阅读说明：本技术 寡核苷酸的混合物的分离分析方法 (Method for separating and analyzing mixture of oligonucleotides ) 是由 贵家润治 青木裕史 小木户谦 于 2018-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及通过液相色谱对寡核苷酸的混合物进行分离分析的方法,上述液相色谱使用了填充了在由交联有机高分子形成的多孔质粒子的表面固定二醇而成的填充剂的柱。根据该方法,与以硅胶作为基材的柱相比,能够以高灵敏度进行分离分析,并且可以将柱进行利用碱性溶液的洗涤。(The present invention relates to a method for separating and analyzing a mixture of oligonucleotides by liquid chromatography using a column packed with a filler in which a diol is immobilized on the surface of porous particles made of a crosslinked organic polymer. According to this method, separation and analysis can be performed with higher sensitivity than a column using silica gel as a base material, and the column can be washed with an alkaline solution.)

寡核苷酸的混合物的分离分析方法

技术领域

本发明涉及通过液相色谱对寡核苷酸的混合物进行分离并分析的方法。

背景技术

近年来，对合成寡核苷酸向医疗领域的应用的关心增加。可举出例如，核酶、适体、反义、和RNA干扰(RNAi)等，它们被称为核苷酸药品。

这样的寡核苷酸通常通过亚磷酰胺法合成。该方法中的生成物除了目标的寡核苷酸以外，还包含具有各种链长的寡核苷酸、起因于副反应的杂质。因此，关于合成寡核苷酸的分离、分析法，也进行了各种研究。

采用亲水性相互作用色谱(HILIC)的方法可以用包含低浓度的挥发性盐的洗脱液实施。因此，可以使用质谱仪作为检测器，能够进行高灵敏度的分析。此外，以寡核苷酸的分取为目的而实施了分离的情况，在寡核苷酸从洗脱液的分离中的脱盐等工序变得容易方面也是优异的。

在非专利文献1中记载了使用了シグマアルドリッチ社的Ascentis Silica柱的方法。该柱以直径3μm的多孔性未修饰二氧化硅基材(孔径12nm)作为填充剂。报导了使用甲酸铵缓冲液/乙腈混合溶液作为洗脱液，通过降低乙腈浓度的梯度法，将2聚体～10聚体的合成寡核苷酸高度分离。

此外，非专利文献2中记载了使用了東ソー社的Amide-80柱的方法。该柱具有含有酰胺基的结构与直径3μm的多孔性二氧化硅基材(孔径8nm)结合了的填充剂。报导了通过使洗脱液应用以甲酸铵水溶液/乙腈混合，降低乙腈浓度的梯度，从而将被硫代磷酸酯化了的15聚体～20聚体的合成寡核苷酸高度分离。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Journal of Chromatography A，1255(2012)237-243

非专利文献2：Journal of Chromatography B，1040(2017)282-288

发明内容

发明所要解决的课题

对于以往的将利用二氧化硅基材的填充剂填充而得的柱，由于二氧化硅基材溶解，因此不能进行碱性溶液的通液。因此，不能进行采用强碱特别是氢氧化钠水溶液进行洗涤，所述强碱对于因为蛋白质、寡核苷酸、副反应物等吸附而柱的分离性能降低时通过除去它们进行的性能恢复、连续使用时向溶出流分的残留的降低、柱和装置的杀菌等有效。

此外，如果考虑寡核苷酸向医疗领域等的进一步利用，则期望寡核苷酸的更优异的分离分析方法。

因此，本发明的课题是提供能够进行采用碱性溶液的洗涤，此外寡核苷酸的分离分析能够以高灵敏度进行的方法。

用于解决课题的方法

本发明提供以下的分离分析方法。

[1]一种方法，是通过使用了填充有下述填充剂的柱的液相色谱对寡核苷酸的混合物进行分离分析的方法，所述填充剂在由交联有机高分子形成的多孔质粒子的表面固定有二醇。

[2]根据上述1所述的方法，上述二醇的结构包含式(I)所示的结构。

R-O-CH₂-CH(OH)-CH₂(OH)(I)

(式中，R表示多孔质粒子的结构部分。)

[3]根据上述1或2所述的方法，交联有机高分子为交联聚乙烯醇。

[4]根据上述1～3中任一项所述的方法，液相色谱的流动相(洗脱液)为挥发性盐水溶液与水溶性有机溶剂的混合液。

[5]根据上述1～4中任一项所述的方法，通过紫外可见光检测器和/或质谱仪来检测通过柱而被分离并溶出的成分。

[6]根据上述1～5中任一项所述的方法，利用流动相的梯度溶出进行液相色谱。

[7]根据上述1～6中任一项所述的方法，在液相色谱的实施前或实施后，具有向柱通液pH10.0～pH13.0的碱性溶液来对柱进行洗涤的工序。

[8]根据上述1～7中任一项所述的方法，寡核苷酸为合成寡核苷酸。

发明的效果

根据本发明，与使用了利用二氧化硅基材的填充剂的柱的方法相比，能够进行高灵敏度的寡核苷酸的分离分析。

此外，由于柱的洗涤可以使用碱性溶液，因此能够简便地进行柱的洗涤和杀菌，进一步，药品目的的寡核苷酸的分取变得更容易。

附图说明

图1为实施例1中获得的紫外检测法(波长260nm)色谱图、和质谱分析法质谱图。

图2为比较例1中获得的紫外检测法(波长260nm)色谱图、和质谱分析法质谱图。

具体实施方式

本发明的一个实施方式中的寡核苷酸的混合物的分离分析方法为将寡核苷酸的混合物通过液相色谱进行分离并分析的方法，作为该液相色谱用柱的填充剂，使用在由交联有机高分子形成的多孔质粒子的表面固定二醇结构而成的填充剂。

所谓寡核苷酸的混合物，典型地为通过寡核苷酸的合成而获得的反应混合物。可举出例如，在固相载体上使核苷酸单体连续反应而合成的物质，通过亚磷酰胺法合成的核苷酸低聚物。合成寡核苷酸的目标的链长为10聚体～110聚体。在本发明涉及的方法中，作为试样，优选分离10～70聚体，进一步优选分离19～62聚体。

作为用作柱的填充剂的基材的交联有机高分子，优选为交联(甲基)丙烯酸系树脂、交联聚乙烯醇(PVA)等。在使用交联(甲基)丙烯酸系树脂的情况下，单体单元需要包含具有羟基或能够转变成羟基的官能团的单体单元。在即使在强碱性条件下也能够使用这方面，更优选为交联聚乙烯醇。

交联聚乙烯醇通过在使乙酸乙烯酯与异氰脲酸三烯丙酯等具有多个不饱和双键的交联性单体共聚后，皂化而获得。关于共聚物的单体组成的质量比，没有特别限制，为了通过之后的导入二醇基的反应处理而表现充分的亲水性，在全部单体中，优选使交联性单体的比率为90质量％以下，更优选为80质量％以下，进一步优选为70质量％以下。此外，为了确保在利用多孔质粒子作为液相色谱用填充剂的情况下的实用上的机械强度，在全部单体中，优选使交联性单体的比率为10质量％以上，更优选为20质量％以上，进一步优选为30质量％以上。如果机械强度不足，则有时通过因为在输送流动相时产生的压力而填充剂变形并将柱堵塞，从而超过装置能够使用的压力范围。

通过皂化而获得的交联聚乙烯醇的羟基的密度优选为1.2mmol/g～10.5mmol/g的范围，更优选为1.6mmol/g～9.3mmol/g的范围，进一步优选为2.0mmol/g～8.0mmol/g的范围。通过为该范围，可以在粒子表面充分附加用于导入二醇的缩水甘油，能够向填充剂赋予适当的亲水性。

羟基的密度可以由使与羟基反应的试剂反应后产生的、多孔质粒子的增加质量通过计算而求出。例如，可以优选使用实施例所示的方法等。

作为使上述交联性有机高分子作为多孔质的粒子而获得的方法，一般为下述悬浮聚合法：将单体、与单体相容的非聚合性的有机溶剂和聚合引发剂混合而获得的油相悬浮于水相而制成所希望的大小的油滴，接着进行加热搅拌从而获得粒子。除此以外，使用使油相通过以SPG(Shirasu多孔玻璃)膜为代表的多孔质膜、或形成于石英基板的微流路而将其滴加在水相中形成所希望大小的粒子的方法。所有粒子形成方法都是与油相混合的非聚合性的有机溶剂所占的体积形成细孔。这样操作而造粒的油相接着通过在水相中加热搅拌而使聚合反应进行，作为交联性聚合物而赋予强度。在聚合反应后，通过使用了有机溶剂的洗涤而除去非聚合性有机溶剂等，作为多孔质体而获得。

上述粒子优选为球状。

作为粒子的粒径，为了获得充分的分离性能和高灵敏度，作为体积平均粒径，优选为1～30μm。如果考虑不易导致过剩的压力上升方面，则作为体积平均粒径，进一步优选为3～10μm，特别优选为3～5μm。

体积平均粒径的测定可以用库尔特粒度仪或图像解析式粒度分布测定仪进行。为了获得所希望的粒径，也可以进行使用了筛的筛分级、使用了风力分级机的粒径控制。

作为形成多孔质的细孔的大小，为了兼有分离性能和机械强度，作为平均细孔径，优选为3～30nm，在获得充分的分离性能方面，进一步优选为10～25nm。如果细孔径过小，则比表面积变小，有时不能充分获得表现亲水性相互作用的能力。如果细孔径过大则不保持机械强度，有时因为柱内产生的压力而粒子溃坏。

平均细孔径的测定可以使用气体吸附式比表面积测定仪进行。

本发明的一个实施方式中的柱用填充剂具有在由上述交联有机高分子形成的多孔质粒子的表面固定二醇而成的结构。作为优选的二醇的结构，是1个个羟基与相邻的碳原子结合的结构。更优选为在粒子的表面具有式(I)所示的结构。

R-O-CH₂-CH(OH)-CH₂(OH)(I)

(式中，R表示多孔质粒子的结构部分。)

固定于粒子表面的二醇结构的量相对于多孔质粒子的质量优选为0.2mmol/g～8mmol/g，进一步优选为0.5～4mmol/g。

该结构可以通过使缩水甘油那样的具有羟基和环氧基的化合物与表面具有羟基的交联有机高分子所形成的多孔质粒子反应来制造。缩水甘油的反应在碱性条件下和在酸性条件下都可以实施。

作为液相色谱所使用的流动相(洗脱液)，适合使用挥发性盐水溶液与水溶性有机溶剂的混合液。作为挥发性盐，可举出甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵等。作为水溶性有机溶剂，优选为碳原子数1～3的醇化合物、腈化合物。优选的混合液为甲酸铵水溶液与乙腈的组合。

挥发性盐水溶液的浓度没有特别限制，优选为1～100mM，进一步优选为5～70mM，特别优选为20～50mM。挥发性盐水溶液的pH只要为寡核苷酸被溶出的范围，就没有限制，优选为5.0～9.0，进一步优选为6.5～7.5。

挥发性盐水溶液与水溶性有机溶剂的混合比率没有特别限制。混合比率使用混合前的体积表示。水溶性有机溶剂的比率可以提高至不发生盐的析出、寡核苷酸的溶解性的问题的程度。此外，水溶性有机溶剂的比率可以降低至亲水性相互作用充分起作用的程度。通常，水溶性有机溶剂的比率优选为30％～90％。

本发明的典型的分离分析方法如下所述。

将上述填充剂填充而得的柱安装于液相色谱，预先通液适当的洗脱液(流动相)将柱平衡化。接着，注入将作为试样的寡核苷酸的混合物溶解于该洗脱液而得的溶液进行液相色谱。

也可以采用使进行通液的洗脱液中的水溶性有机溶剂浓度逐渐减少的、所谓梯度溶出法。通过进行梯度溶出，能够使寡核苷酸的合成过程中包含的杂质与目标的寡核苷酸的分离更加容易。然后，使再次平衡化时通液的洗脱液流通，使柱平衡化。

测定时的柱温度优选为25～80℃，进一步优选为30～60℃，最优选为40～50℃。

作为液相色谱的装置，可以使用市售品。可举出例如，株式会社岛津制作所制Nexera(注册商标)、ウォーターズ社制Acquity(注册商标)等装置。

关于柱，只要是上述规定范围的柱，就可以使用市售品。可以使用例如，昭和电工株式会社制Shodex(注册商标)HILICpak(注册商标)VN-502D(内径2.0mm×长度150mm，粒径5μm)等。

液相色谱的检测可举出例如，紫外/可见光检测器(UV/Vis检测器)、利用质谱的质谱仪(MS)等。在紫外/可见光检测器的情况下，检测波长可举出例如，260nm。

紫外/可见光检测器主要可以使用于定量分析，质谱仪主要可以使用于定性分析，它们也可以组合使用。

本发明的一个实施方式中使用的填充剂具有在碱性条件下稳定这样的性质。因此，在通过液相色谱实施分离分析后，可以通过通液碱性溶液对柱进行洗涤。由此，可以将混入到柱并吸附于填充剂的蛋白质、寡核苷酸、副反应物等分解除去，或将柱内部杀菌，因此在以寡核苷酸的分取目的实施液相色谱的情况下是合适的。

碱性溶液的通液根据需要在液相色谱的实施前或实施后都可以进行。

使用了硅胶作为基材的填充剂由于硅胶会溶解，因此通常不能在pH值为8以上的条件下使用。因此不能使用碱性溶液。本发明的一个实施方式中使用的填充剂由于基材由交联有机高分子形成，因此可以使用与所使用的交联有机高分子的性质对应的pH的碱性溶液。特别是，以交联聚乙烯醇作为基材的填充剂由于通常不会因为所使用的碱性溶液而劣化，因此可以将碱性溶液用于柱洗涤等。

洗涤所使用的碱性溶液只要是显示pH值为10.0～13.0的碱性的溶液，就没有特别限定。如果考虑洗涤的效果、经济性，则0.01M～0.1M的氢氧化钠水溶液是适合的。

在使用了由交联有机高分子形成的多孔质粒子的表面固定了二醇结构的填充剂的情况下，与使用利用了硅胶的填充剂相比可获得高度分离的理由不清楚，但对于使用了硅胶的柱，认为是来源于硅烷醇的弱的离子相互作用同时起作用等的影响，这在利用亲水性之差的亲水性相互作用色谱中，考虑发生分离恶化的可能性。

实施例

以下举出实施例和比较例具体地说明本发明。

柱的制作

实施例中使用的柱如下那样制作。

(1)基材的制造

将由乙酸乙烯酯100g、异氰脲酸三烯丙酯150g、乙酸丁酯100g、正癸烷25g和2,2-偶氮二异丁腈5g构成的均匀混合液、与将聚乙烯醇(株式会社クラレ制PVA224)12g和磷酸氢二钠18g溶解于水1200mL而得的水溶液加入到具备回流冷却器的5L三口烧瓶中搅拌10分钟。接着，在氮气气流下搅拌，同时在60℃下进行16小时聚合，获得了粒状共聚物。将该共聚物过滤，用50℃的温水洗涤，利用丙酮洗涤后进行了干燥。接着将该共聚物与1M氢氧化钠水溶液3L一起加入到具备回流冷却器、氮气导入管和搅拌器的5L三口烧瓶中，在氮气气流下在15℃搅拌20小时进行该共聚物的皂化，进行过滤、水洗、干燥和风力分级处理，获得了由交联聚乙烯醇共聚物的多孔质粒子。通过皂化而获得的聚乙烯醇共聚物的羟基的密度为2.1mmol/g。通过图像解析式粒度分布测定装置(シスメックス株式会社制FPIA3000)进行了粒径测定，结果体积平均粒径为4.8μm。此外通过气体吸附式比表面积测定装置(日本ベル株式会社制BELSORP(注册商标)-mini)测定的平均细孔径为13nm。

另外，羟基密度的测定通过以下步骤进行。

将约2g的试样(聚乙烯醇共聚物)在60℃下真空干燥6小时，然后，利用精密天平准确地测定质量。向50mL锥形烧瓶中迅速投入所称量的试样总量、和乙酸酐17mL与吡啶33mL的混合液，接着在锥形***上部设置球形冷却管，进一步从冷却管上部静静地通入氮气而赶出烧瓶内的空气。一边直接用电磁搅拌器搅拌，一边用油浴在90℃加热16小时。在加热结束后，每次少量地加入甲醇共计15mL，用玻璃过滤器将试样过滤。进一步用甲醇90mL洗涤后，在60℃下真空干燥6小时。将干燥后的试样利用精密天平准确地进行质量测定，计算其与使乙酸酐反应前的质量差。对基材的羟基进行了酯加成的乙酸片段(CH₃CO-：分子量43)相当于质量增加，由此算出每单位试样质量的羟基密度(单位：mmol/g)。

(2)二醇的导入

将上述(1)中获得的多孔质粒子10g、缩水甘油10g、叔丁醇钾1g和二甘醇二甲基醚100mL加入到可拆式烧瓶中，在60℃下搅拌20小时，对多孔质粒子加成了缩水甘油。将所得的粒子用水、甲醇洗涤后，进行干燥，制成填充剂1。通过质量测定算出缩水甘油加成量，结果多孔质粒子的每单位质量为2mmol/g。

(3)向柱外壳的填充

使所得的填充剂1分散于水而制成浆料，使用输送泵对内径2.0mm、长度150mm的PEEK制的柱外壳(株式会社巴制作所制)利用15MPa的恒定压力进行10分钟送液加压填充，获得了柱。

实施例1

(1)柱的平衡化工序

装置的液相色谱/质谱仪使用了株式会社岛津制作所制作的、由系统控制器CBM-20A、脱气装置DGU-20A5R、输送单元LC-30AD(为了应对高压梯度而为2台)、自动取样器SIL-30AC、柱温箱CTO-20AC、光电二极管阵列检测器SPD-M20A、三重四极杆质谱仪LCMS-8030构成的液相色谱/质谱仪。柱温度设为40℃，作为洗脱液，将50mM甲酸铵水溶液/乙腈＝38/62(混合前的体积比)以0.2mL/分钟通液2mL以上，将柱平衡化。

(2)分析用样品的准备工序

将由ユーロフィンジェノミクス株式会社购入的合成寡核苷酸20聚体(商品名：スタンダードオリゴ50nmol规格品无盐级；序列号1(5’-ATACCGATTAAGCGAAGTTT-3’)所示的碱基序列)用上述洗脱液溶解，以合成寡核苷酸的浓度成为1mg/mL的方式调制出分析用样品。

(3)合成寡核苷酸的注入工序

将调制的分析用样品1μL注入到在(1)的工序中平衡化了的柱。

(4)合成寡核苷酸与不完全长的杂质的分离溶出工序

洗脱液为线性梯度、在开始的10分钟使乙腈比率减少至56％(混合前的体积％。以下同样)的梯度，直到接下来的20分钟为止将乙腈比率维持在56％，从而将合成寡核苷酸、杂质分离使其溶出。20.01分钟～25分钟恢复到62％，进行柱的平衡化，准备接下来的分析。

检测首先用光电二极管阵列检测器监测190nm～350nm。色谱图由260nm表示。进一步用在光电二极管阵列检测器的紧后面配置的质谱仪通过SIM(选择离子监测)法监测合成寡核苷酸、不完全长的杂质。

结果如图1所示那样，UV色谱图、质谱图都在保留时间18.5分钟观测到合成寡核苷酸的20聚体的峰，在这之前的2分钟～17分钟按分子量顺序观测到2聚体～19聚体的不完全长的杂质的峰。

对分析后的柱以0.2mL/分钟通液2mL的0.1N氢氧化钠水溶液，将柱进行洗涤。然后，进行柱的平衡化，再次，进行合成寡核苷酸的分析，结果柱压、分析结果没有变化。

比较例1

作为柱，使用了株式会社ワイエムシー制YMCpak Diol-120-NP(内径2.0mm×长度150mm，粒径5μm)，除此以外，与实施例1同样地操作而进行了合成核苷酸的分离。该柱的填充剂为使二醇与作为基材的硅胶结合了的填充剂。

结果如图2所示那样，UV色谱图、质谱图都在保留时间14分钟观测到合成寡核苷酸的峰。对于UV色谱图，在这之前的2分钟～13.5分钟按分子量顺序观测到2聚体～19聚体的不完全长的杂质的峰。如果与实施例1相比，5聚体～9聚体的峰形状差，11聚体～13聚体的分离差。对于质谱图，如果与实施例1相比，则在全部峰中信号/噪声比差，不能检测出15聚体～19聚体。

该柱为以硅胶作为基材的柱，因此不能进行利用碱水溶液的洗涤。