阅读说明：本技术 一种重组β-葡萄糖苷酶CB-3B及其在生产人参皂苷Rg3中的应用 (Recombinant β -glucosidase CB-3B and application thereof in production of ginsenoside Rg3 ) 是由 周义发 原野 胡晨星 孙琳 张梦珊 台桂花 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组β-葡萄糖苷酶CB-3B及其在生产人参皂苷Rg3中的应用。重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。实验证明,蛋白质CB-3B为β-葡萄糖苷酶,能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。利用蛋白质CB-3B和糖苷水解酶水解人参皂苷Rb1,可以生产人参皂苷Rg3。本发明具有重要应用价值。(The invention discloses a recombinant β -glucosidase CB-3B and application thereof in producing ginsenoside Rg 3. the amino acid sequence of the recombinant β -glucosidase CB-3B is shown as SEQ ID NO.2 or SEQ ID NO. 4. experiments prove that the protein CB-3B is β -glucosidase, can hydrolyze β -D-glucose bond bound to non-reducing end, and simultaneously release β -D-glucose and corresponding aglycone, the ginsenoside Rb1 is hydrolyzed by the protein CB-3B and glycoside hydrolase, and the ginsenoside Rg3 can be produced.)

一种重组β-葡萄糖苷酶CB-3B及其在生产人参皂苷Rg3中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组β-葡萄糖苷酶CB-3B及其在生产人参皂苷Rg3中的应用。

背景技术

人参皂苷Rg3具有良好的抗肿瘤、抗炎等药理学活性，潜在的应用价值很高。然而人参皂苷Rg3在人参中含量较低，从人参中提取进行工业化制备十分困难，因此，人参皂苷Rg3的应用受到限制。

人参皂苷Rb1在人参总皂苷中的含量高达15％以上，在西洋参总皂苷和三七总皂苷中的含量则高达25％和30％。人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3具有相同的苷元结构，只是连接在苷元C20位置上的糖基数目有所不同。因此，可以通过水解人参皂苷Rb1分子中C20位上的葡萄糖基，来获得人参皂苷Rg3。其中酸水解的专一性差，副产物多，产率低，产品的分离纯化比较困难。生物转化具有条件温和、专一性好、产率高、污染小等优点，是制备人参皂苷Rg3的理想方法。

发明内容

本发明的目的是制备人参皂苷Rg3。

本发明首先保护一种蛋白质CB-3B，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)氨基酸序列是SEQ ID NO：4所示的蛋白质；

a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：2可由765个氨基酸残基组成；SEQ ID NO：4可由785个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述a4)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a4)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a4)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述编码蛋白质CB-3B的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于纤维菌且编码所述蛋白质CB-3B的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，来源于纤维菌且编码所述蛋白质CB-3B的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：1由2301个核苷酸组成，SEQ ID NO：1的核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：3由2361个核苷酸组成，SEQ ID NO：3的核苷酸编码SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质CB-3B的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质CB-3B的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质CB-3B，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述含有编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点***SEQ ID NO：1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述表达载体可为pET-28a载体。

所述含有编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的重组载体具体可为将pET-28a载体的限制性内切酶NdeI和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子，得到的重组质粒pET-28a/CB-3B。

所述含有编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的重组微生物可为将上述任一所述含有编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述含有编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的重组微生物具体可为将所述重组质粒pET-28a/CB-3B导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为大肠杆菌。

所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护上述任一所述蛋白质CB-3B的应用，可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：

c1)在生产人参皂苷Rg3中的应用；

c2)在制备用于生产人参皂苷Rg3的产品中的应用；

c3)作为β-葡萄糖苷酶的应用；

c4)在制备具有β-葡萄糖苷酶的功能的产品中的应用；

c5)在水解人参皂苷Rb1中的应用；

c6)在制备用于水解人参皂苷Rb1的产品中的应用。

本发明还保护编码所述蛋白质CB-3B的核酸分子的应用，可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：

c1)在生产人参皂苷Rg3中的应用；

c2)在制备用于生产人参皂苷Rg3的产品中的应用；

c3)作为β-葡萄糖苷酶的应用；

c4)在制备具有β-葡萄糖苷酶的功能的产品中的应用；

c5)在水解人参皂苷Rb1中的应用；

c6)在制备用于水解人参皂苷Rb1的产品中的应用。

所述c1)或c2)中，所述生产人参皂苷Rg3是以人参皂苷Rb1作为底物的。需要说明的是，以人参皂苷Rb1作为底物具体可为以含有人参皂苷Rb1的总皂苷的物质作为底物。以含有人参皂苷Rb1的总皂苷的物质可为人参原二醇型总皂苷、西洋参、三七等等。

上文中，β-葡萄糖苷酶的含义为：能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基的酶。β-葡萄糖苷酶酶活力定义：β-葡萄糖苷酶在37℃条件下，每分钟催化对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside，PNPG)生成1μmol PNP所需要的酶量为1U。

本发明还保护一种生产人参皂苷Rg3的方法，可包括步骤(a1)：采用上述任一所述蛋白质CB-3B和糖苷水解酶水解人参皂苷Rb1。

所述步骤(a1)中，水解的体系可由人参皂苷Rb1、缓冲液、上述任一所述蛋白质CB-3B和糖苷水解酶组成。所述缓冲液可为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。所述Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液具体可为pH6.0、100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。在本发明的一个实施例中，水解体系具体为5L，由250g人参皂苷Rb1、500mL pH6.0、100mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、75kU重组β-葡萄糖苷酶CB-3B、25kU重组糖苷酶BglPC28和水组成。

所述步骤(a1)中，水解的参数可为150-200rpm(如150-170rpm、170-200rpm、150rpm、170rpm或200rpm)搅拌4-6h(如4-5h、5-6h、4h、5h或6h)。

上述任一所述的方法中，所述糖苷水解酶可为糖苷水解酶BglPC28；所述糖苷水解酶BglPC28可为如下d1)或d2)或d3)：

d1)氨基酸序列是SEQ ID NO：5所示的蛋白质；

d2)在SEQ ID NO：5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有糖苷水解酶活性的蛋白质。

所述糖苷水解酶BglPC28具体可为重组糖苷酶BglPC28(Chang-Hao Cui，et，al.Characterization of a Ginsenoside-Transformingβ-glucosidase fromPaenibacillusmucilaginosus and Its Application for Enhanced Production ofMinor Ginsenoside F2.10.1371/journal.pone.0085727)。

上述任一所述的方法还包括步骤(a2)；所述步骤(a2)为：完成步骤(a1)后，进行纯化。所述纯化可为硅胶柱纯化。

在本发明的一个实施例中，所述纯化的步骤具体如下：

(1-1)完成步骤(a1)后，离心，收集沉淀。

(1-2)完成步骤(1-1)后，用乙醇水溶液洗涤沉淀，收集上清。

(1-3)完成步骤(1-2)后，浓缩；

(1-4)完成步骤(1-3)后，除去乙醇。

(1-5)完成步骤(1-4)后，干燥。

所述步骤(1-1)中，离心的参数具体可为4000rpm离心15min。

所述步骤(1-2)中，“用乙醇水溶液洗涤沉淀，收集上清液”的方法具体可为将沉淀复溶于95％(v/v)乙醇水溶液，70℃搅拌2h，4000rpm离心15min，收集上清1和沉淀1；向沉淀1中加入95％(v/v)乙醇水溶液重悬，充分搅拌后再次离心，收集上清2。将上清1和上清2合并，得到上清合并液。

所述步骤(1-3)中，“浓缩”可通过使用旋转蒸发仪在50℃下旋转蒸发实现。

所述步骤(1-4)中，“除去乙醇”可通过过滤实现。

所述步骤(1-5)中，干燥可为真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或常压干燥。

实验证明，蛋白质CB-3B为β-葡萄糖苷酶，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。利用蛋白质CB-3B和糖苷水解酶水解人参皂苷Rb1，可以生产人参皂苷Rg3。本发明具有重要应用价值。

附图说明

图1为IPTG诱导前总蛋白溶液、IPTG诱导后总蛋白溶液和纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的SDS-PAGE结果。

图2为pH值对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B酶活力和稳定性的影响。其中■为pH2.0-6.0、50mM NaAc-HAc缓冲液，□为pH2.0-6.0、50mM NaAc-HAc缓冲液耐受，●为pH6.0-8.0、50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，○为pH6.0-8.0、50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液耐受，▲为pH8.0-11.0、50mM Glycine-NaOH缓冲液，△为pH8.0-11.0、50mM Glycine-NaOH缓冲液耐受。

图3为温度对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B酶活力的影响。

图4为温度对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B稳定性的影响。

图5为TLC检测重组β-葡萄糖苷酶CB-3B转化人参皂苷的结果。

图6为实施例4的HPLC检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Cellulosimicrobium sp.21已于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.7587。

β-葡萄糖苷酶酶活力定义：β-葡萄糖苷酶在37℃条件下，每分钟催化对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside，PNPG)生成1μmol PNP所需要的酶量为1U。

下述实施例中，PNP标准曲线为：y＝45.3x(R²＝0.9996，y：OD_405nm，x：μmol)。PNP标准曲线的制备方法如下：(1)精确称取1.39mg对硝基酚(PNP)，用适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至10mL，得到浓度为1mM的PNP母液；(2)取0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL或240μL PNP母液，先加入200μL浓度为0.5M的Na₂CO₃水溶液，再用去离子水定容至1000μL，混匀，得到待测液；(3)向96孔板加入200μL待测液，采用酶标仪检测405nm波长下的吸光值；(4)以待测液中PNP的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制PNP标准曲线。

实施例1、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的制备

一、重组质粒pET-28a/CB-3B的构建

1、采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取Cellulosimicrobium sp.21的基因组DNA。

2、完成步骤1后，以Cellulosimicrobium sp.21的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F：5′-GGAATTCCATATGAGCACCATTCCCTACCTCGA-3′(下划线为限制性内切酶NdeI的识别位点)和Primer-R：5′-CGGGATCCTCACTAGCCACCGACGGTGAACG-3′(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，回收约2320bp的PCR扩增产物。

反应条件：98℃预变性30s；98℃10s，65℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

3、完成步骤2后，将所述PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明，PCR扩增产物中含有SEQ ID No.1所示的DNA分子。

将SEQ ID No.1所示的DNA分子命名为CB-3B基因，CB-3B基因编码SEQ ID No.2所示的β-葡萄糖苷酶CB-3B。

4、取步骤3回收的PCR扩增产物，用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收约2310bp的酶切产物。

5、取pET-28a载体(Novegan)用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收约5.4Kb的载体骨架。

6、将步骤4回收的酶切产物和步骤5回收的载体骨架用T4DNA连接酶(TAKARA)连接，得到重组质粒pET-28a/CB-3B。

7、完成步骤6后，将重组质粒pET-28a/CB-3B进行测序。

根据测序结果，对重组质粒pET-28a/CB-3B进行结构描述如下：将pET-28a载体的限制性内切酶NdeI和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子，其它序列均不变。重组质粒pET-28a/CB-3B中，SEQ ID No.1所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ ID No.3所示的融合基因，表达SEQ ID No.4所示的具有His-tag标签的β-葡萄糖苷酶CB-3B。具有His-tag标签的β-葡萄糖苷酶CB-3B即为重组β-葡萄糖苷酶CB-3B。

重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的预期分子量为100KD。

二、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的表达和纯化

1、将重组质粒pET-28a/CB-3B导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21(DE3)-pET-28aCB-3B。

2、完成步骤1后，将BL21(DE3)-pET-28a/CB-3B的单克隆接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12h，得到种子液。取种子液4mL，以1：50(体积比)接种于装有200mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的摇瓶(摇瓶规格为1L)中，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值0.5(以LB液体培养基为空白对照)左右，得到培养菌液。

3、完成步骤2后，取培养菌液，5000rpm离心10min，收集菌体，获得IPTG诱导前的菌体。

4、完成步骤2后，向培养菌液中加入IPTG得到诱导体系(培养菌液降至25℃时加入IPTG)，IPTG在诱导体系中的浓度为0.5mM；然后25℃、120rpm振荡培养20h，5000rpm离心10min，收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

5、取IPTG诱导后的菌体，用PBS缓冲液洗涤1次，然后用50mL PBS缓冲液重悬，得到重悬液。

6、将步骤5得到的重悬液置冰上在超声破碎仪上超声破碎(超声波功率300W，循环程序为：破碎4s，停6s，共30个循环)，然后4℃、15000g离心30min，收集上清液，命名为IPTG诱导后总蛋白溶液。

7、按照5-6的步骤，将IPTG诱导后的菌体替换为IPTG诱导前的菌体，得到IPTG诱导前总蛋白溶液。

8、向步骤6得到的IPTG诱导后总蛋白溶液中加入咪唑，得到总蛋白咪唑溶液；总蛋白咪唑溶液中，咪唑的浓度为10mM。然后将总蛋白咪唑溶液和5mL Ni Sepharosefastflow凝胶(GE healthcare)混合，4℃、20rpm振荡30min，得到蛋白凝胶混合物。

9、将步骤8得到的蛋白凝胶混合物装入直径1.6cm、高10cm的层析柱(材质为玻璃)；先用2倍层析柱体积的含10mM咪唑的PBS缓冲液洗脱，以去除大多数的杂蛋白；再用5倍层析柱体积的含300mM咪唑的PBS缓冲液洗脱并收集过柱后溶液，即获得重组β-葡萄糖苷酶CB-3B溶液；最后用截留分子量为10kDa的超滤膜(Millipore)除去重组β-葡萄糖苷酶CB-3B溶液中的咪唑，得到纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B。

将IPTG诱导前总蛋白溶液、IPTG诱导后总蛋白溶液和纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B进行SDS-PAGE。

实验结果见图1(M为蛋白质分子量Marker，1为IPTG诱导前总蛋白溶液，2为IPTG诱导后总蛋白溶液，3为纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B)。结果表明，IPTG诱导前总蛋白溶液、IPTG诱导后总蛋白溶液和纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B中均含有分子量为100KDa的条带，与预期分子量一致。

实施例2、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的β-葡萄糖苷酶活性检测

PNPG为Sigma公司的产品。

1、制备反应体系。反应体系为100μL，由10μL待测样品(纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)或IPTG诱导后总蛋白溶液的稀释液(用超纯水稀释至5倍))、10μL浓度为5mM的PNPG水溶液和80μL pH5.0、50mM的NaAc-HAc缓冲液组成。

2、将步骤1制备的体系置于37℃条件下，反应10min。

3、完成步骤2后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

4、完成步骤3后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得待测样品的β-葡萄糖苷酶酶活力。进一步获得纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B和IPTG诱导后总蛋白溶液的酶活力。

5、用考马斯亮蓝G250法分别测定纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B和IPTG诱导后总蛋白溶液的总蛋白含量，进一步获得纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B和IPTG诱导后总蛋白溶液的比活力。

结果表明，IPTG诱导后总蛋白溶液的比活力为12U/mg，纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的比活力为27U/mg。由此可见，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B具有β-葡萄糖苷酶活性。

实施例3、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的生物学特性

一、pH值对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B酶活力的影响

1、制备反应体系。反应体系为100μL，由10μL纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)、10μL浓度为5mM的PNPG水溶液和80μL缓冲液组成。

缓冲液为pH2.0、50mM NaAc-HAc缓冲液、pH3.0、50mM NaAc-HAc缓冲液、pH4.0、50mM NaAc-HAc缓冲液、pH5.0、50mM NaAc-HAc缓冲液、pH6.0、50mM NaAc-HAc缓冲液、pH6.0、50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH7.0、50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH8.0、50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH8.0、50mM Glycine-NaOH缓冲液、pH9.0、50mMGlycine-NaOH缓冲液、pH10.0、50mM Glycine-NaOH缓冲液或pH11.0、50mM Glycine-NaOH缓冲液。

2、将步骤1制备的体系置于37℃条件下，反应10min。

3、完成步骤2后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

4、完成步骤3后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B在不同pH值条件下的酶活力。

检测结果见图2。结果表明，pH值为6.0时，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的酶活力最高。

二、pH值对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B稳定性的影响

1、将10μL纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)和50μL缓冲液混合，得到混合液。

缓冲液为pH4.0、100mM NaAc-HAc缓冲液、pH5.0、100mM NaAc-HAc缓冲液、pH6.0、100mM NaAc-HAc缓冲液、pH6.0、100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH7.0、100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH8.0、100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、pH8.0、100mM Glycine-NaOH缓冲液、pH9.0、100mM Glycine-NaOH缓冲液、pH10.0、100mM Glycine-NaOH缓冲液或pH11.0、100mMGlycine-NaOH缓冲液。

2、完成步骤1后，将所述混合液4℃静置24h。

3、制备反应体系。反应体系为100μL，由10μL完成步骤2的混合液、10μL浓度为5mM的PNPG水溶液和80μL pH5.0、50mM的NaAc-HAc缓冲液组成。

4、将步骤3制备的体系置于37℃条件下，反应10min。

5、完成步骤4后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

6、完成步骤5后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得完成步骤2的混合液的β-葡萄糖苷酶酶活力，即实验酶活。

7、按照上述步骤1-6，将步骤1中的缓冲液替换为去离子水，其它步骤均不变，得到相应的β-葡萄糖苷酶酶活力，作为对照酶活。

8、计算完成步骤2的混合液的β-葡萄糖苷酶的相对活性，计算公式为：相对活性＝实验酶活/对照酶活×100％

检测结果见图2。结果表明，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B在pH值5.5-10.0之间的缓冲液内4℃静置24h后，仍保留80％以上的酶活力。

三、温度对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B酶活力的影响

1、制备反应体系。反应体系为100μL，由10μL纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)、10μL浓度为5mM的PNPG水溶液和80μL pH6.0、50mM NaAc-HAc缓冲液组成。

2、将步骤1制备的体系置于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃或80℃，反应10min。

3、完成步骤2后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

4、完成步骤3后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B在不同温度条件下的酶活力。

检测结果见图3。结果表明，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的最适反应温度为55℃。

四、温度对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B稳定性的影响

1、将纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃水浴中分别静置5min、10min、15min、30min、45min和60min。

2、制备反应体系。反应体系为100μL，由10μL完成步骤1的酶液、10μL浓度为5mM的PNPG水溶液和80μL pH6.0、50mM NaAc-HAc缓冲液组成。

3、将步骤2制备的体系置于37℃条件下，反应10min。

4、完成步骤3后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

5、完成步骤4后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得完成步骤1的酶液的β-葡萄糖苷酶酶活力，即实验酶活。

6、按照上述步骤2-5，将步骤2中“完成步骤1的酶液”替换为纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)，其它步骤均不变，得到相应的β-葡萄糖苷酶酶活力，作为对照酶活。

7、计算完成步骤1的酶液的β-葡萄糖苷酶的相对活性，计算公式为：相对活性＝实验酶活/对照酶活×100％

检测结果见图4。结果表明，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B在30-45℃之间静置1h，仍保留80％以上的酶活力。

五、金属化合物或化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B稳定性的影响

1、将10μL纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)和不同的金属化合物或化学试剂混合，得到混合液。混合液中，金属化合物或化学试剂的浓度均为50mM。

2、完成步骤1后，将所述混合液30℃水浴中静置1h。

3、制备反应体系。反应体系为100μL，由10μL完成步骤2的混合液、10μL浓度为5mM的PNPG水溶液和80μL pH6.0、50mM NaAc-HAc缓冲液组成。

4、将步骤3制备的体系置于37℃条件下，反应10min。

5、完成步骤4后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

6、完成步骤5后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得完成步骤2的混合液的β-葡萄糖苷酶酶活力，即实验酶活。

7、按照上述步骤3-6，将步骤3中“完成步骤2的混合液”替换为混合液甲，其它步骤均不变，得到相应的β-葡萄糖苷酶酶活力，作为对照酶活。

混合液甲为：取10μL纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的稀释液(用超纯水稀释至5倍)，30℃水浴中静置1h。

8、计算完成步骤2的混合液的β-葡萄糖苷酶的相对活性，计算公式为：相对活性＝实验酶活/对照酶活×100％

检测结果见表2。结果表明，Cu²+、Fe³+、Hg²+和SDS几乎完全抑制了重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的活性，Ba²+对重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的活性有明显的抑制作用，Ca²+、Mn²+和EDTA不同程度地抑制了重组β-葡萄糖苷酶CB-3B的活性。

表2

金属离子或化学试剂	相对活力(％)
		NaCl	98.0±1.9
KCl	91.9±2.1
		MgCl<sub>2</sub>	85.9±0.9
CuCl<sub>2</sub>	-
		FeCl<sub>3</sub>	-
BaCl<sub>2</sub>	15.2±0.2
		CaCl<sub>2</sub>	27.3±1.2
HgCl<sub>2</sub>	-
		MnCl<sub>2</sub>	37.5±0.9
EDTA	80.8±0.3
		DTT	112.1±3.1
SDS	-

注：“-”表示相对活力几乎为0。

六、底物特异性分析

1、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B对pNP-糖苷底物的特异性分析

pNP-糖苷底物为pNPβGlc、pNPβMan、pNPβGal、pNPβXyl、pNPαGlc、pNPαMan、pNPαGal、pNPαAraf或pNPαArap。

(1)制备反应体系。反应体系为200μL，由pNP-糖苷底物、50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)和0.5μg纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B组成。pNP-糖苷底物在反应体系中的浓度为2mM。

(2)将步骤(1)制备的体系置于30℃条件下，反应10min。

(3)完成步骤(2)后，加入100μL浓度为1M的NaOH水溶液终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。

(4)完成步骤(3)后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据PNP标准曲线，获得pNP-糖苷底物的酶活力。

(5)pNPβGlc的酶活力最高，将其相对活力定义为100％；计算其它pNP-糖苷底物的相对活力。相对活力＝pNP-糖苷底物的酶活力/pNPβGlc的酶活力×100％

检测结果见表3。

表3

底物	相对活力(％)	底物	相对活力(％)
				pNPβGlc	100±0.0	pNPαAraf	-
pNPβGal	-	pNPαArap	-
				pNPβMan	-	槐二糖	25.1±0.7
pNPβXyl	-	昆布二糖	40.0±1.3
				pNPαGlc	-	纤维二糖	-
pNPαGal	-	龙胆二糖	100±0.0
				pNPαMan	-		-

注：“-”表示相对活力不存在。

2、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B对二糖底物的特异性分析

二糖底物为槐二糖、昆布二糖、纤维二糖或龙胆二糖。

(1)制备反应体系。反应体系为200μL，由二糖底物、50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)和0.5μg纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B组成。二糖底物在反应体系中的浓度为2mg/mL。

(2)将步骤(1)制备的体系置于30℃条件下，反应10min。

(3)完成步骤(2)后，98℃作用5min，目的为使酶灭活。

(4)完成步骤(3)后，使用葡萄糖试剂盒GAGO20检测葡萄糖释放量，获得不同二糖底物酶活力。

(5)龙胆二糖的酶活力最高，将其相对活力定义为100％；计算其它二糖底物的相对活力。相对活力＝二糖底物的酶活力/龙胆二糖的酶活力×100％

检测结果见表3。

3、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B对人参皂苷底物的特异性分析

人参皂苷底物为Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re或Rg1。其中Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd为二醇型人参皂苷。Re和Rg1为三醇型人参皂苷。

(1)制备反应体系。反应体系为200μL，由人参皂苷底物、50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)和纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B组成。人参皂苷底物在反应体系中的浓度为1mg/mL，纯化的重组β-葡萄糖苷酶CB-3B在反应体系中的浓度为0.1mg/mL。

(2)将步骤(1)制备的体系置于30℃条件下，反应2h或24h。

(3)完成步骤(2)后，加入等体积的正丁醇萃取，得到人参皂苷样品。

(4)完成步骤(3)后，先使用毛细管分别将10-20μg人参皂苷样品、“Rh2、Rg3、Rd、Rc和Rb1标准品组成的混标1”、“CK、Gyp LXXV、Gyp XVII和Rb2标准品组成的混标2”和“Rh1、Rg1、Re和Rb3标准品组成的混标3”点样于G60硅胶板，干燥后置于装有展层剂(氯仿：甲醇：水＝65:35:10)的展层缸中进行展层；之后吹干硅胶板，置于5％(v/v)硫酸-乙醇溶液中染色；再次吹干后105℃处理5min。根据标准品的迁移率(Rf值)，鉴定人参皂苷样品中的组分。

检测结果见图5(S1为混标1；S2为混标2；1为Rb1转化前，2为Rb1转化后，3为Rb2转化前，4为Rb2转化后，5为Rb3转化前，6为Rb3转化后，7为Rc转化前，8为Rc转化后，9为Rd转化前，10为Rd转化后，11为Re转化前，12为Re转化后，13为Rg1转化前，14为Rg1转化后，S3为混标3)。

结果表明，pNP-糖苷底物中，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B只能水解pNPβGlc底物；二糖底物中，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B只对纤维二糖没有水解能力，对龙胆二糖的水解能力分别是槐二糖和昆布二糖的4倍和2.5倍；人参皂苷底物中，重组β-葡萄糖苷酶CB-3B只可水解人参皂苷Rb1生成Rd，且不能继续水解，即重组β-葡萄糖苷酶CB-3B只能水解人参皂苷分子C-20位外侧葡萄糖。

实施例4、重组β-葡萄糖苷酶CB-3B和重组糖苷酶BglPC28制备人参皂苷Rg3

重组糖苷酶BglPC28记载于如下文献中：Chang-Hao Cui，et，al.Characterization of a Ginsenoside-Transformingβ-glucosidase fromPaenibacillusmucilaginosus and Its Application for Enhanced Production ofMinor Ginsenoside F2.10.1371/journal.pone.0085727

人参皂苷Rb1为自宁波金艾农生物科技有限公司的产品，该人参皂苷Rb1的纯度为70.1％。人参皂苷Rb1标准品和人参皂苷Rg3标准品均为中国药品生物制品检定所的产品。

1、制备反应体系。反应体系为5L，由250g人参皂苷Rb1、500mL pH6.0、100mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、75kU重组β-葡萄糖苷酶CB-3B、25kU重组糖苷酶BglPC28和水组成。

2、完成步骤1后，将所述反应体系置于反应釜(规格为10L)，170rpm搅拌5h，然后4000rpm离心15min，收集沉淀。

3、完成步骤2后，将所述沉淀复溶于5L 95％(v/v)乙醇水溶液，70℃搅拌2h，4000rpm离心15min，收集上清1和沉淀1；向所述沉淀1中加入2.5L 95％(v/v)乙醇水溶液重悬，充分搅拌后再次离心，收集上清2。将上清1和上清2合并，得到上清合并液。

4、完成步骤3后，取所述上清合并液，使用旋转蒸发仪在50℃下旋转蒸至悬浊体积为1L，过滤除去乙醇，固体真空干燥，得92.8g人参皂苷Rg3纯品，产率为72.3％。

7、分别以人参皂苷Rb1标准品和人参皂苷Rg3标准品作为标准品，采用HPLC-C18反相柱法检测人参皂苷Rg3纯品中人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3的含量。使用配有Shim packPREP ODS(H)反相柱(250×4.6mm，5μm)的高效液相色谱仪和紫外可见检测器进行HPLC检测。流动相由水(A)和乙腈(B)组成，流速为1mL/min，使用以下梯度洗脱条件：0～10min(含10min)，流动相中乙腈的体积百分含量由0％匀速增至32％，水的体积百分含量由100％匀速降至68％，进行线性梯度洗脱；10～40min(含40min)，流动相中乙腈的体积百分含量由32％匀速增至60％，水的体积百分含量由68％匀速降至40％，进行线性梯度洗脱；40～50min，用由乙腈和水按照6:4的体积比混合得到的流动相进行洗脱。检测波长为203nm。柱温为25℃。上样量为20μL。同时定量分析不同浓度Rb1标准品溶液和不同浓度人参皂苷Rg3标准品溶液，并制备标准曲线。

部分HPLC检测结果见图6(标准品为人参皂苷Rb1标准品和人参皂苷Rg3标准品的叠加图，底物为人参皂苷Rb1，产物为人参皂苷Rg3纯品)，在该色谱条件下，人参皂苷Rb1的保留时间为24.6min，人参皂苷Rg3的保留时间为35.4min。结果表明，人参皂苷Rg3纯品中不含有人参皂苷Rb1，人参皂苷Rb1全部转化为人参皂苷Rg3。人参皂苷Rg3纯品的纯度为95.8％。

<110> 东北师范大学

<120> 一种重组β-葡萄糖苷酶CB-3B及其在生产人参皂苷Rg3中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2301

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgagcacca ttccctacct cgaccccgcc gtgcccgtgg ccgaccgcgt cgaggacctc 60

ctcgcccgca tgacgctgcc cgagaaggtc ggccagatgc tccagctcga cgcgcgcgac 120

ggcgtcgggc ccgcggtgct cgagaagcac gcgggctcgc tgctgcacac ctcgccggag 180

aacgtcctcg ccgcgcacga gctcaccggg cggacgcggc tgcgcatccc cctgctgctc 240

gccgagggat gcatccacgg ccactcgttc tgggtcggcg cgacgatctt ccccacccag 300

ctcggcatgg ccgcgacgtg ggaccccgcg ctcgtggagc aggtcgcgca cgcgaccgcg 360

gtcgaggtcg ccgcgaccgg cgtccactgg accttctccc ccgtgctctg catcgcgcgc 420

gacctgcgct ggggccgcgt cgacgagacg ttcggcgagg acccgttcct catcggcgag 480

ctcgcgtccg cgatggtccg cggctaccag ggcgacgggc tgtccgaccc gacgggcatc 540

ctcgccacgg cgaagcactt cgcgggctac tccgagacgc agggcgggcg cgacgcgagc 600

gaggccgaca tctcgcagcg caagctccgg tcctggttcc tgcccccgtt cgagcgggtc 660

gcgcgcgagg gctgcgccac gttcatgctc ggctaccagt ccatggacgg cgtgcccgtc 720

accgtgaacg gctggctgct cgacgacgtc ctgcgcggcg agtggggcta caccggcacg 780

ctcgtcaccg cttgggacaa cgtgggccgc atggtctggg agcagcacat ccagcccgac 840

tacgtgcacg cgtccgccgc ggccgtgcgc gccggcaacg acatggtcat gacgacgccg 900

cgcttcttcg agggcgcgct cgaggcggtg gaccgcggcc tcgtcgagga ggccgcgatc 960

gacgccgccg tccggcgcat cctcacgctc aagttccgcc tcggcctgtt cgaggacccg 1020

cggcggccgg acgtcgcgcg ccagcaggcg gtcatcgcgt cggccgagca cgccgcggtg 1080

aacctcgagg tcgcgcgccg ctccctcgtg ctcctcacca acgacggcac cctcccgttc 1140

gcgggcgggc tcgaccgtgc cgccggcacg cccgacggcc gggccctcgc cccggccggg 1200

gcgcccgccc ggacgatcgc cgtcgtcggc ccgaacgcgg acgacgacca cacgcagctc 1260

ggcgactggg cgggcgcgtc gggccaggcc gactggctgc cggacggcca cccgcgcgag 1320

atgacgacga ccgtgctcga cggcttccgc gcgctcgccc cggagggctg ggccgtgacc 1380

cacgcgcgcg gcgccgacat cctcacgctc gcgcccgacc cggagggcga gctgttcccc 1440

gacgggcagc cgcggccgca ggtcgtcgtc ccggcggcgc ccgacgacgc gctgatcgcc 1500

gaggccgtcg ccgccgcgcg cgacgccgac ctcgccgtcg ccgtggtggg cgaccgcatc 1560

gagctcgtgg gcaaggggcg ctcgaccgcg acgctcgagc tcgtcggcgg ccaggtcgcg 1620

ctgctcgacg ccctcgtcgc caccggcacc cccgtggtcg tggtcgtcgt cgcgtcgaag 1680

ccgctcgtcc tgccgccgtc ggcgcacgcg gcggcggcgg tcgtctgggc ggccaacccc 1740

gggatgcgcg gcggccaggc cgtcgccgag ctcgtgctcg ggctgatcga gcccgagggc 1800

cggctcccga tctcgttcgc gcgccacgcg ggcgagcagc cgacctacta caacgtggtc 1860

cgcggccagc acggcgtccg ctacgccgac ctcacgcaaa gccccgcgtt cgcgttcggc 1920

gagggcctga gctacaccac cgtcgagtac gccgacctgc gggtgctcgg cacggagcac 1980

gggcccgacg acgtcgtgcg cgccgaggtc acgctgacga acaccgggtc gcgcccggtg 2040

cgcgagaccg tccaggtcta cgtgagcgac accgtcacgt cggtgacgtg ggccgagaag 2100

gagctcaagg cctaccgcaa ggtggacctc gcgccgggcg agtcggcgac cgtcggcctc 2160

gaggtgcccg tggcggactg cacgctcgtc gacgcgcatg ggcgccgcgt cgtcgagccg 2220

ggcgagttcg agctgcgcgt cgggccgtcc tcgcgcgagg acgcgctcct gcgcgcgtcg 2280

ttcaccgtcg gtggctagtg a 2301

<210> 2

<211> 765

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ser Thr Ile Pro Tyr Leu Asp Pro Ala Val Pro Val Ala Asp Arg

1 5 10 15

Val Glu Asp Leu Leu Ala Arg Met Thr Leu Pro Glu Lys Val Gly Gln

20 25 30

Met Leu Gln Leu Asp Ala Arg Asp Gly Val Gly Pro Ala Val Leu Glu

35 40 45

Lys His Ala Gly Ser Leu Leu His Thr Ser Pro Glu Asn Val Leu Ala

50 55 60

Ala His Glu Leu Thr Gly Arg Thr Arg Leu Arg Ile Pro Leu Leu Leu

65 70 75 80

Ala Glu Gly Cys Ile His Gly His Ser Phe Trp Val Gly Ala Thr Ile

85 90 95

Phe Pro Thr Gln Leu Gly Met Ala Ala Thr Trp Asp Pro Ala Leu Val

100 105 110

Glu Gln Val Ala His Ala Thr Ala Val Glu Val Ala Ala Thr Gly Val

115 120 125

His Trp Thr Phe Ser Pro Val Leu Cys Ile Ala Arg Asp Leu Arg Trp

130 135 140

Gly Arg Val Asp Glu Thr Phe Gly Glu Asp Pro Phe Leu Ile Gly Glu

145 150 155 160

Leu Ala Ser Ala Met Val Arg Gly Tyr Gln Gly Asp Gly Leu Ser Asp

165 170 175

Pro Thr Gly Ile Leu Ala Thr Ala Lys His Phe Ala Gly Tyr Ser Glu

180 185 190

Thr Gln Gly Gly Arg Asp Ala Ser Glu Ala Asp Ile Ser Gln Arg Lys

195 200 205

Leu Arg Ser Trp Phe Leu Pro Pro Phe Glu Arg Val Ala Arg Glu Gly

210 215 220

Cys Ala Thr Phe Met Leu Gly Tyr Gln Ser Met Asp Gly Val Pro Val

225 230 235 240

Thr Val Asn Gly Trp Leu Leu Asp Asp Val Leu Arg Gly Glu Trp Gly

245 250 255

Tyr Thr Gly Thr Leu Val Thr Ala Trp Asp Asn Val Gly Arg Met Val

260 265 270

Trp Glu Gln His Ile Gln Pro Asp Tyr Val His Ala Ser Ala Ala Ala

275 280 285

Val Arg Ala Gly Asn Asp Met Val Met Thr Thr Pro Arg Phe Phe Glu

290 295 300

Gly Ala Leu Glu Ala Val Asp Arg Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Ile

305 310 315 320

Asp Ala Ala Val Arg Arg Ile Leu Thr Leu Lys Phe Arg Leu Gly Leu

325 330 335

Phe Glu Asp Pro Arg Arg Pro Asp Val Ala Arg Gln Gln Ala Val Ile

340 345 350

Ala Ser Ala Glu His Ala Ala Val Asn Leu Glu Val Ala Arg Arg Ser

355 360 365

Leu Val Leu Leu Thr Asn Asp Gly Thr Leu Pro Phe Ala Gly Gly Leu

370 375 380

Asp Arg Ala Ala Gly Thr Pro Asp Gly Arg Ala Leu Ala Pro Ala Gly

385 390 395 400

Ala Pro Ala Arg Thr Ile Ala Val Val Gly Pro Asn Ala Asp Asp Asp

405 410 415

His Thr Gln Leu Gly Asp Trp Ala Gly Ala Ser Gly Gln Ala Asp Trp

420 425 430

Leu Pro Asp Gly His Pro Arg Glu Met Thr Thr Thr Val Leu Asp Gly

435 440 445

Phe Arg Ala Leu Ala Pro Glu Gly Trp Ala Val Thr His Ala Arg Gly

450 455 460

Ala Asp Ile Leu Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Gly Glu Leu Phe Pro

465 470 475 480

Asp Gly Gln Pro Arg Pro Gln Val Val Val Pro Ala Ala Pro Asp Asp

485 490 495

Ala Leu Ile Ala Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Asp Ala Asp Leu Ala

500 505 510

Val Ala Val Val Gly Asp Arg Ile Glu Leu Val Gly Lys Gly Arg Ser

515 520 525

Thr Ala Thr Leu Glu Leu Val Gly Gly Gln Val Ala Leu Leu Asp Ala

530 535 540

Leu Val Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Val Val Val Val Ala Ser Lys

545 550 555 560

Pro Leu Val Leu Pro Pro Ser Ala His Ala Ala Ala Ala Val Val Trp

565 570 575

Ala Ala Asn Pro Gly Met Arg Gly Gly Gln Ala Val Ala Glu Leu Val

580 585 590

Leu Gly Leu Ile Glu Pro Glu Gly Arg Leu Pro Ile Ser Phe Ala Arg

595 600 605

His Ala Gly Glu Gln Pro Thr Tyr Tyr Asn Val Val Arg Gly Gln His

610 615 620

Gly Val Arg Tyr Ala Asp Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Ala Phe Gly

625 630 635 640

Glu Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Val Glu Tyr Ala Asp Leu Arg Val Leu

645 650 655

Gly Thr Glu His Gly Pro Asp Asp Val Val Arg Ala Glu Val Thr Leu

660 665 670

Thr Asn Thr Gly Ser Arg Pro Val Arg Glu Thr Val Gln Val Tyr Val

675 680 685

Ser Asp Thr Val Thr Ser Val Thr Trp Ala Glu Lys Glu Leu Lys Ala

690 695 700

Tyr Arg Lys Val Asp Leu Ala Pro Gly Glu Ser Ala Thr Val Gly Leu

705 710 715 720

Glu Val Pro Val Ala Asp Cys Thr Leu Val Asp Ala His Gly Arg Arg

725 730 735

Val Val Glu Pro Gly Glu Phe Glu Leu Arg Val Gly Pro Ser Ser Arg

740 745 750

Glu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Ser Phe Thr Val Gly Gly

755 760 765

<210> 3

<211> 2361

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgagcacca ttccctacct cgaccccgcc gtgcccgtgg ccgaccgcgt cgaggacctc 120

ctcgcccgca tgacgctgcc cgagaaggtc ggccagatgc tccagctcga cgcgcgcgac 180

ggcgtcgggc ccgcggtgct cgagaagcac gcgggctcgc tgctgcacac ctcgccggag 240

aacgtcctcg ccgcgcacga gctcaccggg cggacgcggc tgcgcatccc cctgctgctc 300

gccgagggat gcatccacgg ccactcgttc tgggtcggcg cgacgatctt ccccacccag 360

ctcggcatgg ccgcgacgtg ggaccccgcg ctcgtggagc aggtcgcgca cgcgaccgcg 420

gtcgaggtcg ccgcgaccgg cgtccactgg accttctccc ccgtgctctg catcgcgcgc 480

gacctgcgct ggggccgcgt cgacgagacg ttcggcgagg acccgttcct catcggcgag 540

ctcgcgtccg cgatggtccg cggctaccag ggcgacgggc tgtccgaccc gacgggcatc 600

ctcgccacgg cgaagcactt cgcgggctac tccgagacgc agggcgggcg cgacgcgagc 660

gaggccgaca tctcgcagcg caagctccgg tcctggttcc tgcccccgtt cgagcgggtc 720

gcgcgcgagg gctgcgccac gttcatgctc ggctaccagt ccatggacgg cgtgcccgtc 780

accgtgaacg gctggctgct cgacgacgtc ctgcgcggcg agtggggcta caccggcacg 840

ctcgtcaccg cttgggacaa cgtgggccgc atggtctggg agcagcacat ccagcccgac 900

tacgtgcacg cgtccgccgc ggccgtgcgc gccggcaacg acatggtcat gacgacgccg 960

cgcttcttcg agggcgcgct cgaggcggtg gaccgcggcc tcgtcgagga ggccgcgatc 1020

gacgccgccg tccggcgcat cctcacgctc aagttccgcc tcggcctgtt cgaggacccg 1080

cggcggccgg acgtcgcgcg ccagcaggcg gtcatcgcgt cggccgagca cgccgcggtg 1140

aacctcgagg tcgcgcgccg ctccctcgtg ctcctcacca acgacggcac cctcccgttc 1200

gcgggcgggc tcgaccgtgc cgccggcacg cccgacggcc gggccctcgc cccggccggg 1260

gcgcccgccc ggacgatcgc cgtcgtcggc ccgaacgcgg acgacgacca cacgcagctc 1320

ggcgactggg cgggcgcgtc gggccaggcc gactggctgc cggacggcca cccgcgcgag 1380

atgacgacga ccgtgctcga cggcttccgc gcgctcgccc cggagggctg ggccgtgacc 1440

cacgcgcgcg gcgccgacat cctcacgctc gcgcccgacc cggagggcga gctgttcccc 1500

gacgggcagc cgcggccgca ggtcgtcgtc ccggcggcgc ccgacgacgc gctgatcgcc 1560

gaggccgtcg ccgccgcgcg cgacgccgac ctcgccgtcg ccgtggtggg cgaccgcatc 1620

gagctcgtgg gcaaggggcg ctcgaccgcg acgctcgagc tcgtcggcgg ccaggtcgcg 1680

ctgctcgacg ccctcgtcgc caccggcacc cccgtggtcg tggtcgtcgt cgcgtcgaag 1740

ccgctcgtcc tgccgccgtc ggcgcacgcg gcggcggcgg tcgtctgggc ggccaacccc 1800

gggatgcgcg gcggccaggc cgtcgccgag ctcgtgctcg ggctgatcga gcccgagggc 1860

cggctcccga tctcgttcgc gcgccacgcg ggcgagcagc cgacctacta caacgtggtc 1920

cgcggccagc acggcgtccg ctacgccgac ctcacgcaaa gccccgcgtt cgcgttcggc 1980

gagggcctga gctacaccac cgtcgagtac gccgacctgc gggtgctcgg cacggagcac 2040

gggcccgacg acgtcgtgcg cgccgaggtc acgctgacga acaccgggtc gcgcccggtg 2100

cgcgagaccg tccaggtcta cgtgagcgac accgtcacgt cggtgacgtg ggccgagaag 2160

gagctcaagg cctaccgcaa ggtggacctc gcgccgggcg agtcggcgac cgtcggcctc 2220

gaggtgcccg tggcggactg cacgctcgtc gacgcgcatg ggcgccgcgt cgtcgagccg 2280

ggcgagttcg agctgcgcgt cgggccgtcc tcgcgcgagg acgcgctcct gcgcgcgtcg 2340

ttcaccgtcg gtggctagtg a 2361

<210> 4

<211> 785

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ser Thr Ile Pro Tyr Leu Asp Pro Ala Val Pro

20 25 30

Val Ala Asp Arg Val Glu Asp Leu Leu Ala Arg Met Thr Leu Pro Glu

35 40 45

Lys Val Gly Gln Met Leu Gln Leu Asp Ala Arg Asp Gly Val Gly Pro

50 55 60

Ala Val Leu Glu Lys His Ala Gly Ser Leu Leu His Thr Ser Pro Glu

65 70 75 80

Asn Val Leu Ala Ala His Glu Leu Thr Gly Arg Thr Arg Leu Arg Ile

85 90 95

Pro Leu Leu Leu Ala Glu Gly Cys Ile His Gly His Ser Phe Trp Val

100 105 110

Gly Ala Thr Ile Phe Pro Thr Gln Leu Gly Met Ala Ala Thr Trp Asp

115 120 125

Pro Ala Leu Val Glu Gln Val Ala His Ala Thr Ala Val Glu Val Ala

130 135 140

Ala Thr Gly Val His Trp Thr Phe Ser Pro Val Leu Cys Ile Ala Arg

145 150 155 160

Asp Leu Arg Trp Gly Arg Val Asp Glu Thr Phe Gly Glu Asp Pro Phe

165 170 175

Leu Ile Gly Glu Leu Ala Ser Ala Met Val Arg Gly Tyr Gln Gly Asp

180 185 190

Gly Leu Ser Asp Pro Thr Gly Ile Leu Ala Thr Ala Lys His Phe Ala

195 200 205

Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Gly Gly Arg Asp Ala Ser Glu Ala Asp Ile

210 215 220

Ser Gln Arg Lys Leu Arg Ser Trp Phe Leu Pro Pro Phe Glu Arg Val

225 230 235 240

Ala Arg Glu Gly Cys Ala Thr Phe Met Leu Gly Tyr Gln Ser Met Asp

245 250 255

Gly Val Pro Val Thr Val Asn Gly Trp Leu Leu Asp Asp Val Leu Arg

260 265 270

Gly Glu Trp Gly Tyr Thr Gly Thr Leu Val Thr Ala Trp Asp Asn Val

275 280 285

Gly Arg Met Val Trp Glu Gln His Ile Gln Pro Asp Tyr Val His Ala

290 295 300

Ser Ala Ala Ala Val Arg Ala Gly Asn Asp Met Val Met Thr Thr Pro

305 310 315 320

Arg Phe Phe Glu Gly Ala Leu Glu Ala Val Asp Arg Gly Leu Val Glu

325 330 335

Glu Ala Ala Ile Asp Ala Ala Val Arg Arg Ile Leu Thr Leu Lys Phe

340 345 350

Arg Leu Gly Leu Phe Glu Asp Pro Arg Arg Pro Asp Val Ala Arg Gln

355 360 365

Gln Ala Val Ile Ala Ser Ala Glu His Ala Ala Val Asn Leu Glu Val

370 375 380

Ala Arg Arg Ser Leu Val Leu Leu Thr Asn Asp Gly Thr Leu Pro Phe

385 390 395 400

Ala Gly Gly Leu Asp Arg Ala Ala Gly Thr Pro Asp Gly Arg Ala Leu

405 410 415

Ala Pro Ala Gly Ala Pro Ala Arg Thr Ile Ala Val Val Gly Pro Asn

420 425 430

Ala Asp Asp Asp His Thr Gln Leu Gly Asp Trp Ala Gly Ala Ser Gly

435 440 445

Gln Ala Asp Trp Leu Pro Asp Gly His Pro Arg Glu Met Thr Thr Thr

450 455 460

Val Leu Asp Gly Phe Arg Ala Leu Ala Pro Glu Gly Trp Ala Val Thr

465 470 475 480

His Ala Arg Gly Ala Asp Ile Leu Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Gly

485 490 495

Glu Leu Phe Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Gln Val Val Val Pro Ala

500 505 510

Ala Pro Asp Asp Ala Leu Ile Ala Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Asp

515 520 525

Ala Asp Leu Ala Val Ala Val Val Gly Asp Arg Ile Glu Leu Val Gly

530 535 540

Lys Gly Arg Ser Thr Ala Thr Leu Glu Leu Val Gly Gly Gln Val Ala

545 550 555 560

Leu Leu Asp Ala Leu Val Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Val Val Val

565 570 575

Val Ala Ser Lys Pro Leu Val Leu Pro Pro Ser Ala His Ala Ala Ala

580 585 590

Ala Val Val Trp Ala Ala Asn Pro Gly Met Arg Gly Gly Gln Ala Val

595 600 605

Ala Glu Leu Val Leu Gly Leu Ile Glu Pro Glu Gly Arg Leu Pro Ile

610 615 620

Ser Phe Ala Arg His Ala Gly Glu Gln Pro Thr Tyr Tyr Asn Val Val

625 630 635 640

Arg Gly Gln His Gly Val Arg Tyr Ala Asp Leu Thr Gln Ser Pro Ala

645 650 655

Phe Ala Phe Gly Glu Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Val Glu Tyr Ala Asp

660 665 670

Leu Arg Val Leu Gly Thr Glu His Gly Pro Asp Asp Val Val Arg Ala

675 680 685

Glu Val Thr Leu Thr Asn Thr Gly Ser Arg Pro Val Arg Glu Thr Val

690 695 700

Gln Val Tyr Val Ser Asp Thr Val Thr Ser Val Thr Trp Ala Glu Lys

705 710 715 720

Glu Leu Lys Ala Tyr Arg Lys Val Asp Leu Ala Pro Gly Glu Ser Ala

725 730 735

Thr Val Gly Leu Glu Val Pro Val Ala Asp Cys Thr Leu Val Asp Ala

740 745 750

His Gly Arg Arg Val Val Glu Pro Gly Glu Phe Glu Leu Arg Val Gly

755 760 765

Pro Ser Ser Arg Glu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Ser Phe Thr Val Gly

770 775 780

Gly

785

<210> 5

<211> 743

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Ile Asp Pro Val Asp Leu Thr Leu Ala Glu Lys Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Phe Trp Ser Ser Lys Ala Val Arg Asp Ile Pro Pro

20 25 30

Val Tyr Phe Thr Asp Gly Pro His Gly Val Arg Lys Gln Gly Glu Val

35 40 45

Thr Asp His Leu Gly Val Ala Met Ser Thr Pro Ser Thr Cys Phe Pro

50 55 60

Pro Ala Ala Gly Leu Ser Gln Ser Trp Asn Pro Glu Leu Val Gln Arg

65 70 75 80

Ile Gly Lys Ala Leu Ala Gln Glu Ala Arg Ala Gln Gly Val Asp Val

85 90 95

Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Ile Lys Arg His Pro Leu Gly Gly Arg

100 105 110

Asn Phe Glu Tyr Leu Ser Glu Asp Pro Ile Leu Ser Ser Glu Leu Gly

115 120 125

Ile Ala Trp Val Arg Gly Leu Gln Gly Glu Gly Ile Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu Thr Asp Arg His Arg Ile Ser

145 150 155 160

Ala Asp Ile Asp Pro Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Arg Ser Phe

165 170 175

Gln Arg Val Ile Gln Gln Ala Lys Pro Trp Thr Val Met Cys Ala Tyr

180 185 190

Asn Ala Leu Asn Gly Val Pro Val Ser Glu Asn Ser Phe Leu Leu Thr

195 200 205

Gln Val Leu Arg Asp Glu Trp Lys Tyr Asn Gly Leu Val Ile Ser Asp

210 215 220

Trp Gly Ala Val Thr Asp Arg Val Ala Ser Ala Arg Ala Gly Val Asp

225 230 235 240

Leu Glu Met Pro Pro Ser Glu Gly Ser Asp Gln Leu Leu Leu Asp Ala

245 250 255

Ala His Glu Gly Ala Ile Asp Ile Ala Ile Val Asp Arg Ile Ala Glu

260 265 270

Arg Ala Ile Ala Leu Ala Thr Lys Thr Arg His Gly Arg Thr Thr Ala

275 280 285

Pro Ala Ala Asp Leu Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Arg Glu Ala Ala

290 295 300

Arg Gln Ser Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ala Leu Leu Pro Leu

305 310 315 320

Thr Pro Gly Val Ala Val Ala Val Ile Gly His Gly Ala Val Ala Pro

325 330 335

Arg Phe Gln Gly Ala Gly Ser Ser Phe Val Asn Pro Thr Glu Val Asp

340 345 350

Ile Pro Phe Glu Glu Leu Val Gly Ile Gly Gly Pro Ala Val Arg Phe

355 360 365

Thr Gln Gly His Ser Val Asn Gly Ala Gly Asp Asp Glu Ala Leu Arg

370 375 380

Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Asp Val Ala Val Val Phe

385 390 395 400

Leu Thr Ala Asp Ile Glu Ser Glu Gly Arg Asp Arg Glu Asp Leu Asp

405 410 415

Ile Pro Ala Asp Gln Met Ala Leu Ala Leu Ala Val His Glu Ala Asn

420 425 430

Pro Arg Thr Ile Ile Val Leu Ala Arg Gly Gly Val Val Arg Leu Gly

435 440 445

Glu Leu Gln Ala Cys Pro Ala Val Leu Asp Gly Ala Leu Leu Gly Gln

450 455 460

Gly Ile Gly Arg Ala Leu Ala Glu Val Ile Tyr Gly Ile Ala Asn Pro

465 470 475 480

Ser Gly Lys Leu Ser Glu Thr Ile Pro Ile Arg Ile Glu Asp Ala Pro

485 490 495

Ala Phe Gly Asn Phe Pro Gly Glu Asn Gly His Val Arg Tyr Gly Glu

500 505 510

Gly Leu Leu Val Gly Tyr Arg Gly Tyr Asp Ala Arg Lys Gln Glu Val

515 520 525

Ser Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Gln Tyr Thr

530 535 540

Asp Leu Glu Val Gln Cys Val Asp Gly Gly Leu Glu Ala Arg Val Thr

545 550 555 560

Ile Thr Asn Thr Gly Pro Arg Ala Gly Arg Glu Val Ala Gln Phe Tyr

565 570 575

Thr Ser Leu Gln Gln Ser Ala Val Asp Arg Pro Leu Arg Glu Leu Lys

580 585 590

Gly Phe Ala Ser Ile Glu Leu Glu Pro Gly Gln Ser Gly Glu Val Thr

595 600 605

Ala Phe Ile Ala Gln Ala Asp Leu Ala Tyr Trp Asp Ile Arg Val Asn

610 615 620

Glu Trp Ile Val Glu Gly Gly Thr Tyr Glu Val Ser Val Gly Ala Ser

625 630 635 640

Ser Arg Asp Ile Arg Gly Thr Thr Phe Val Asp Ile Ile Gly Asp Glu

645 650 655

Val Thr Val Glu Leu Asn Leu His Ser Thr Val Gly Glu Phe Leu Ala

660 665 670

Asn Pro Val Thr Ala Pro Ile Leu Leu Glu Ala Leu Ser Ala Leu Val

675 680 685

Gly Pro Gly Glu Gln Thr Ala Val Gly Gly Asp Val Leu Thr Met Ile

690 695 700

Ser Ala Ala Pro Leu Gln Ser Met Leu Thr Leu Leu Gly Asp Asn Phe

705 710 715 720

Asp Arg Ala Ala Leu Asp Ala Leu Leu Glu Ala Ala Asn Val Arg Thr

725 730 735

Pro Gln His Val Gly Gln Asn

740