。
(3)培养HUVEC细胞：对HUVEC细胞进行解冻、传代，取对数生长期的HUVEC细胞进行实验，将细胞消化重悬后，进行细胞基数。将HUVEC细胞以每孔3×104个细胞/孔接种与96孔板，置于含有5％CO2，37℃培养箱中培养一定的时间。
(4)AGEs-BSA工作液与咖啡酸工作液处理HUVEC细胞：分别将5μM、10μM、20μM的咖啡酸工作液与400μg/mL AGEs-BSA工作液等体积混合，将不同的混合液加入到不同的96孔板中处理HUVEC细胞，在含有5％CO2，37℃培养箱中培养。将未经药物处理的HUVEC细胞当作空白对照，每个处理组重复3次。
(5)按照步骤(4)对HUVEC细胞进行处理7h后，采用荧光定量PCR方法检测HUVEC细胞中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA、RAGE mRNA表达量检测。
(6)按照步骤(4)对HUVEC细胞进行处理24h后，采用酶联接免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法检测HUVEC细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量。
(7)按照步骤(4)对HUVEC细胞进行处理18h后，采用Western blot方法检测HUVEC细胞中RAGE、p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量。
试验结果
(1)如图1所示，咖啡酸可以抑制由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞ICAM-1、VCAm-1和MCP-1mRNA的表达量升高。
(2)如图2所示，咖啡酸可以抑制由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞TNF-α和IL-1β蛋白质表达量升高。
(3)如图3和图4所示，咖啡酸可以降低由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞RAGE mRNA和蛋白质表达量，表明咖啡酸可以阻断AGEs-RAGE的正反馈回路。
(4)如图5所示，咖啡酸可以降低由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量，表明咖啡酸可以通过ROS/p38MAPK/NF-κB信号通路抑制AGEs-BSA诱导的HUVEC炎症反应。
实施例2：材料和方法
(1)制备绿原酸工作液：准确称取0.0364g绿原酸于离心管中，加入1mL DMSO，过滤除菌，采用细胞完全培养基稀释进行稀释，制成浓度分别为5μM、10μM与20μM的绿原酸工作液。
(2)制备AGEs-BSA工作液：50mg/mL的BSA与0.5M的葡萄糖溶解在pH＝7.4，0.5M的PBS溶液中，0.22μM的过滤器过滤除菌，灭菌封口后，37℃避光孵育60天。实验前，用0.1M，pH＝7.4的磷酸盐透析液，1000Da的透析袋，4℃透析12h。二喹啉甲酸法测定蛋白质浓度，AGEs-BSA的浓度为39.89mg/mL。将AGEs-BSA的浓度调整为1mg/mL荧光光谱扫描检测制备的AGEs-BSA的荧光吸收(激发波长370nm，发射波长为400～600nm)，AGEs-BSA样品在发射波长440nm处有特征吸收峰，表明葡萄糖与BSA充分反应，BSA被糖化成AGEs-BSA。将制备好的AGEs-BSA用无菌的PBS稀释为浓度16000μg/mL,制成AGEs-BSA储备液。然后取一定量的AGEs-BSA储备液，加入细胞完全培养基，配制浓度为200μg/mL的AGEs-BSA工作液。
(3)培养HUVEC细胞：对HUVEC细胞进行解冻、传代，取对数生长期的HUVEC细胞进行实验，将细胞消化重悬后，进行细胞基数。将HUVEC细胞以每孔3×104个细胞/孔接种与96孔板，置于含有5％CO2，37℃培养箱中培养一定的时间。
(4)AGEs-BSA工作液与绿原酸工作液处理HUVEC细胞：分别将5μM、10μM、20μM的绿原酸工作液与400μg/mLAGEs-BSA工作液等体积混合，将不同的混合液加入到不同的96孔板中处理HUVEC细胞，在含有5％CO2，37℃培养箱中培养。将未经药物处理的HUVEC细胞当作空白对照，每个处理组重复3次。
(5)按照步骤(4)对HUVEC细胞进行处理7h后，采用荧光定量PCR方法检测HUVEC细胞中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA、RAGE mRNA表达量检测。
(6)按照步骤(4)对HUVEC细胞进行处理24h后，采用酶联接免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法检测HUVEC细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量。
(7)按照步骤(4)对HUVEC细胞进行处理18h后，采用Western blot方法检测HUVEC细胞中RAGE、p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量。
试验结果
(1)如图6所示，绿原酸可以抑制由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞ICAM-1、VCAm-1和MCP-1mRNA的表达量升高。
(2)如图7所示，绿原酸可以抑制由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞TNF-α和IL-1β蛋白质表达量升高。
(3)如图8和图9所示，绿原酸可以降低由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞RAGE mRNA和蛋白质表达量，表明绿原酸可以阻断AGEs-RAGE的正反馈回路。
(4)如图10所示，绿原酸可以降低由AGEs-BSA诱导的HUVEC细胞p38MAPK和NF-κB蛋白质表达量，表明绿原酸可以通过ROS/p38MAPK/NF-κB信号通路抑制AGEs-BSA诱导的HUVEC炎症反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。