阅读说明：本技术 一种高效、稳定的α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用 (Efficient and stable α -galactosidase, and coding gene and application thereof ) 是由 袁红莉 张真明 刘亮 杨金水 于 2018-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效、稳定的α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质,是：由序列1自N末端第20至437位氨基酸残基组成的蛋白质；由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表的序列3第90-513位氨基酸残基组成的蛋白质；由序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还保护所述蛋白质的应用,为：作为α-半乳糖苷酶；降解含α-半乳糖苷键物质。本发明提供的蛋白可满足饲料、食品等工业中对α-半乳糖苷酶热稳定性、pH稳定性和蛋白酶抗性的要求,具有更广泛的工业应用,为进一步工业化高产工程菌株的构建提供了材料。本发明具有非常好的研究前景和商业应用价值。(The invention discloses a high-efficiency and stable α -galactosidase, a coding gene and application thereof.A protein provided by the invention is a protein consisting of 20 th to 437 th amino acid residues from the N terminal of a sequence 1, a protein consisting of an amino acid sequence shown in the sequence 1, a protein consisting of 90 th to 513 th amino acid residues in a sequence 3 of a sequence table, and a protein consisting of an amino acid sequence shown in the sequence 3.)

一种高效、稳定的α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高效、稳定的α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)又称蜜二糖酶，能够特异性地水解寡糖或多糖非还原端的α-半乳糖苷键，因此，被大量应用于食品加工、制糖工业、造纸工业、饲料加工和医学领域。

在食品和饲料加工领域中，α-半乳糖苷酶可作为食品和饲料添加剂使用，水解豆制品和豆粕中的抗营养因子如棉籽糖、水苏糖、蜜二糖等α-半乳寡糖，从而缓解抗营养因子造成的腹泻、腹胀和胃痛等现象，促进豆制品被人体更好地吸收和利用，提高单胃动物的进食量，进而改善动物的生产性能。此外，α-半乳糖苷酶对于由其他高纤维食物中一些寡糖造成的腹胀现象也有较好的治疗效果。

在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以水解糖蜜中的棉籽糖，降低糖蜜粘度，促进蔗糖晶体析出，提高原料的利用率和蔗糖质量。而粘度的降低也可以减少制糖过程中再升温导致的费用，节约能源，使得设备加工能力和周转率大幅提高。

在造纸工业中，α-半乳糖苷酶的应用可以水解纸浆中的半乳聚甘露聚糖，去除其骨架上的α-半乳糖。因此，利用α-半乳糖苷酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶等酶制剂联合处理软木纸浆可以提高纸浆的漂白效果。

在医疗领域中，α-半乳糖苷酶可用于治疗法布里病(Fabry疾病)和血型转换。人体的溶酶体α-半乳糖苷酶的缺失，会引起糖磷脂的积累，并最终影响心包、肾脏和中枢神经系统以及胃肠道功能，而外源摄入α-半乳糖苷酶可以有效去除糖磷脂末端的α-半乳糖残基，从而缓解Fabry疾病。B型血红细胞表面糖链最外端相较于O型血多出了一个以α-1，3糖苷键连接的半乳糖残基，利用α-半乳糖苷酶去除该α-半乳糖残基可以实现B型血和O型血之间的转换。

α-半乳糖苷酶广泛存在于动植物和微生物体内，尤以微生物体内的产量最高。植物源的α-半乳糖苷酶产量低且酶活不稳定，动物源的α-半乳糖苷酶大多来源于胰腺，其产量也受限于其来源，而以微生物作为生产α-半乳糖苷酶的载体具有产量高、质量稳定、生产可控性强和适合工业化等优势，被认为是现代开发α-半乳糖苷酶制剂的主要途径。目前报道的可以产生α-半乳糖苷酶的微生物有很多，包括细菌(嗜热脂肪芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜热细菌、发酵乳酸杆菌、双歧杆菌、链霉菌)和真菌(米曲霉、根霉、木霉、黄孢原毛平革菌、灵芝、云芝、平菇)，以及一些古菌。但是在一些常用的食品级安全菌株中，能够分泌α-半乳糖苷酶的菌株非常少，且活性都较低。因此，克隆其他微生物的α-半乳糖苷酶基因，并利用分子生物学技术在酵母菌及其他一些食品安全菌株中进行异源表达是α-半乳糖酶制剂的主要生产手段。

α-半乳糖苷酶的最适作用条件和pH、温度稳定性决定了该酶在实际生产中的应用范围及其商业价值。普通α-半乳糖苷酶热稳定性和pH稳定性差，限制了其在食品和饲料加工中的应用，而具备热稳定性和pH稳定性的α-半乳糖苷酶的研究并不多。目前报道的α-半乳糖苷酶在模式底物对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)上能表现出较高的活力，但是对水苏糖、棉籽糖和蜜二糖等天然底物的水解活力并不高。此外，在食品和饲料添加剂中，糖苷水解酶往往结合添加蛋白酶，同时提高食物的可消化性和营养价值，因此，α-半乳糖苷酶的蛋白酶抗性也是也是评价其稳定性的重要参数。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、稳定的α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自白囊耙齿菌(Irpexlacteus)，命名为ILgalA蛋白，是如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)或(f)：

(a)由序列表中序列1自N末端第20至437位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)由序列表中序列表的序列3第90-513位氨基酸残基组成的蛋白质；

(d)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(e)将(a)或(b)或(c)或(d)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有α-半乳糖苷酶活性的由其衍生的蛋白质；

(f)在(a)或(b)或(c)或(d)或(e)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述标签可如表1所示。

表1

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6个(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10个(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，在进行生物表达得到。蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子为如下(1)至(6)中任一所述的DNA分子：

(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第58至1311位核苷酸所示的DNA分子；

(2)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)编码区如序列表的序列4自5’末端第268至1539位核苷酸所示的DNA分子；

(4)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(5)在严格条件下与(1)或(2)或(3)或(4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(6)来源于白囊耙齿菌且与(1)或2)限定DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

所述DNA分子可以是由自然变异产生的，也可以是人工突变产生的。

含有所述核酸分子的表达盒、重组表达载体或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

所述重组表达载体具体可为重组质粒pPICZαA-ILgalA，即在pPICZαA载体的XhoI和NotI酶切位点之间***序列表的序列4自5’末端第250至1542位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将线性化的重组质粒pPICZαA-ILgalA导入毕赤酵母x-33，得到的重组酵母x-33-pPICZαA-ILgalA。所述线性化的重组质粒pPICZαA-ILgalA具体可为用限制性内切酶SacⅠ酶切重组质粒pPICZαA-ILgalA，得到的线性化质粒。

扩增所述核酸分子的全长或任一片段的引物对均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种制备所述蛋白质的办法，包括：发酵所述重组菌，使编码所述蛋白质的核酸分子表达，得到所述蛋白质。

所述方法具体包括如下步骤：培养重组菌，培养过程中进行甲醇诱导，然后离心收集上清液。

所述方法具体包括如下步骤：采用BMMY培养基培养重组菌至OD_600nm＝1.0，然后30℃、250rpm振荡培养(每24h向体系中加入甲醇并使其在体系中的浓度为1％)，然后离心10min收集上清液。

所述方法具体包括如下步骤：采用BMMY培养基培养重组菌至OD_600nm＝1.0，然后30℃、250rpm振荡培养144小时(每24h向体系中加入甲醇并使其在体系中的浓度为1％)，然后12000rpm离心10min，收集上清液。

所述方法还包括如下步骤：将上清液进行透析除盐，然后进行Ni柱亲和层析纯化。

本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)：

(Ⅰ)作为α-半乳糖苷酶；

(Ⅱ)制备具有α-半乳糖苷酶功能的产品；

(Ⅲ)降解含α-半乳糖苷键物质；

(Ⅳ)制备具有降解含α-半乳糖苷键物质功能的产品。

本发明还保护所述基因、所述表达盒、重组表达载体或重组菌的应用，为如下(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)：

(ⅰ)制备所述蛋白质；

(ⅱ)制备具有α-半乳糖苷酶功能的产品；

(ⅲ)制备具有降解含α-半乳糖苷键物质功能的产品。

所述含有α-半乳糖苷键物质为含有α-半乳糖苷键的寡糖。

所述寡糖为蜜二糖、棉籽糖或水苏糖。

本发明提供的蛋白质，作为α-半乳糖苷酶的比活力为1012U/mg。反应温度可为22-90℃，优选为60-70℃，最优选为70℃。具有极佳的温度稳定性，在50℃或60℃保温10h，酶活仍能保持在90％以上。反应pH可为3.2-7.5，优选为4.0-5.5，最优选为4.8。具有极佳的pH稳定性，在pH 3-11的条件下保温2h，酶活均能保持在60％以上，在pH 7-11的条件下保温2h，酶活能保持在80％以上。对于三种天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖的活力分别能够达到644、755和833U/mg，其中在水苏糖上的活力在目前报道的α-半乳糖苷酶中为最高。在37℃条件下分别与1.0mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶共同孵育1h，均能保持90％以上的活力，与蛋白酶K共同孵育1h，也能保持60％以上的活力。在酶用量为2.7U/mL的情况下，该α-半乳糖苷酶能在30min内将豆奶中的棉籽糖和水苏糖全部水解为蔗糖和α-半乳糖。

本发明制备的α-半乳糖苷酶具有更好的pH稳定性、热稳定性和蛋白酶抗性。本发明提供的蛋白可满足饲料、食品等工业中对α-半乳糖苷酶热稳定性、pH稳定性和蛋白酶抗性的要求，具有更广泛的工业应用，为进一步工业化高产工程菌株的构建提供了材料。本发明具有非常好的研究前景和商业应用价值。

附图说明

图1为实施例2中的电泳图。

图2为实施例4中最适pH测定的结果。

图3为实施例4中pH稳定性测定的结果。

图4为实施例4中最适反应温度的结果。

图5为实施例4中温度稳定性的结果。

图6为实施例4中蛋白酶抗性的结果。

图7为实施例5的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

白囊耙齿菌(Irpexlacteus)：CGMCC编号为5.809。pPICZαA载体：Invitrogen公司，产品编号69909。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33，简称毕赤酵母x-33：Invitrogen公司，产品编号C18000。

蜜二糖：SIGMA公司，产品编码：63630。棉籽糖：SIGMA，产品编码：R0250.水苏糖：TCI公司，产品编码：S0397。

BMGY培养基：蛋白胨2g/100ml、酵母提取物1g/100ml、1.34g/100ml YNB，1％(体积比)甘油、4×10^-5g/100ml Biotin，余量为磷酸缓冲液(pH6.0、0.1mol/L)；121℃灭菌20min。

BMMY培养基：蛋白胨2g/100ml、酵母提取物1g/100ml、1.34g/100mlYNB、1％(体积比)甲醇、4×10^-5g/100mlBiotin，余量为磷酸缓冲液(pH6.0、0.1mol/L)；121℃灭菌20min。

pNPG，全称为4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。

实施例1、ILgalA蛋白及其编码基因的发现

将白囊耙齿菌菌丝接种到50mL液体培养基中(玉米淀粉20g/L，豆粕7g/L，酵母提取物5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L,MgSO₄·7H₂O 5g/L)，培养7天后收集菌丝体，液氮研磨，分别利用基因组DNA提取试剂盒(Promega)和Trizol(GenStar，China)法提取总DNA和RNA。培养物上清经过12.5％SDS-PAGE分离，将条带大小为60kD的蛋白切下进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定。产生的MS数据利用Mascot2.5.1搜索比对，搜索能够和现有α-半乳糖苷酶比对上的肽段。

根据α-半乳糖苷酶的保守氨基酸残基分别设计3条简并引物DPF1、DPR1和DPR2。以基因组DNA为模板，DPF1、DPR1分别为正反向引物，利用touchdown-PCR扩增α-半乳糖苷酶基因的5’端，PCR产物经过切胶回收纯化，连接pGEM-T载体后测序鉴定，结果确定5’端部分DNA序列。

以基因组DNA为模板，SPF1、DPR2分别为正反向引物，利用touchdown-PCR扩增α-半乳糖苷酶基因的3’端，PCR产物经过切胶回收纯化，连接pGEM-T载体后测序鉴定，结果确定3’端部分的DNA序列。

经过两轮touchdown-PCR得到的5’端和3’端并不完整，继续通过热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced-PCR，TAIL-PCR)鉴定α-半乳糖苷酶基因的5’端侧翼序列，具体方法为：以基因组DNA为模板，ADPF为上游引物，SPR1为下游引物，进行第一轮PCR扩增。以第一轮PCR产物为模板，ADPF为上游引物，SPR2为下游引物，进行第二轮PCR扩增。以第二轮PCR产物为模板，ADPF为上游引物，SPR3为下游引物进行第三轮PCR扩增。根据每轮PCR产物间条带大小的差异判断目标序列，对目标条带进行切胶回收纯化后测序鉴定，结果得到5’端侧翼DNA序列。

3’端的侧翼序列通过3’RACE反应进行鉴定，具体方法为：以cDNA为模板，SPF2和UPM(由公司提供)分别为上下游引物进行PCR扩增。将得到的PCR产物作为第二轮PCR扩增的模板，以SPF3和NUP(由公司提供)分别为上下游引物进行第二轮PCR扩增，得到3’端的侧翼DNA序列。

根据上述测序和拼接结果，设计正反向引物GalF1和GalR1，以cDNA为模板，扩增全长cDNA序列。

ILgalA蛋白如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第1-19位氨基酸残基组成信号肽。ILgalA基因如序列表的序列2所示。

本步骤中涉及的引物序列见表2。

表2

引物	5’→3’	长度(bp)
			DPF1	ACICCNCAKATGGGITGGAA	20
DPR1	AAICCNGGIAGYTTRCARTC	20
			SPF1	CGCTGCCCATGTACCTCTGTGATC	24
DPR2	GGNACNGCYTTCCAIACYTTIGT	23
			ADPF	CATCGNCNGANACGAA	16
SPR1	CGAAGTTCCACGGGCCGTCCTCACCCCAG	29
			SPR2	GGGGTTCCAGCACGGCCTTCGTTGTTG	27
SPR3	GTAGGGTCTGCAACTGGCGCCCCAG	25
			SPF2	TCGCCGCACCCGTTGGTCAGAAAGC	25
SPF3	CCAAGCGATCATCGACGTCAATCAG	25
			GalF1	TCGAAGATACCTGTACCAACCTATTC	26
GalR1	GATATATTGAACATATATTCATCGTGG	27
			GalF2	CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCGGATAATGGCCTTGCGATCACACC	53
GalR2	ATTTGCGGCCGCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAATTCATGTGCTATATGCCTCTTAC	59

注：N＝A/G/C/T，K＝G/T，Y＝C/T，R＝A/G，I＝脱氧次黄嘌呤

实施例2、ILgalA蛋白的制备

一、重组质粒的构建

1、提取白囊耙齿菌的总RNA，并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用GalF2和GalR2组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

GalF2：

GalR2：5’-ATTTGCGGCCGCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAATTCATGTGCTATATGCCTCTTAC-3’。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用限制性内切酶XhoI和NotI进行双酶切，回收酶切产物。

4、取pPICZαA载体，采用限制性内切酶XhoI和NotI进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pPICZαA-ILgalA。

根据测序结果，对重组质粒pPICZαA-ILgalA进行结构描述如下：具有序列表的序列4所示的开放阅读框。序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质。序列表的序列3所示蛋白质为前体蛋白，前体蛋白在第89位氨基酸残基和第90位氨基酸残基之间发生断裂，形成序列表的序列3第90-513位氨基酸残基组成的成熟蛋白。

二、重组菌的构建

用限制性内切酶SacⅠ酶切重组质粒pPICZαA-ILgalA，得到线性化质粒，将线性化质粒导入毕赤酵母x-33，得到重组酵母，命名为x-33-pPICZαA-ILgalA。

用限制性内切酶SacⅠ酶切pPICZαA载体，得到线性化质粒，将线性化质粒导入毕赤酵母x-33，得到重组酵母，命名为x-33-pPICZαA。

三、ILgalA蛋白的表达和纯化

1、将x-33-pPICZαA-ILgalA接种于20mL BMGY培养基，30℃、250rpm振荡培养至OD_600nm至4.0-6.0，5000rpm离心5min，收集菌体；将菌体重悬于100mL新鲜BMMY培养基，使OD_600nm＝1.0，然后30℃、250rpm振荡培养144小时(每24h向体系中加入甲醇并使其在体系中的体积百分浓度为1％)，然后12000rpm离心10min，收集上清液。

2、用x-33-pPICZαA代替x-33-pPICZαA-ILgalA，其它同步骤1。

3、将步骤1得到的上清液装进透析袋，在PBS缓冲液中进行透析除盐，然后收集透析袋中的液相。PBS缓冲液：pH7.5、20mmol/L的NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

4、取步骤3得到的液相，进行Ni柱亲和层析纯化。

纯化步骤：上样10mL液相，先用10mL洗涤液洗涤以除去杂蛋白，再用7mL洗脱液洗脱以收集目标蛋白，收集用洗脱液洗脱时的过柱后溶液，即为含有目标蛋白的溶液，命名为ILgalA溶液。

洗涤液：含500mmol/L的氯化钠、20mmol/L咪唑的PBS缓冲液。

洗脱液：含500mmol/L的氯化钠、120mmol/L咪唑的PBS缓冲液。

5、将步骤1得到的上清液、步骤2得到的上清液和步骤4得到的ILgalA溶液进行12.5％SDS-PAGE。步骤1得到的上清液中具有预期分子量的目标蛋白(64kDa)，步骤2得到的上清液中不具有所述目标蛋白。ILgalA溶液显示单一条带，且为目标蛋白。电泳图见图1。回收ILgalA溶液电泳的目标条带，进行N端15个氨基酸残基的测序，如序列表的序列3第90-104位氨基酸残基所示。

实施例3、ILgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶的酶活

本实施例采用模式底物pNPG，验证ILgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶的酶活。

本实施例采用的缓冲液均为pH4.8、100mM的醋酸钠缓冲液。

待测溶液为实施例2制备的ILgalA溶液。

1、pNPG溶于缓冲液，使其浓度为8mM，即为pNPG溶液。

2、取待测溶液，用缓冲液稀释，得到蛋白稀释液。

3、将100μL蛋白稀释液与100μLpNPG溶液混合，摇匀，60℃温育10min，然后加入800μL500mMNa₂CO₃水溶液终止反应，检测OD_405nm处的吸光值。用等体积缓冲液代替蛋白稀释液作为阴性对照。

4、采用缓冲液为溶剂，制备不同浓度的对硝基苯酚标准品溶液，检测标准品溶液在OD_405nm处的吸光值，以对硝基苯酚(pNP)浓度为横坐标，OD_405nm为纵坐标制作标准曲线。

5、检测蛋白稀释液中的蛋白浓度。

6、将步骤3的结果对照步骤4得到的标准曲线，结合步骤5得到的蛋白浓度，计算获得酶活结果。

以每分钟释放1μmol pNP需要的酶量定义为1个酶活力单位。

ILgalA溶液的蛋白的酶活为1012U/mg。

按照上述步骤检测实施例2的步骤三的2制备的上清液作为α-半乳糖苷酶的酶活，为0。

实施例4、α-半乳糖苷酶ILgalA的性质

一、最适pH测定

待测溶液为实施例2制备的ILgalA溶液。

缓冲液分别采用：pH3.2-6.0的50mM醋酸钠缓冲液，pH5.8-8.0的50mMNaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

其他同实施例3。

采用pH4.8的醋酸钠缓冲液酶活最高。将最高酶活作为100％，计算其他pH下的相对酶活，结果见图2。图2中，ABS代表醋酸钠缓冲液，PBS代表NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

二、pH稳定性测定

取实施例2制备的ILgalA溶液，通过如下预处理，得到待测溶液：采用不同预处理缓冲液进行稀释，使蛋白浓度为50μg/mL，然后室温孵育2小时。预处理缓冲液分别为：pH2.2-3.0的100mM甘氨酸-盐酸缓冲液、pH4.0-5.0的100mM醋酸钠缓冲液、pH6.0-8.0的100mMNaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH9.0-10.0的100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH11.0-12.0的100mMNaH₂PO₄-NaOH缓冲液。

检测待测溶液的酶活，方法同实施例3。

ILgalA蛋白在较宽的pH范围内(3.0-11.0)稳定。将未进行预处理的ILgalA溶液的蛋白的酶活结果作为100％，计算各个待测溶液的蛋白的相对酶活，结果见图3。

三、最适反应温度

待测溶液为实施例2制备的ILgalA溶液。

检测待测溶液的酶活，方法基本同实施例3。与实施例3的差异仅在于步骤3中分别采用如下温度：22℃、30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃。

采用70℃酶活最高。将最高酶活作为100％，计算其他温度下的相对酶活，结果见图4。

四、温度稳定性测定

取实施例2制备的ILgalA溶液，通过如下预处理，得到待测溶液：在不同温度(50℃、60℃或70℃)孵育1、2、4、6或10小时。

检测待测溶液的酶活，方法同实施例3。

ILgalA蛋白在50℃和60℃条件下温育10h酶活几乎不变，表现出极好的温度稳定性。将未进行预处理的ILgalA溶液的蛋白的酶活结果作为100％，计算各个待测溶液的蛋白的相对酶活，结果见图5。

五、天然半乳寡糖水解能力

以每分钟释放1μmolα-半乳糖需要的酶量定义为1个酶活力单位。

本步骤采用的缓冲液均为pH4.8、100mM的醋酸钠缓冲液。

1、检测对棉籽糖或水苏糖的水解能力(DNS法)

(1)将棉籽糖或水苏糖溶于缓冲液，使其浓度为80mM，即为寡糖溶液。

(2)取实施例2制备的ILgalA溶液，用缓冲液适当稀释，得到蛋白稀释液。

(3)将50μL蛋白稀释液与50μL寡糖溶液混合，摇匀，60℃孵育10min，然后加入300μL DNS溶液，沸水浴反应5min，然后置于冰浴迅速冷却，然后加入900μL H₂O，然后检测OD_540nm处的吸光值。

(4)将α-半乳糖溶于缓冲液中，制备不同浓度的α-半乳糖溶液；100μLα-半乳糖溶液与300μL DNS溶液混合，摇匀，沸水浴反应5min，然后置于冰浴迅速冷却，然后加入900μLH₂O，然后检测OD_540nm处的吸光值；以α-半乳糖浓度为横坐标，OD_540nm为纵坐标制作标准曲线。

(5)根据步骤(3)得到的吸光值、步骤(2)的稀释倍数和步骤(4)的标准曲线计算ILgalA对于棉籽糖或水苏糖的水解能力。

ILgalA溶液的蛋白对于棉籽糖的水解能力为755U/mg。

ILgalA溶液的蛋白对于水苏糖的水解能力为833U/mg。

2、检测对蜜二糖的水解能力

(1)将蜜二糖溶于缓冲液，使其浓度为80mM，即为蜜二糖溶液。

(2)取实施例2制备的ILgalA溶液，用缓冲液适当稀释，得到蛋白稀释液。

(3)将50μL蛋白稀释液与50μL蜜二糖溶液混合，摇匀，60℃孵育10min，然后煮沸，利用HPLC检测α-半乳糖的峰面积。

高效液相色谱：SHIMADZU LC-15C；

分析柱：MARS MOA(300mm×7.58mm)；保护柱：MARS MOA(50mm×7.58mm)；

流动相：2.5mM硫酸；

流速：0.6mL/min；

检测器：SHNIMADZU RID-10A；

柱温：60℃。

(4)将α-半乳糖溶于缓冲液中，制备不同浓度的α-半乳糖溶液；利用HPLC检测不同浓度的α-半乳糖对应的峰面积，参数同步骤(3)；以α-半乳糖浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标制作标准曲线。

(5)根据步骤(3)得到的峰面积、步骤(2)的稀释倍数和步骤(4)的标准曲线计算ILgalA对于蜜二糖的水解能力。

ILgalA溶液的蛋白对于蜜二糖的水解能力为644U/mg。

六、蛋白酶抗性

取实施例2制备的ILgalA溶液，分别进行如下预处理，得到待测溶液：①在1.0mg/mL胃蛋白酶溶液(体系为甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0)中37℃孵育1小时；②在10.0mg/mL胃蛋白酶溶液(体系为甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0)中37℃孵育1小时；③在1.0mg/mL胰蛋白酶溶液(体系为NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)中37℃孵育1小时；④在10.0mg/mL胰蛋白酶溶液(体系为NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)中37℃孵育1小时；⑤在1.0mg/mL糜蛋白酶溶液(体系为NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)中37℃孵育1小时；⑥在10.0mg/mL糜蛋白酶溶液(体系为NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)中37℃孵育1小时；⑦在1.0mg/mL蛋白酶K溶液(体系为NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH7.5)中37℃孵育1小时；⑧在10.0mg/mL蛋白酶K溶液(体系为NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH7.5)中37℃孵育1小时；ILgalA的浓度均为50μg/mL。

检测待测溶液的酶活，方法同实施例3。

将未进行预处理的ILgalA溶液的蛋白的酶活结果作为100％，计算各个待测溶液的蛋白的相对酶活，结果见图6。重组蛋白ILgalA经1.0mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶处理后均能保持92％以上的活性，经10.0mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶处理后仍能保持85％以上的活性，经10.0mg/mL蛋白酶K处理后，能保持44％以上的酶活。

实施例5、α-半乳糖苷酶ILgalA降解豆粉中的寡糖

一、豆粉溶液的制备

脱脂大豆粉和醋酸钠缓冲液(pH4.8、50mM)按1g：10ml配比混合，沸水浴30min，然后10000rpm离心15min，收集上清液。

二、水解试验

1、取步骤一得到的上清液，加入实施例2制备的ILgalA溶液，使蛋白浓度为2.7U/mL(U的计算方式见实施例3)，60℃孵育(10min、20min、30min、60min或90min)，然后沸水浴5min终止反应。

2、完成步骤1后，12000rpm离心15min，收集上清液，采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

3、采用HPAEC检测滤液中棉籽糖、水苏糖、蔗糖和α-半乳糖的浓度。

HPAEC检测条件如下：

离子色谱仪：Dionex ICS-3000；

分析柱：CarboPac PA10(250mm×4mm)；保护柱：CarboPac PA10(50mm×4mm)；

流动相：A相为NaOH水溶液250mM，B相为纯水；

流速：1.0mL/min；

进样量：25μL；柱温：30℃；

检测器：ED 3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比工作电极模式，四电位波形检测；

梯度洗脱条件见表3。

表3

时间	A相(％)	B相(％)
			0-14min(包括14min)	7.5	92.5
14-22min(包括22min)	80	20
			22-30min	7.5	92.5

根据标准品的出峰位置判定滤液中的物质，并利用标准品的标准曲线来计算物质含量。

滤液中棉籽糖、水苏糖、蔗糖和α-半乳糖的浓度见图7。ILgalA溶液的蛋白能在30min内有效水解脱脂大豆粉中的棉籽糖和水苏糖，生成蔗糖和α-半乳糖。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种高效、稳定的α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用

<130> GNCYX181488

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 437

<212> PRT

<213> 白囊耙齿菌（Irpex lacteus）

<400> 1

Met Ala Ala Leu Arg Tyr Leu Leu Thr Ile Thr Val Ser Ala Trp Tyr

1 5 10 15

Ala His Ala Ala Asp Asn Gly Leu Ala Ile Thr Pro Gln Met Gly Trp

20 25 30

Asn Thr Trp Asn His Phe Gly Cys Asp Ile Ser Glu Asp Thr Ile Met

35 40 45

Ser Ala Ala Gln Ala Ile Val Asn Tyr Asn Leu Thr Gln Phe Gly Tyr

50 55 60

Glu Tyr Val Ile Met Asp Asp Cys Trp His Ala Ala Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Thr Gly Ala Pro Val Ala Asp Pro Thr Lys Phe Pro Asn Gly Ile

85 90 95

Lys Ala Leu Ser Asp Lys Val His Ala Leu Gly Leu Lys Phe Gly Ile

100 105 110

Tyr Ser Ser Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Gly Gly Arg Phe Gly Ser Leu

115 120 125

Gly Tyr Glu Glu Ile Asp Ala Lys Thr Tyr Ala Asp Trp Gly Val Asp

130 135 140

Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Asn Asn Glu Gly Arg Ala Gly Thr Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ser Tyr Glu Arg Tyr Ala Asn Met Ser Arg Ala Leu Asn Ala

165 170 175

Thr Gly Arg Pro Ile Leu Tyr Ser Met Cys Asn Trp Gly Glu Asp Gly

180 185 190

Pro Trp Asn Phe Ala Pro Asn Ile Ala Asn Ser Trp Arg Ile Ser Gly

195 200 205

Asp Ile Met Asp Asn Phe Asp Arg Phe Asp Asp Arg Cys Pro Cys Thr

210 215 220

Ser Val Ile Asp Cys Lys Leu Pro Gly Tyr His Cys Ala Met Ala Arg

225 230 235 240

Ile Ile Asp Phe Ala Ala Pro Val Gly Gln Lys Ala Gly His Gly His

245 250 255

Trp Asn Asp Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Asn Gly Gly Met Thr Phe

260 265 270

Asp Glu Tyr Val Thr His Phe Ser Met Trp Ser Ile Leu Lys Ser Pro

275 280 285

Leu Ile Leu Gly Asn Asp Val Thr Asn Met Thr Asn Glu Thr Leu Gly

290 295 300

Ile Ile Thr Asn Gln Ala Ile Ile Asp Val Asn Gln Asp Ala Asn Gly

305 310 315 320

Ser Pro Ala Asn Arg Leu Trp Lys His Ser Val Asp Gly Gly Asp Leu

325 330 335

Ser Leu Trp Ala Gly Gly Leu Val Asn Asn Ser Tyr Val Val Ala Leu

340 345 350

Leu Asn Thr Ser Pro Ser Asn Gln Thr Val Asp Val Glu Phe Ser Asp

355 360 365

Val Phe Phe Asp Gln Gly Lys Glu Ala Gln Thr Gln Ser Tyr Thr Ile

370 375 380

Tyr Asp Leu Trp Gln Lys Asp Asp Ser Gly Ser Trp Gly Lys Ser Leu

385 390 395 400

Gly Thr Val Gln Gly Ser Ile Gly Asn Val Ser Val Gly Ala His Gln

405 410 415

Thr Lys Val Trp Lys Leu Val Pro Val Ser Ser Ala Ser Lys Arg His

420 425 430

Ile Ala His Glu Leu

435

<210> 2

<211> 1314

<212> DNA

<213> 白囊耙齿菌（Irpex lacteus）

<400> 2

atggcggctc tgcgatatct gcttaccatc acggtgtccg cctggtatgc gcatgcggcg 60

gataatggcc ttgcgatcac accacagatg ggctggaata cctggaacca cttcggatgc 120

gatatcagtg aagacacgat tatgagtgct gctcaagcta tagtgaatta caacctaact 180

cagtttggtt acgagtatgt cataatggac gactgttggc atgctgcctc tcgcgataat 240

gcaactgggg cgccagttgc agaccctacc aagtttccaa acggcatcaa agctctctca 300

gacaaggtcc acgctttagg attgaagttt ggtatctaca gtagcgcagg gacatatacc 360

tgcggaggtc gctttggctc cctaggatac gaagaaattg atgcgaagac gtacgcagac 420

tggggcgttg actacttgaa atatgataat tgcaacaacg aaggccgtgc tggaacccca 480

cttatatcgt acgaaagata cgccaacatg tcgagagctt taaacgcaac cggacgaccg 540

attctgtatt cgatgtgcaa ctggggtgag gacggcccgt ggaacttcgc gccaaacatt 600

gcaaacagct ggcgtatatc cggagacatc atggataatt tcgatcgctt cgacgaccgc 660

tgcccatgta cctctgtgat cgactgtaaa ctccctggct accactgcgc tatggcacga 720

atcatcgact tcgccgcacc cgttggtcag aaagctggcc atggccattg gaacgatctc 780

gacatgctgg aagtcggaaa cggaggaatg acattcgatg aatatgtgac gcatttctcg 840

atgtggagta tccttaaaag ccctcttatt ctcggtaacg acgtgacgaa catgacgaac 900

gagacattgg gcattattac gaaccaagcg atcatcgacg tcaatcagga cgcaaacggc 960

tcgcccgcga atcgcttatg gaagcactcc gtcgacggag gggacctgtc gttgtgggcc 1020

ggcggcctcg tgaataactc ctacgtcgtt gcactattga acacctcacc atcaaaccaa 1080

accgtcgatg tcgagttcag tgatgttttc tttgaccagg ggaaggaagc acaaactcaa 1140

tcatacacta tctatgatct ctggcagaag gatgactcag ggagctgggg gaagagcttg 1200

gggactgtgc aggggtctat tggtaatgtt agtgtgggtg ctcatcagac aaaggtgtgg 1260

aagcttgtgc ctgtttcttc tgctagtaag aggcatatag cacatgaatt gtag 1314

<210> 3

<211> 513

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ala Asp Asn Gly Leu Ala Ile

85 90 95

Thr Pro Gln Met Gly Trp Asn Thr Trp Asn His Phe Gly Cys Asp Ile

100 105 110

Ser Glu Asp Thr Ile Met Ser Ala Ala Gln Ala Ile Val Asn Tyr Asn

115 120 125

Leu Thr Gln Phe Gly Tyr Glu Tyr Val Ile Met Asp Asp Cys Trp His

130 135 140

Ala Ala Ser Arg Asp Asn Ala Thr Gly Ala Pro Val Ala Asp Pro Thr

145 150 155 160

Lys Phe Pro Asn Gly Ile Lys Ala Leu Ser Asp Lys Val His Ala Leu

165 170 175

Gly Leu Lys Phe Gly Ile Tyr Ser Ser Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Gly

180 185 190

Gly Arg Phe Gly Ser Leu Gly Tyr Glu Glu Ile Asp Ala Lys Thr Tyr

195 200 205

Ala Asp Trp Gly Val Asp Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Asn Asn Glu

210 215 220

Gly Arg Ala Gly Thr Pro Leu Ile Ser Tyr Glu Arg Tyr Ala Asn Met

225 230 235 240

Ser Arg Ala Leu Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Leu Tyr Ser Met Cys

245 250 255

Asn Trp Gly Glu Asp Gly Pro Trp Asn Phe Ala Pro Asn Ile Ala Asn

260 265 270

Ser Trp Arg Ile Ser Gly Asp Ile Met Asp Asn Phe Asp Arg Phe Asp

275 280 285

Asp Arg Cys Pro Cys Thr Ser Val Ile Asp Cys Lys Leu Pro Gly Tyr

290 295 300

His Cys Ala Met Ala Arg Ile Ile Asp Phe Ala Ala Pro Val Gly Gln

305 310 315 320

Lys Ala Gly His Gly His Trp Asn Asp Leu Asp Met Leu Glu Val Gly

325 330 335

Asn Gly Gly Met Thr Phe Asp Glu Tyr Val Thr His Phe Ser Met Trp

340 345 350

Ser Ile Leu Lys Ser Pro Leu Ile Leu Gly Asn Asp Val Thr Asn Met

355 360 365

Thr Asn Glu Thr Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gln Ala Ile Ile Asp Val

370 375 380

Asn Gln Asp Ala Asn Gly Ser Pro Ala Asn Arg Leu Trp Lys His Ser

385 390 395 400

Val Asp Gly Gly Asp Leu Ser Leu Trp Ala Gly Gly Leu Val Asn Asn

405 410 415

Ser Tyr Val Val Ala Leu Leu Asn Thr Ser Pro Ser Asn Gln Thr Val

420 425 430

Asp Val Glu Phe Ser Asp Val Phe Phe Asp Gln Gly Lys Glu Ala Gln

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Thr Gln Ser Tyr Thr Ile Tyr Asp Leu Trp Gln Lys Asp Asp Ser Gly

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Ser Val Gly Ala His Gln Thr Lys Val Trp Lys Leu Val Pro Val Ser

485 490 495

Ser Ala Ser Lys Arg His Ile Ala His Glu Leu His His His His His

500 505 510

His

<210> 4

<211> 1542

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

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ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgcg gataatggcc ttgcgatcac accacagatg 300

ggctggaata cctggaacca cttcggatgc gatatcagtg aagacacgat tatgagtgct 360

gctcaagcta tagtgaatta caacctaact cagtttggtt acgagtatgt cataatggac 420

gactgttggc atgctgcctc tcgcgataat gcaactgggg cgccagttgc agaccctacc 480

aagtttccaa acggcatcaa agctctctca gacaaggtcc acgctttagg attgaagttt 540

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aaagctggcc atggccattg gaacgatctc gacatgctgg aagtcggaaa cggaggaatg 1020

acattcgatg aatatgtgac gcatttctcg atgtggagta tccttaaaag ccctcttatt 1080

ctcggtaacg acgtgacgaa catgacgaac gagacattgg gcattattac gaaccaagcg 1140

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agtgtgggtg ctcatcagac aaaggtgtgg aagcttgtgc ctgtttcttc tgctagtaag 1500

aggcatatag cacatgaatt gcaccaccac caccaccact ag 1542