阅读说明：本技术 人类brca1/2基因突变的高通量检测试剂盒 (High-throughput detection kit for human BRCA1/2 gene mutation ) 是由 何曼文 魏汉敏 黎美燕 陈芳 蒋慧 于 2018-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了人类BRCA1/2基因突变的高通量检测试剂盒。所述试剂盒包括195个特异引物对和74个通用引物对；195个特异引物对的上游特异引物的核苷酸序列分别见表1中第2行至第196行,与之对应的下游特异引物的核苷酸序列依次见表1中第197行至第391行。74个通用引物对的上游通用引物的核苷酸序列具体见表2中第2行,下游通用引物的核苷酸序列分别见表2中第3行至第76行。本发明提供的试剂盒基于BGISEQ-500测序平台多重PCR检测BRCA1/2基因突变,其不仅检测性能优良,能提供全面的变异位点解析,而且检测时间大大缩短,检测成本大大降低。本发明具有重大的应用价值。(The invention discloses a high-throughput detection kit for human BRCA1/2 gene mutation. The kit comprises 195 specific primer pairs and 74 universal primer pairs; the nucleotide sequences of the upstream specific primers of the 195 specific primer pairs are shown in Table 1, respectively, at lines 2 to 196, and the nucleotide sequences of the corresponding downstream specific primers are shown in Table 1, sequentially, at lines 197 to 391. The nucleotide sequences of the upstream universal primers of the 74 universal primer pairs are shown in the 2 nd row in Table 2, and the nucleotide sequences of the downstream universal primers are shown in the 3 rd to 76 th rows in Table 2. The kit provided by the invention is used for detecting BRCA1/2 gene mutation based on BGISEQ-500 sequencing platform multiplex PCR, has excellent detection performance, can provide comprehensive analysis of mutation sites, greatly shortens the detection time and greatly reduces the detection cost. The invention has great application value.)

人类BRCA1/2基因突变的高通量检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人类BRCA1/2基因突变的高通量检测试剂盒，尤其涉及基于BGISEQ-500测序平台的人类BRCA1/2基因突变的高通量检测试剂盒。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。研究表明，遗传性乳腺癌占乳腺癌总体的5～10％。该类患者约90％发生BRCA1基因或BRCA2基因突变，而BRCA1基因突变或BRCA2基因突变的携带者患乳腺癌的危险为60％～85％，患卵巢癌的风险分别为39～44％和11～18％。另有研究证明，40％～50％的遗传性乳腺癌是由BRCA1基因突变引起的。NCCN指南强烈建议家族成员中存在BRCA1/2致病性突变或1位以上乳腺癌近亲的人群进行遗传性乳腺癌/卵巢癌检测。因此，开发针对性强、灵敏度高和兼备普适性的BRCA1/2检测试剂盒，实现乳腺癌/卵巢癌早期诊断筛查、预后监测以及个体化用药指导，是预防乳腺癌/卵巢癌发生或提高患者生存率和生存质量的关键，其建设迫在眉睫、意义重大。

BRCA1基因和BRCA2基因是抑癌基因。BRCA1基因或BRCA2基因在DNA损伤修复、同源重组和转录调控中的功能尤为显著和重要。其突变可分布在全部外显子任意区域，通常为移码突变或无义突变，造成截短体蛋白的产生。BRCA1和BRCA2的基因突变具有很高的外显率。根据《BRCA数据解读中国专家共识》，将编码提前终止密码子的序列变异，即BRCA1第1855位氨基酸和BRCA2第3309位氨基酸前发生的无义突变或移码突变定义为高风险致病突变(致病可能性>0.99)。

预计2020年全球NGS市场总额为100亿美元，肿瘤检测占比60％(即60亿美元)，其中含乳腺癌基因检测3亿美元。目前国内液体活检公司上百家，而开发BRCA1/2检测试剂盒的公司较少。同类产品的市场报价在国内参次不齐(几百至几千)，而国外产品报价更高，如ThermoFisher的立菲达安肿瘤易感基因BRCA1/2乳腺癌风险评估检测，报价为31680元。因此，自主开发一款成本较低的BRCA1/2检测试剂盒，同时搭配测序平台，对于抢占市场很有帮助。

目前国内开发乳腺癌/卵巢癌BRCA1/2检测试剂盒的公司较少，大多数是基于客户提供样本进行探针杂交捕获+二代测序(NGS)检测服务，实现BRCA1/2全外显子区捕获和高通量测序的要求。这种检测方法的缺点是订购探针成本高及探针可能捕获效率低。其它BRCA基因突变的检测方法主要包括PCR+Sanger测序、荧光定量PCR和多重PCR+NGS法。Sanger测序法准确度高但通量低；荧光定量PCR法一般针对若干个已知的基因突变信息进行检测，而且检测灵敏度低；基于多重PCR+NGS法开发的BRCA1/2检测试剂盒的公司已有几家，通过多重PCR的靶向测序文库制备，可以缩短检测时间及降低成本，但存在均一性差、某些基因位点难以扩增的问题。

发明内容

本发明的目的是检测人类BRCA1/2基因突变。

本发明首先提供了一种检测人类BRCA1/2基因突变的试剂盒，可包括若干个特异引物对和至少一个通用引物对；

每个特异引物对可由上游特异引物和下游特异引物组成；

所述上游特异引物从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段甲、Ad153接头序列1(即实施例中的Ω环1)和DNA片段乙；DNA片段甲和DNA片段乙分别与BRCA1基因或BRCA2基因上的两个区段相同且两个区段在BRCA1基因或BRCA2基因上的距离可为12-15个核苷酸；

所述下游特异引物从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段丙、Ad153接头序列2(即实施例中的Ω环2)和DNA片段丁；DNA片段丙和DNA片段丁分别与BRCA1基因或BRCA2基因上的两个区段相同且两个区段在BRCA1基因或BRCA2基因上的距离可为12-15个核苷酸；

Ad153接头序列1和Ad153接头序列2均不能与BRCA1基因或BRCA2基因结合；

每个特异引物对的上游特异引物和下游特异引物的核苷酸序列不同，可结合至BRCA1基因或BRCA2基因的不同位置；每个特异引物对检测的靶区域长度可为81-146bp；所有特异引物对的靶区域拼接后可以覆盖BRCA1基因和BRCA2基因的编码区；

每个通用引物对可由上游通用引物和下游通用引物组成；

所述上游通用引物可包括d153接头序列3；

所述下游通用引物从5’末端到3’末端可包括测序接头序列和DNA片段3；

所述d153接头序列3与Ad153接头序列1的核苷酸序列部分相同；所述DNA片段3与Ad153接头序列2的核苷酸序列部分相同。

所述DNA片段甲可为25-30个核苷酸组成的单链DNA分子。

所述Ad153接头序列1可为28-32个核苷酸组成的单链DNA分子。

所述DNA片段乙可为12-15个核苷酸组成的单链DNA分子。

所述DNA片段丙可为25-30个核苷酸组成的单链DNA分子。

所述Ad153接头序列2可为28-32个核苷酸组成的单链DNA分子。

所述DNA片段丁可为12-15个核苷酸组成的单链DNA分子。

所述Ad153接头序列1和Ad153接头序列2的核苷酸序列可以不同，也可以相同。

所述上游通用引物的5’末端可进行磷酸化修饰。

所述下游通用引物还可包括特异区段；所述特异区段的用途为在下游通用引物进行PCR扩增时，滑动识别模板；所述特异区段可位于所述测序接头序列的下游、所述DNA片段3的上游。

所述下游通用引物还可包括Barcode标记序列；所述Barcode标记序列位于所述测序接头序列的下游、所述DNA片段3或所述特异区段的上游。

所述下游通用引物中的测序接头序列是为了便于进行测序添加的。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。在本发明的实施例中，采用BGISEQ-500测序平台进行测序。相应的，测序接头序列的核苷酸序列(从5’至3’)为AGCCAAGGAGTTG。

上述任一所述上游通用引物具体可为5’末端磷酸化的d153接头序列3。

上述任一所述下游通用引物从5’末端到3’末端依次可由所述测序接头序列、所述Barcode标记序列、所述特异区段和所述DNA片段3组成。

上述任一所述Ad153接头序列1的核苷酸序列(从5’至3’)可为GCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT。

上述任一所述Ad153接头序列2的核苷酸序列(从5’至3’)可为GTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT。

上述任一所述测序接头序列的核苷酸序列(从5’至3’)可为AGCCAAGGAGTTG。

上述任一所述特异区段的核苷酸序列(从5’至3’)可为TT。

上述任一所述Barcode标记序列的核苷酸序列(从5’至3’)可为a1)-a74)中的任一种：a1)CGGATTGCCG；a2)CATCACTCAC；a3)CAGCTGACTC；a4)TTCGCAGACA；a5)TTGTACCAAT；a6)ACCACAATCG；a7)GGAAGTCTGT；a8)AGAGTGTGGA；a9)GCTTGTGGTG；a10)TTGTCCTCTA；a11)ATTCGCTAGG；a12)CGATGACTAC；a13)ACAGCTCAGC；a14)TATCTAGGTT；a15)GAGATGGCAA；a16)CGCAAGATCT；a17)GCCGATAGCG；a18)CCATCGTTGC；a19)TGAACGATTA；a20)TAGAGCGAAC；a21)ATGTGTGAGA；a22)ATCCTAACAG；a23)CGCGTCTGCG；a24)GATGATCCTT；a25)GCTCAACGCT；a26)ATGCATCTAA；a27)AGCTCTGGAC；a28)CTATCACGTG；a29)GGACTAGTGG；a30)GCCAAGTCCA；a31)CCTGTCAAGC；a32)TAGAGGTCTT；a33)TATGGCAACT；a34)CTGCGTACAT；a35)ATCTCATTAA；a36)AAGTGGCGCA；a37)GGCCTTAATG；a38)TCTGAGGCGG；a39)CGAGCCGATT；a40)GATAACCGGC；a41)TCAATATTCC；a42)TCCGTTGAAT；a43)CAGTACAGTT；a44)ATTGAGGTAC；a45)ATTAGAAGTC；a46)CAACGCTTCA；a47)GGATCGCACG；a48)TGCCTTCCGA；a49)GCGACATCGG；a50)CATTCTAAGT；a51)CAGGCTTGGA；a52)ATCATCGTCT；a53)GTCTTGTGAG；a54)AGTAGGAACG；a55)TCACAACCAC；a56)GCAGGCCTTC；a57)TGGCAAGCTA；a58)GAGCATTGTC；a59)TGTGATTAGC；a60)CCTATGGACT；a61)TAGGCGATAG；a62)AGACCACGAT；a63)GTATTAGCCA；a64)CTCTGCACTG；a65)ACCAGCCTGA；a66)GCGTGAGTAT；a67)CGCGGAGCAT；a68)CAAGTTCACA；a69)AGCACCTCTC；a70)TTACAGTGCA；a71)TTGCCTAGGC；a72)GCTATGATGG；a73)AATTACCATG；a74)AGACATGGTG。

上述任一所述d153接头序列3(即实施例中的DNA片段1)的核苷酸序列(从5’至3’)可为CACAGAACGACATGGCTACGA。

上述任一所述DNA片段3的核苷酸序列(从5’至3’)可为GTCTTCCTAAGACCGCTTGG。

上述任一所述上游特异引物从5’末端到3’末端依次可由所述DNA片段甲、所述Ad153接头序列1和所述DNA片段乙组成。

上述任一所述下游特异引物从5’末端到3’末端依次可由所述DNA片段丙、所述Ad153接头序列2和所述DNA片段丁组成。

上述任一所述试剂盒可包括195个特异引物对和74个通用引物对。

所述195个特异引物对的上游特异引物的核苷酸序列(从5’至3’)依次可为b1)-b195)：

b1)ACATGTCTTTTCTTCCCTAGTATGTAAGGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCATAGGAGATAATC；

b2)AAACAAAAGCTAATAATGGAGCCACATAACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGCAAAATATGTGGT；

b3)TTTCGTTCTCACTTAATTGAAGAAAGTAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGTGTTTCCTGGGTT；

b4)AATTATATACCTTTTGGTTATATCATTCTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGAAGGCCCTTTCTT；

b5)ATGGTTTTATAGGAACGCTATGTTATTAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTACTGTGGTTGCT；

b6)CATAGAAAGTAATTGTGCAAACTTCCTGAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTTGAGTGTCATTCT；

b7)AGGAAGGATTTTCGGGTTCACTCTGTAGAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTCTGTAGCCCATAC；

b8)AAGGGGGCTAAGGCAGGAGGACTGCTTCTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAAGACTCCATCTCA；

b9)TCCAGCAATTATTATTAAATACTTAAAAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAATTCAATGTAGAC；

b10)TTTTTTATAACTCACCATAGGGCTCATAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTGCCTACCACAAAT；

b11)ACATCAATCCTTAATATTAACTAAATAGGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGACAAAGGTTCTCT；

b12)AGAATAATCTAATTACAGTACTGTATCTACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGCCTGTTAAGTTGG；

b13)AACTACCCTGATACTTTTCTGGATGCCTCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGTGGTGTTCAAAT；

b14)TGTCTTTAGTGAGTAATAAACTGCTGTTCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGGCATGAGTATTTG；

b15)TACATGTTTCCTTACTTCCAGCCCATCTGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTAAGCCAGGCTGTT；

b16)CACAGGGGATCAGCATTCAGATCTACCTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTCCGCCTATCATTA；

b17)AATGCTGCTATTTAGTGTTATCCAAGGAACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGGATTCTCTGAGCA；

b18)AATACATCAGCTACTTTGGCATTTGATTCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAGTCATCAGAACCT；

b19)ATTTGGAGTGAACTCTTTCACTTTTACATAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGATCACTGGCCAGTA；

b20)CTATAATTAGATTTTCAGTTACATGGCTTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTTCTTCCGATAGG；

b21)ACGCTTTAATTTATTTGTGAGGGGACGCTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTCAGTAACAAATGC；

b22)CTGCTCCGTTTGGTTAGTTCCCTGATTTATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTGAACTGCCAAATC；

b23)TGGGTTAGGATTTTTCTCATTCTGAATAGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATTCTCATGACCACT；

b24)TTTTTAGGTGCTTTTGAATTGTGGATATTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTGCTTATACTGCTG；

b25)CAACTATCAATTTGCAATTCAGTACAATTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTACTGACTACTAGT；

b26)TCTTTACCTTCCATGAGTTGTAGGTTTCTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATTTGGTTGTACTTT；

b27)TGGGAAAGTATCGCTGTCATGTCTTTTACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTTGTTACTCTTCTT；

b28)CTTTAAGTTCACTGGTATTTGAACACTTAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCATTTGTTAACTTCA；

b29)AACCCTTTCTCCACTTAACATGAGATCTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATTAGACACTTTAAC；

b30)TTCCCTAGAGTGCTAACTTCCAGTAACGAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCATAATCAGTACCA；

b31)TTCTATTATCTTTGGAACAACCATGAATTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAAATGCTGCACACT；

b32)AAATACTGAGCATCAAGTTCACTTTCTTCCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCCCGACTGTGGTTA；

b33)CTTTAAGGACCCAGAGTGGGCAGAGAATGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGCATTTCCTGGATT；

b34)AGGAAAGCCTGCAGTGATATTAACTGTCTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGACTCATTCTTTCC；

b35)ATGAGTCCAGTTTCGTTGCCTCTGAACTGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTAGAGCCTCCTTTG；

b36)CCTCAAAGTTTTCCTCTAGCAGATTTTTCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAAATGACTTGATGG；

b37)TTTAAAAACATTTTCTCTAATGTTATTACGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGTACTTGGAATGTT；

b38)TATTTCATTAATACTGGAGCCCACTTCATTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTCATTAATATTGCT；

b39)GACCTCAGGTTGCAAAACCCCTAATCTAAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGGCCCTCTGTTTCT；

b40)AAATCAGATATGGAGAGAAATCTGTATTAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTTCATATTCTTGCT；

b41)CAAAACTAGTATCTTCCTTTATTTCACCATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGGTGTCTCAGAAC；

b42)GAAAGGGCTAGGACTCCTGCTAAGCTCTCCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCTAAAAACAGCAGA；

b43)AGCAGGGAAGCTCTTCATCCTCACTAGATAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACTCTAATTTCTTGG；

b44)CTCCTCTGTGTTCTTAGACAGACACTCGGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTAGTAGACTGAGA；

b45)TGATGTTCCTGAGATGCCTTTGCCAATATTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCATTTAAGCTATTC；

b46)AGAACCAATCAAGAAAGGATCCTGGGTGTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTCTTCCAATTCACT；

b47)TTTTCTTCCAAGCCCGTTCCTCTTTCTTCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCCTTGTCACTCAGA；

b48)AAAGCATAAACATTTAGCTCACTTCTATAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCACAAAAACCTGGTT；

b49)CTGAATGCAAAGGACACCACACACACGCATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCGCTTTTTACCTGAG；

b50)TTTAAGGAGACAATGAACCACAAACAATTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAGATGATGTCAGCA；

b51)TGGATTTCGCAGGTCCTCAAGGGCAGAAGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGGGTAGCTGTTAGA；

b52)TAGGTCCTTACTCTTCAGAAGGAGATAAAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTGCTTAAGATATCA；

b53)AGAGGGAAGGCTCAGATACAAACACAGCTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCCTTTTGGCCAGAA；

b54)CTTACCTTTCCACTCCTGGTTCTTTATTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTGCAGACACCTCAA；

b55)TGAAAAAAATTAACAATCAGAGTTCAATATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATACCACAGCATCTT；

b56)ATGTTTCCGTCAAATCGTGTGGCCCAGACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTCCACATCAACAA；

b57)AACCAGAATATCTTTATGTAGGATTCAGAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGTTCCAATACAGCA；

b58)GGTTGAAGATGGTATGTTGCCAACACGAGCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTCTTCAGAAGGATC；

b59)TACCCAGCAGTATCAGTAGTATGAGCAGCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGATTCTGCAACTTTC；

b60)ATTCTTCTGGGGTCAGGCCAGACACCACCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGACCCTTTCTGTTG；

b61)CAGAACTGTGATTGTTTTCTAGATTTCTTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGACAATACCTACAT；

b62)AGGCATGCGCCACCGTGCCTCGCCTCATGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATGCAAGGTATTCTG；

b63)AAGGGAGGAGGGGAGAAATAGTATTATACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTACCCATTTTCCTC；

b64)ATAAAAGTAGTTTAGTATTACAATTAAAGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGACTCAGCATCAGCA；

b65)TCATGGAAAATTTGTGCATTGTTAAGGAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGGAAGCAAATACA；

b66)GGGAGTGGAATACAGAGTGGTGGGGTGAGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGGAGGGAGCTTTAC；

b67)CTTATTTATGTGGTTGGGATGGAAGAGTGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAAAGTATCTAGCAC；

b68)TCTCCCAGGCTCTTACCTGTGGGCATGTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAACAGATTTCTAGC；

b69)AGAATAGCCTCTAGAACATTTCAGCAATCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGGGATCTTGCTTAT；

b70)TAGGGACTGACAGGTGCCAGTCTTGCTCACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTCCTCCCTCTCTGA；

b71)AAGAACTGTGCTACTCAAGCACCAGGTAATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCCATGCAAAAGGAC；

b72)TCTGGGGTATCAGGTAGGTGTCCAGCTCCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTACACTGTCCAACA；

b73)CAGGGCCTGGAAAGGCCACTTTGTAAGCTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGGCTCTGTACCTGT；

b74)TGGGACTGAATTAGAATTCAAACAAATTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTTACCTCAGTCACA；

b75)GACTTATTTACCAAGCATTGGAGGAATATCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTATTGGATCCAAAGA；

b76)TCCATAGTCAAGATCTTAAGCATTTTTTTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGTTCTGGGTCACAA；

b77)TTTTAAATAGATTTAGGACCAATAAGTCTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTTTCTTCAGAAGCT；

b78)TACGAACCAAACCTATTTAAAACTCCACAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAATCAGCTGGCTTCA；

b79)GGGGGTAATCAGCAAACTGAAAAACCTCTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACATTCTCATTCCCA；

b80)CAAATTTATAATCCAGAGTATATACATTCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTGTTTCAGGAAGGA；

b81)AGACATAAAAGTCTTCGCACAGTGAAAACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGATGATGTTTCCTGT；

b82)GATAAACTAGTTTTTGCCAGTTTTTTAAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCTTTGTTTTATTTT；

b83)GATTTGCTTTGTTTTATTTTAGTCCTGTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATGTAACACCACAAA；

b84)GTTATACCTTTGCCCTGAGATTTACAAATCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCCTCATACAGGCAA；

b85)GCATTTCTATAAAAAATAAACTATTTTCTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGACACCAAAACAT；

b86)AAGTACTTGAATCAATTCATTTTGTTTCAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAATAGTAGATGTGC；

b87)ACAATACACATAAATTTTTATCTTACAGTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCTGAAACTGTATTT；

b88)TTTTTGGACCTAGGTTGATTGCAGATAACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAAACCATGGATAAG；

b89)CTATAATTTTTGCAGAATGTGAAAAGCTATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAAAGTCTGAAGAAA；

b90)AAAGGTTGTGAGAATAATATAAATTATATGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATGTGCTTCTGTTTT；

b91)ACATCAGGGAATTCATTTAAAGTAAATAGCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGAAAGTCAATGCCA；

b92)TTCATTATGTTTTTCTAAATGTAGAACAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGAACTAGCAAGAC；

b93)AAGTAAGAACTAGCAAGACTAGGAAAAAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACGCTGATGAATGTG；

b94)TCCATTAGATTCAAATGTAGCAAATCAGAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGTGACAAAATCTC；

b95)AGGTCTAAATGGAGCCCAGATGGAGAAAATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTCTTCATGTGACCA；

b96)GAACAAAAGAAAGAAAGATTTTCTTACTTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACGTATTTCTAGCCT；

b97)AAATCAGAGAAGCCATTAAATGAGGAAACAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGATGAAGAGCAGCAT；

b98)TGCATTCTTGCAGTAAAGCAGGCAATATCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCTTCTTCATTTCAG；

b99)GTTTTTCAGGTCATATGACTGATCCAAACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGCCTCTGAAAGTG；

b100)CTTATGTCCAAATTTAATTGATAATGGAAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCACACAGAATTCTGT；

b101)CTATACATGATGAAACATCTTATAAAGGAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACCAAAAATCAGAAC；

b102)TCAGCCTCCCAAAAGTGCTGAGATTACAGGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCAAACACTACCTTT；

b103)CTTTAATTTTGTCACTTTGTGTTTTTATGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCTTCTGTGAAAAGA；

b104)AACCAACTTTGTCCTTAACTAGCTCTTTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAATGTTCTAGAAATG；

b105)GCAAAATGTAATAAGGAAAAACTACAGTTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCTGATTCTCTGTCA；

b106)CAAAAAAGTTTCAGATATAAAAGAAGAGGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCACCCAGTACAACA；

b107)GATACTGACTTTCAATCCCAGAAAAGTCTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAATGCCAGCACTCTT；

b108)ATTTCTAGAGGCAAAGAATCATACAAAATGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGTAACAATTATGAA；

b109)AAAGAATCAAGATGTATGTGCTTTAAATGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGAGCTGTTGCCACC；

b110)AAAAAATCAAGAAGAAACTACTTCAATTTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCCAGACTCTGAAGA；

b111)AGTAGCTAATGAAAGGAATAATCTTGCTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACTTCATGAAACAGA；

b112)ATTTTCAAGAACTCTACCATGGTTTTATATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAACAAGCAACCCAA；

b113)AATTAAAAAAGATTTGGTTTATGTTCTTGCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTAGTGTAAAGCAGCA；

b114)ATAGATAAAATACCAGAAAAAAATAATGATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCAGGACTCTTAGGT；

b115)CTTCAGAACAGCTTCAAATAAGGAAATCAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCATTAAGAAGAGCAA；

b116)ACAATATCCTACTAGTTTAGCTTGTGTTGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGCATTAGATAATCA；

b117)GTTGTTTCTGATTGTAAAAATAGTCATATAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTTTCCAAGCAGGAT；

b118)AGAAGAATCAGGAAGTCAGTTTGAATTTACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGCTACATATTGCA；

b119)AATGCAGAGATGCTGATCTTCATGTCATAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTGGTCAGGTAGACA；

b120)GTTGAAAAATGACTGTAACAAAAGTGCTTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGAAAATGAAGTGGG；

b121)AAAAGCTGTGAAACTGTTTAGTGATATTGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAACTTCTGCAGAGGT；

b122)ACTGTAAGTGAAAAAAATAATAAATGCCAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAATATTGAAATGACT；

b123)TACAAGAGAAATACTGAAAATGAAGATAACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGTAGAAATTCTCAT；

b124)TGGCAGTGATTCAAGTAAAAATGATACTGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGAAACGGACTTGCT；

b125)TGTCTTAAATTATCTGGCCAGTTTATGAAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATTAAAGAAGATTTG；

b126)TGTCAGATTTAACTTTTTTGGAAGTTGCGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTCATGGTAATACTT；

b127)AAAAGATTTTGAGACTTCTGATACATTTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAAAAATATTAGTGT；

b128)ATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGATCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCATAACTTTTCCTT；

b129)ACATAGTTAAACACAAAATACTGAAAGAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTGGAAATCAACTAG；

b130)GGGTTTTCATACAGCTAGCGGGAAAAAAGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATCTTTGGACAAAGT；

b131)AGGTACTAGTGAAATCACCAGTTTTAGCCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTAAAGTACAGAGA；

b132)GTGTAAAGAAATGCAGAATTCTCTCAATAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTCTATTGAGACTGT；

b133)TATCTTTTTGAAAGTTAAAGTACATGAAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGCAAAAAGTCCTGC；

b134)AGCCTTAGCTTTTTACACAAGTTGTAGTAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCAGACTTCATTACT；

b135)AAAAATGGCTTAGAGAAGGAATATTTGATGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTAAATACTGCAGATT；

b136)TCCGAAAAACAAGATACTTATTTAAGTAACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGCTATTCCTACCAT；

b137)TGATTCAGGATATCTCTCAAAAAATAAACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCCAGTATTGAAGAA；

b138)ATATCCAATGTAAAAGATGCAAATGCATACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAAGATATTTGCGTT；

b139)TAAATTGTCCATATCTAATAGTAATAATTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGCATTTAGGATAGC；

b140)ACAGTTTCAGTAAAGTAATTAAGGAAAACAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAATTTGCCAAACGA；

b141)CAAACGAAAATTATGGCAGGTTGTTACGAGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAGGATATTCTTCAT；

b142)ACATAACCAAAATATGTCTGGATTGGAGAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACCTTGTGATGTTAG；

b143)ATGTAAATGTAGTATAGGGAAGCTTCATAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAATACTTGTGGGAT；

b144)AGATGCTTCATTACAAAACGCAAGACAAGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGATAGTACCAAGCA；

b145)ATACTGCTATACGTACTCCAGAACATTTAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTTCATATAATGTGG；

b146)AGTGGAAAGCAAGTTTCCATTTTAGAAAGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGGGAGTGTTAGAG；

b147)ATTCACCTACGTCTAGACAAAATGTATCAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTGATAAGAGAAACC；

b148)AAAAACCTGCAGTAAAGAATTTAAATTATCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGAAGGTGGTTCTTC；

b149)AACCAAAGTGTCACTTGTTGAGAACATTCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACAGGCTTCACCTAA；

b150)TATAGAAGTTTGTTCTACTTACTCCAAAGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGAAACAGAAGCAGT；

b151)GACTTTTGAGAAATAAAACTGATATTATTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATGAAATATTTCTTT；

b152)ACAGTAACATGGATATTCTCTTAGATTTTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAAATAATTGTTTCC；

b153)TTTGGAATGGCAACCATGGTGAATACAAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTATCACCATGTAGCA；

b154)TTATATGTGTACTAGTCAATAAACTTATATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGCACAACTAAGGA；

b155)CAAGAGATACAGAATCCAAATTTTACCGCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTGTCTAAATCTCAT；

b156)TTGGAAAAATCTTCAAGCAATTTAGCAGTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTATCAAGTTTCTGCT；

b157)TTTGTTCCACCTTTTAAAACTAAATCACATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGTGTGTTAGGAAT；

b158)TAAAAATAAGATTAATGACAATGAGATTCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAACTCCAATCAAGC；

b159)GCCAGGGGTTGTGCTTTTTAAATTTCAATTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATTTATTCTTTGATA；

b160)AATTAAGAAGAAACAAAGGCAACGCGTCTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCTGTATCTTGCAAA；

b161)TGTGTGATACATGTTTACTTTAAATTGTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTTTATTTTGTGTAG；

b162)TCTTTTCAGTTTCACACTGAAGATTATTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGGACTGGAAAAGGA；

b163)AATGTAGTTTTTGTACAGAGAATAGTTGTAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATCATCCTATGTGGT；

b164)TTATTTGTTCAGGGCTCTGTGTGACACTCCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGCTTATTTCTAGAAT；

b165)GGGTTTATAATCACTATAGATGGATCATATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGGAATGTGCCTTTC；

b166)TTTTATTCTCAGTTATTCAGTGACTTGTTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGAGTCACACTTCCT；

b167)AAATTGATAGAAGCAGAAGATCGGCTATAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGGATGACACAGCTG；

b168)TTCATTGAGCGCAAATATATCTGAAACTTCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTAGTGCAGATACCCA；

b169)GGGTGGTATGCTGTTAAGGCCCAGTTAGATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTCTTAAAGAATGGC；

b170)TTTACTGTCTTACTAATCTTCCTAAGACTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTTAAGGCAGTTCTA；

b171)ATTTATTAATTTGTCCAGATTTCTGCTAACGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCGCTGGTATACCAAA；

b172)GCCTCCCAAAGTTCTGGGATTACAGATGTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTGATACAATTAAC；

b173)TTTTGGTGTGTGTAACACATTATTACAGTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATCTGGATTATACAT；

b174)AGCAGTTATATAGTTTCTTATCTTTAAATCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTTTATGCTTGGTTC；

b175)TTTTCTTAGAAAACACAACAAAACCATATTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTAACAAGACAGCAAG；

b176)GCACCTGAGAATATTATGTGAGAAACTGATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCTTAAGATGAGCTCT；

b177)TTTTGTTCTGATTGCTTTTTATTCCAATATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGTTATTTCAGTGAA；

b178)GAGCAGTTAAGAGCCTTGAATAATCACAGGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGAAACAAGCTCAG；

b179)ACAAAAGGAACAAGGTTTATCAAGGGATGTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGTTGCGTATTGTAAG；

b180)TGTATTTATTTTGAAACAAACATTTAAATGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATTGCATCTTTCTCA；

b181)AGTATTTGGCGTCCATCATCAGATTTATATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGGAAAGAGATACAGA；

b182)CAAACCTTTCATTGTAATTTTTCAGTTTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTTTATGGAATCTCCA；

b183)TTTACCAGCCACGGGAGCCCCTTCACTTCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGACTTTCAGCCAT；

b184)GCATATACCAAAATAAATAGGCATATTAGAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCTTAAAATTCATCT；

b185)TCCATTCTAGGACTTGCCCCTTTCGTCTATGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTACAATTTACTGGCA；

b186)TCATATGTTAATTGCTGCAAGCAACCTCCAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAAATCAGGCCTTCT；

b187)AACTTTTCATTTCTGCTTTTAAAGGAAATAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTATATGTGGGTTTGCA；

b188)CATACTTTGCAATGAAGCAGAAAACAAGCTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGCAAATGATCCCAA；

b189)GAACTGAAATCACCTAACCTATTAGGAGTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTGTGTAATATTTGCG；

b190)ACATAATTATGATAGGCTACGTTTTCATTTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCTCCTAATTGTGAG；

b191)TGAGATATATTATCAAAGTCCTTTATCACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAAGTCTGTTTCCAC；

b192)GGGAGAAAGAGATTGATGACCAAAAGAACTGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCCTTGGATTTCTTGA；

b193)TACATTTGTTTCTCCGGCTGCACAGAAGGCGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTGAGTTGTGGCACCAA；

b194)AAAAATTCAATGAAATTTCTCTTTTGGAAAGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTACGAAGAACTTGCAT；

b195)CAATTTATATCTGTCAGTGAATCCACTAGGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCAGAAGATTATCTC。

与b1)-b195)所示上游特异引物对应的下游特异引物的核苷酸序列(从5’至3’)依次可为b196)-b390)：

b196)AAATGAAGTTGTCATTTTATAAACCTTTTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATGTTTTTCTAATGT；

b197)CAGACATTTAATAAATATTGAACGAACTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTCAGTCATAACAGCT；

b198)GAGCCTCATTTATTTTCTTTTTCTCCCCCCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGAGTTGATCAAGGA；

b199)TTTTTAAATGGCTCTTAAGGGCAGTTGTGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTATTTGCCTTTTG；

b200)TACAAAAGGAAGTAAATTAAATTGTTCTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATAGATTTTGCATGC；

b201)TATTTGTTTACATGTCTTTTCTTATTTTAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGATAATCACTTGCTG；

b202)TAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTAACTGCAAACATA；

b203)GTATTTTACAGATGCAAACAGCTATAATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTAACTCTCCTGAACA；

b204)GACTGATGATGGTCAATTTATTTTGTCCATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCAGGAGGAAAAGC；

b205)TAGCAGGAAACCAGTCTCAGTGTCCAACTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTGAGAACTCTGAGG；

b206)AACTAGCATTGTACCTGCCACAGTAGATGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGTTGAATATCTGTT；

b207)TTCTGTAATCGAAAGAGCTAAAATGTTTGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGTTCTGCATACATG；

b208)AGTTTATGAGGTTAGTTTCTCTAATATAGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCACCTCCAAGGTGTA；

b209)TTGTTATTTTTGTATATTTTCAGCTGCTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGATGTAACAAATAC；

b210)CTGAGAAGCGTGCAGCTGAGAGGCATCCAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTCTGTTTCAAACT；

b211)ACTCATGCCAGCTCATTACAGCATGAGAACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACTAAAGACAGAATG；

b212)GCTGAATTCTGTAATAAAAGCAAACAGCCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAACATAACAGATGG；

b213)CGGACTCCCAGCACAGAAAAAAAGGTAGATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGTGTGAGAGAAAA；

b214)GAGATACTGAAGATGTTCCTTGGATAACACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGAAAGTTAATGAGT；

b215)CAAAGTAGCTGATGTATTGGACGTTCTAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCTGGTTCTTCAGA；

b216)TTACTGGCCAGTGATCCTCATGAGGCTTTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGAGTTCACTCCAAA；

b217)GAAGACAAAATATTTGGGAAAACCTATCGGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCCAACTTAAGCCAT；

b218)AGCGTCCCCTCACAAATAAATTAAAGCGTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAGGCCTTCATCCTG；

b219)AGTTCAAAAGACTCCTGAAATGATAAATCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGAGCAGAATGGTCA；

b220)GAGAAAAATCCTAACCCAATAGAATCACTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCAAAACGAAAGCT；

b221)AATTAAATATCCACAATTCAAAAGCACCTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGAGGAAGTCTTCTA；

b222)CTAGTAGTCAGTAGAAATCTAAGCCCACCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAAATTGATAGTTGT；

b223)GCAAATTGATAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTACAACCAAATGCC；

b224)AAGAGTAACAAGCCAAATGAACAGACAAGTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGATACTTTCCCAGAG；

b225)TTACTAAGTGTTCAAATACCAGTGAACTTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTAGCCTTCCAAGAG；

b226)GAAGACCCCAAAGATCTCATGTTAAGTGGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACTGAAAGATCTGTA；

b227)GGAAAGTATCTCGTTACTGGAAGTTAGCACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAACAGAACCAAATAA；

b228)AAACCCCAAGGGACTAATTCATGGTTGTTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGACACAGAAGGCTT；

b229)GTGAACTTGATGCTCAGTATTTGCAGAATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGCGCCAGTCATTTG；

b230)CCCACTCTGGGTCCTTAAAGAAACAAAGTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAATGTGAACAAAAGG；

b231)CCTGTACAGACAGTTAATATCACTGCAGGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAGAAAGATAAGCCA；

b232)TGTCTATCATCTCAGTTCAGAGGCAACGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCAAATAAACATGGA；

b233)GTTAAAACTAAATGTAAGAAAAATCTGCTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAACATTCAATGTCA；

b234)TCACCTGAAAGAGAAATGGGAAATGAGAACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGCACAATTAGCCGT；

b235)GTAGGTTCCAGTACTAATGAAGTGGGCTCCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGTTCCAGTGATGAA；

b236)GCTATGCTTAGATTAGGGGTTTTGCAACCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGTCTTCCTGGAAGT；

b237)AGTAGTTCAGACTGTTAATACAGATTTCTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGATAACTTAGAACA；

b238)TTTGTTCTGAGACACCTGATGACCTGTTAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGGAAGATACTAGTT；

b239)AAGCGTCCAGAAAGGAGAGCTTAGCAGGAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCATACACATTTGGC；

b240)AGTCCTCAGAAGAGAACTTATCTAGTGAGGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTTCCAACACTTGT；

b241)AATATACCTTCTCAGTCTACTAGGCATAGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTCTGTCTAAGAAC；

b242)CCAGGTAATATTGGCAAAGGCATCTCAGGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGAAACAAAATGTTC；

b243)GCAAATACAAACACCCAGGATCCTTTCTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAAATGAGGCATCAG；

b244)CCAATGAGAAGAAAAAGACACAGCAAGTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTTTTACATCTGAA；

b245)CAGCATCTGGGTGTGAGAGTGAAACAAGCGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAGGGCTATCCTCTC；

b246)ATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCATTTTCTTGGTG；

b247)TACCATGCAACATAACCTGATAAAGCTCCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACTAGAAGCTGTGTT；

b248)CTTGTGGGGCATTCCTTTTTGAACAGTACCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTACAATTTCACCTTT；

b249)TTGTGTATCATAGATTGATGCTTTTGAAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCTGAATTATCACTA；

b250)TTAAAGCAGTATTAACTTCACAGAAAAGTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCCAGAATCCAGAAG；

b251)GCTTTGGCTGCCCAGCAAGTATGATTTGTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCGATGGTTTTCTCC；

b252)CATTAGATGATAGGTGGTACATGCACAGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGAATAGAAACTACC；

b253)CTTAACCTAACTTTATTGGTCTTTTTAATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAACTTTGTAATTCAA；

b254)TTAAACTTCTCCCATTCCTTTCAGAGGGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGGAATCAGCCTCT；

b255)ATCCTTCTGAAGACAGAGCCCCAGAGTCAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTACCATCTTCAACCT；

b256)CTGCTCATACTACTGATACTGCTGGGTATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTGTGAGCAGGGAGA；

b257)ATAGGTAAACATATGCCATGGTGGAATAACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTGCTAGAGGTAAC；

b258)ATCTTGGGAGTGTAAAAAACTGAGGCTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCACTTCCTGATTTT；

b259)CTTCTAATCCTTTGAGTGTTTTTCATTCTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTGTGAACGGACAC；

b260)TCCTGTGCTCTTTTGTGAATCGCTGACCTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGAGCACGTTCTTCT；

b261)GTGTCTGCTCCACTTCCATTGAAGGAAGCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGATGGGTTGTGTT；

b262)ATTTTGAAGTCAGAGGAGATGTGGTCAATGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTCCAAAGCGAGCAA；

b263)GGAAGTAGCAGCAGAAATCATCAGGTGGTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAAAGCTCTTCCTTTT；

b264)ATATTCTTTTATAACTAGATTTTCCTTCTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTCTCTCTTCCTCTC；

b265)CTTGCTATAAGCCTTCATCCGGAGAGTGTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTAAGTATGCAGAT；

b266)GCAAGACCCTGTCTCAAAAACAAACAAAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGTTCCAGTAGTCCT；

b267)ATCCTAAGAACTCATACAACCAGGACCCTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGCCTAGTCCAGGAG；

b268)GGAGAATGAATTGACACTAATCTCTGCTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCAATTGGGCAGATG；

b269)CGGTGTAATTTATAAAGTTATATAAAATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTGCAGCGTGTCTT；

b270)TATACACACATAAGGAACAGTTTATGGTTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCGTACTGGGTTTTTA；

b271)TTTGTGGAGTTTTAAATAGGTTTGGTTCGTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTCAGATTCTTCTG；

b272)TTTGAATTTATCTAATTCTTTTACAGGAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGTCAGCCCTTGCTC；

b273)GCCCAGCATGACACAATTAATGAATGAGCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTTGCCTAAATTCC；

b274)TAGAAGTGGACAGGAAACATCATCTGCTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCACTGTGCGAAGACT；

b275)AAATATATGTAGGAAAATGTTTCATTTAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTTCATCATACCTT；

b276)AAGGACTCAACCTAAAAGATTATTTAAAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAGGCTCTTAGCCAA；

b277)TAAACCAGGTAGAATATTTACCTTCACAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAAACTCCCACATAC；

b278)TAACGCTATTGTCAAATTCTCAATTACTAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAGGTAGAATATTTA；

b279)TAAGGGTGGGTGGTGTAGCTAAAGAACTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGATCCACCTCAGCTC；

b280)TTTCCTTTTAACAGAAGTATTAGAGATGACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGCTCTTTCTTGTA；

b281)ACAAGGCATTCCAAAATTGTTAGCAATTTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTCATATTTACTTAC；

b282)GCAGAGTTTCACAGGAAGTTAAAATCACATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAGACTTTCTCAAAG；

b283)CAGAGGACTTACCATGACTTGCAGCTTCTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCACTGTCTGTCACAG；

b284)GAGATCACGGGTGACAGAGCAAGACTCCACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTCAAAACAACAACAA；

b285)TTGTTCTACATTTAGAAAAACATAATGAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGGTATCTACAACTG；

b286)AAATGAGTATTTTTCTTTCACTTGGTTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATCAGCGTTTGCTTC；

b287)AGGGCTTCTGATTTGCTACATTTGAATCTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTGGTTCCACTTCAG；

b288)TTCTCCATCTGGGCTCCATTTAGACCTGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCATTCACAGGCCAAA；

b289)ACGTGGCAAAGAATTCTCTGAAGTAAGAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTCTCTGTGTCTAA；

b290)AGTCTGTATGAGATTCAAGATGCTGCTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCACTGTTTCCTCAT；

b291)TACCCTGAAATGAAGAAGCCACTGGAGAAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTTTACTGCAAGAA；

b292)GTTTCTTTTTTAAAGTTTGGATCAGTCATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCATTGAAAGTCTCT；

b293)TGGCTGGCCAGCTTCCATTATCAATTAAATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCTCCTTCTGTGAGC；

b294)ATGTTTCATCATGTATAGCATAAATAAACTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTCAAAGTGGATATTA；

b295)CCTGAATCAGCATTTGCAAATGTAAGTGGTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTTCAAACTGGGCT；

b296)AAATATAAGATATGAAGATTTTAAAAAGCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGAATCGTCATCTAT；

b297)ATTTCTAGAACATTTCCTCAGAATTGTCCCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGACAAAGTTGGTTC；

b298)TAAATAACTGTAGTTTTTCCTTATTACATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAAGATCCTGAGAGA；

b299)GCAGCCAAGACCTCTTCTTTTATATCTGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGATCATTTTCACAC；

b300)TAAAATAAGAGTGCTGGCATTTTCATGATCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGGGATTGAAAGTC；

b301)GCTTGTCTGACATTTTGTATGATTCTTTGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTAGGTTTGACAGAA；

b302)TTCAGGTGGCAACAGCTCAACGTTTTTATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACATACATCTTGATT；

b303)AGTTTCTTCTTGATTTTTTTGGATTACTCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTGAATTGTACCTT；

b304)AGCAAGATTATTCCTTTCATTAGCTACTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTCATTGTCTGAGAA；

b305)CACTTGGGTTGCTTGTTTATCACCTGTGTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGTAGAGTTCTTGAA；

b306)GACCTAGAGTCATTTTTATATGCTGCTTTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCTCTGCAAGAACAT；

b307)TCATGTAATCATTATTTTTTTCTGGTATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGATGTCCGATTTTA；

b308)TTAATGTTATGTTCAGAGAGCTTGATTTCCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGAAGCTACCTCCA；

b309)TGAGGCTTGCTCAGTTTCTTTTGATTATCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACAATTTCAACACAA；

b310)ACATCTGAGGGGTTATATGACTATTTTTACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCACTACTCTGTAAAT；

b311)TGACTTCCTGATTCTTCTAATATAGTAGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCCTTTTGGCTAGGT；

b312)TTCCTCAGAAGTGGTCTTTAAGATAGTCATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCAAATGTACTCTT；

b313)ACCAGAAGCACTTTTGTTACAGTCATTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTTCCGTTTAATTTC；

b314)ACTAAACAGTTTCACAGCTTTTTGCAGAGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCAGTTTTGTGCCATG；

b315)ATTTTCTATCTTAAACATTGAAACAACAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGAAGATAAACTTAT；

b316)TCTTCATTTTCAGTATTTCTCTTGTAATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACAAAAGTGCCAGTA；

b317)GCAAGTCCGTTTCATCTTTATGAATACAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTGAATCACTGCCAT；

b318)TGACAAATCTTCTTTAATCTGAGTGTTTCCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCCAGATAATTTAAG；

b319)AGCAGTTAACTGTTCTTTATTTGAAGTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTGAGCTTTCGCAAC；

b320)GCAGTCTGAAAAAATGTATCAGAAGTCTCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGCTCCGTTTTAGTA；

b321)GTTATGCAATTCTTCTGGTTTCTGATCAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATTAAATGACTCTTT；

b322)AGTACCAACTGGGACACTTTCTTTCAGTATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTCTGTTTCCTCATA；

b323)AAAACCCAATAGAGTAGGTTCTTTGATCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTGTCCCTGGAAGGT；

b324)TCTGTACTTTAGGGTCTTTGCCCATTGATGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCACTAGTACCTTG；

b325)GAGAGAATTCTGCATTTCTTTACACTTTGGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAATGGTCTCACATGC；

b326)TTTCAAAAAGATACTTTTTGATGTTTTGAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACATAAATTATCACT；

b327)GTAAAAAGCTAAGGCTGAATTTTCAATGACGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATTTGTGTAACAAGT；

b328)ACAAATAATTTCCTACATAATCTGCAGTATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGACCATCAAATATTC；

b329)GCTGTTAGACATGCTACTGTTACTTAAATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGAGAGATGATTTTT；

b330)CAATACCAGAATCAAGTTTATTTTTTGAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTATATACCTCATCAG；

b331)TAGTCACAAGTTCCTCAACGCAAATATCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGTATGCATTTGCAT；

b332)ATTATTACTATTAGATATGGACAATTTAATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTTGCAGGGTGAAGA；

b333)ACTTTACTGAAACTGTCTGTAAATATGTCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTTCATGTGAAACA；

b334)CATTCATCATTATCTAGAGAGTTATGAAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTCCAATGCCTCGTAA；

b335)ATCCAGACATATTTTGGTTATGTTGTAAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTCAGCAAAAACCT；

b336)GATGAGACTGACTTATGAAGCTTCCCTATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTCTGAAGTTTCCAAA；

b337)TTCTATTTCAGAAAACACTTGTCTTGCGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGATACCTGGACAGA；

b338)TATTAAATGTTCTGGAGTACGTATAGCAGTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAGCTGGTCTGAATG；

b339)CTTAACTTTGTGTAAGGAACTTTCTAAAATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACTTGCTGTACTAAA；

b340)TCAACACGAGGAAGTATTTTTGATACATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAATAGTGAAGACTA；

b341)AACATTTAAGTTATTTGATAATTTAAATTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCCATTTCTGAGTT；

b342)GTTCTCAACAAGTGACACTTTGGTTCCTAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTCTTGTTGAAATTG；

b343)ATTTGTTTTCACAGGAACATCAGAAAAAGTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTCCATTTTTACGTT；

b344)ACATGTAAAAAGAGAATGTGTGGCATGACTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTCAGTTCATCATC；

b345)TACTGAATAAACACTTTAAAAATAGTGATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAAAAATGAACACTTA；

b346)GCACTTTGAGAGGCAGGTGGATCACCTGAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACCATACCTATAGAG；

b347)TCATTATTTTTAGAAATGTTCATTTATAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATACTGTATTAGAAT；

b348)AGTCAGATGTTCATACAAATGAGATTTAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGGTGCGGTAAAATT；

b349)TTTCTTGTAGCAGAAACTTGATAAAATGGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAAATTGCTTGAAGAT；

b350)AATGTGATTTAGTTTTAAAAGGTGGAACAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGCCTGTAGTAATCA；

b351)GTCATTAATCTTATTTTTACTATCATCAGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTTTGCTTTTGTCT；

b352)GCAAAAATTCATCACACAAATTGTCATACAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTCTTCACACTTTGTG；

b353)AATCTAAAACATTAAAAAGGGCTTTAAAATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGGAAAACCATCAGG；

b354)ACCTGTTTATGAGAACACGCAGAGGGAACTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTTTCAGAGAGATT；

b355)ACAAAGCCATTTGTAGATACTAGTTAATGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTCATAAAAGCCAT；

b356)GAGTACCTATAAAATTCTTCTTTTCCAGCCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGTATGAGCCATCCA；

b357)TCTAGCCAACTTTTTAGTTCGAGAGACAGTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGATGAGGGAATACA；

b358)GGCATCTATTAGCAAATTCCTTAGGAAAGGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCAGTTTCCATATGA；

b359)ATGTAATGCTTTAAACTTGCCTGTATTTTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTTCTGGGCTTAGGC；

b360)TGCAACATTTTGACATGGAAGTCACAGACTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCATACTGCCGTATA；

b361)GTATCTGCACTACTAGTTTTATTGCTAGAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCGCTCAATGAAATT；

b362)TTCTTTAAGACAGCTAAGAGGGGAGGATCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCATACCACCCATCT；

b363)GGGGCTTCAAGAGGTGTACAGGCATCAGGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCTCCATGAAGAATA；

b364)AGCATTTAAAATTTAAATGTAAAACTTCTAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAATGACTGATTTTTA；

b365)CACAACCAACATTTCCTCCATCACTGAAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAGGAAAAGGTCTAG；

b366)AAACAAATTAATTGTATCAAAAGAAAGAAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAAGAATACATCATAC；

b367)TCCTCCTGAATTTTAGTGAATAAGGCTTCTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCCTCCACATATTTT；

b368)ACAATTTACTCATTAAAAATGTTAAATTCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGTTCTCATATTAGA；

b369)ACTCTCTCACCTCAAGGTAAGCTGGGTCTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTTCATAAAGCTCTG；

b370)TGTGATGGCCAGAGAGTCTAAAACAGCTTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATCAAGCCTCATTAT；

b371)CTTCCTAATTTCCAACTGGATCTGAGCTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCATTTGCCTGTGATT；

b372)CAATACGCAACTTCCACACGGTTGTGACATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTCCTTTTGTTCAG；

b373)TTGTTAGTAAGGTCATTTTTTAAGTTAATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAAGCATTTACATACT；

b374)ATAAATACAGATCCTCTTTTATATTATCTCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAGTGGATTTTGCTTC；

b375)AAAGGTTTGTACCGGTAGTTGTTGATACTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTGCTAACTGTATGTT；

b376)GAGATTCCATAAACTAACAAGCACTTATCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAATGAAAGGTTTGTA；

b377)AATTAACTATATTGTGCATTACCTGTTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTACAAATCCTATTAGG；

b378)AAGAGGCTTACTTTCAGATCACTAGTTAGCGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGGTAGCTCCAACT；

b379)TGGATTCTGGTCGCCACTGGAGGTTGCTTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAGGCTTAATAATGT；

b380)TTTTTCATTTTGTTGAATGTCTCTTGAAAGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTAGCAGAAAACACA；

b381)AAAGCTATTTCCTTGATACTGGACTGTCAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTAAATGTGTGGTGATG；

b382)ACCAGAAGCTTGTTTCCTGTACCAGGAATGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGGCCCTGAAGTACAG；

b383)ACATTTTCTAATTAAGTTTAATTACATTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTATACAACAGAATAT；

b384)TTTGAAGTCATCTGGGCTGAGACAGGTGTGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTTTGGCCATACAAAGT；

b385)GCTCTTCTCTTTTTGCAGTTCTTTTGGTCAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCCTTTACAAGACTTT；

b386)GGTGGCTGAAATGCCTTCTGTGCAGCCGGAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTATGGGACTAACAGGT；

b387)TTGAATTACTTTCCAAAAGAGAAATTTCATGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGAGTCATCTGAGGAG；

b388)GAGCAGTCCTAGTGGATTCACTGACAGATAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCTGTTGAACCAGACA；

b389)GCTTATTTTTCTCACATTCTTCCGTACTGGGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGTTCTTTGATCAGAG；

b390)GTGGTTTGAAATTATATTCCAGTCTTATAAGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTCGTCAATAATTTATT。所述74个通用引物对的上游通用引物的核苷酸序列(从5’至3’)可为CACAGAACGACATGGCTACGA；

所述74个通用引物对的下游通用引物的核苷酸序列(从5’至3’)分别可为b392)-b465)：

b392)AGCCAAGGAGTTGCGGATTGCCGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b393)AGCCAAGGAGTTGCATCACTCACTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b394)AGCCAAGGAGTTGCAGCTGACTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b395)AGCCAAGGAGTTGTTCGCAGACATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b396)AGCCAAGGAGTTGTTGTACCAATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b397)AGCCAAGGAGTTGACCACAATCGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b398)AGCCAAGGAGTTGGGAAGTCTGTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b399)AGCCAAGGAGTTGAGAGTGTGGATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b400)AGCCAAGGAGTTGGCTTGTGGTGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b401)AGCCAAGGAGTTGTTGTCCTCTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b402)AGCCAAGGAGTTGATTCGCTAGGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b403)AGCCAAGGAGTTGCGATGACTACTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b404)AGCCAAGGAGTTGACAGCTCAGCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b405)AGCCAAGGAGTTGTATCTAGGTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b406)AGCCAAGGAGTTGGAGATGGCAATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b407)AGCCAAGGAGTTGCGCAAGATCTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b408)AGCCAAGGAGTTGGCCGATAGCGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b409)AGCCAAGGAGTTGCCATCGTTGCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b410)AGCCAAGGAGTTGTGAACGATTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b411)AGCCAAGGAGTTGTAGAGCGAACTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b412)AGCCAAGGAGTTGATGTGTGAGATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b413)AGCCAAGGAGTTGATCCTAACAGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b414)AGCCAAGGAGTTGCGCGTCTGCGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b415)AGCCAAGGAGTTGGATGATCCTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b416)AGCCAAGGAGTTGGCTCAACGCTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b417)AGCCAAGGAGTTGATGCATCTAATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b418)AGCCAAGGAGTTGAGCTCTGGACTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b419)AGCCAAGGAGTTGCTATCACGTGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b420)AGCCAAGGAGTTGGGACTAGTGGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b421)AGCCAAGGAGTTGGCCAAGTCCATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b422)AGCCAAGGAGTTGCCTGTCAAGCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b423)AGCCAAGGAGTTGTAGAGGTCTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b424)AGCCAAGGAGTTGTATGGCAACTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b425)AGCCAAGGAGTTGCTGCGTACATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b426)AGCCAAGGAGTTGATCTCATTAATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b427)AGCCAAGGAGTTGAAGTGGCGCATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b428)AGCCAAGGAGTTGGGCCTTAATGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b429)AGCCAAGGAGTTGTCTGAGGCGGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b430)AGCCAAGGAGTTGCGAGCCGATTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b431)AGCCAAGGAGTTGGATAACCGGCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b432)AGCCAAGGAGTTGTCAATATTCCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b433)AGCCAAGGAGTTGTCCGTTGAATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b434)AGCCAAGGAGTTGCAGTACAGTTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b435)AGCCAAGGAGTTGATTGAGGTACTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b436)AGCCAAGGAGTTGATTAGAAGTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b437)AGCCAAGGAGTTGCAACGCTTCATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b438)AGCCAAGGAGTTGGGATCGCACGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b439)AGCCAAGGAGTTGTGCCTTCCGATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b440)AGCCAAGGAGTTGGCGACATCGGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b441)AGCCAAGGAGTTGCATTCTAAGTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b442)AGCCAAGGAGTTGCAGGCTTGGATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b443)AGCCAAGGAGTTGATCATCGTCTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b444)AGCCAAGGAGTTGGTCTTGTGAGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b445)AGCCAAGGAGTTGAGTAGGAACGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b446)AGCCAAGGAGTTGTCACAACCACTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b447)AGCCAAGGAGTTGGCAGGCCTTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b448)AGCCAAGGAGTTGTGGCAAGCTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b449)AGCCAAGGAGTTGGAGCATTGTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b450)AGCCAAGGAGTTGTGTGATTAGCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b451)AGCCAAGGAGTTGCCTATGGACTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b452)AGCCAAGGAGTTGTAGGCGATAGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b453)AGCCAAGGAGTTGAGACCACGATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b454)AGCCAAGGAGTTGGTATTAGCCATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b455)AGCCAAGGAGTTGCTCTGCACTGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b456)AGCCAAGGAGTTGACCAGCCTGATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b457)AGCCAAGGAGTTGGCGTGAGTATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b458)AGCCAAGGAGTTGCGCGGAGCATTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b459)AGCCAAGGAGTTGCAAGTTCACATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b460)AGCCAAGGAGTTGAGCACCTCTCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b461)AGCCAAGGAGTTGTTACAGTGCATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b462)AGCCAAGGAGTTGTTGCCTAGGCTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

b463)AGCCAAGGAGTTGGCTATGATGGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

464)AGCCAAGGAGTTGAATTACCATGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG；

465)AGCCAAGGAGTTGAGACATGGTGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG。

上述任一所述试剂盒具体可由195个特异引物对和74个通用引物对组成。

上述任一所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。上述任一所述试剂盒的制备方法可为将各个引物分别单独包装。

上述任一所述特异引物对和上述任一所述通用引物对在检测人类BRCA1/2基因突变中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种检测人类BRCA1/2基因突变的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用上述任一所述的所有特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，纯化，得到纯化产物1；

(3)以步骤(2)得到的纯化产物1为模板，分别采用上述任一所述的通用引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物；

(4)分别取步骤(3)得到的PCR扩增产物，纯化，得到纯化产物2；

(5)分别取步骤(4)得到的纯化产物2，进行测序；根据测序结果，获得待测样本的基因组DNA中BRCA1/2基因突变的信息。

上述方法中，所述步骤(5)中，“分别取步骤(4)得到的纯化产物2，进行测序”具体可为分别取步骤(4)得到的纯化产物2，先进行单链环化，然后测序。

所述单链环化依次包括如下步骤：

(5-1)分别取步骤(4)得到的纯化产物2，定量；

(5-2)等量混合。

(5-3)单链环化。

所述步骤(5-1)中，定量可采用Qubit进行。

所述步骤(5-2)中，所述等量混合可根据标签接头编号等量混合。

所述步骤(5-3)中，单链环化可采用华大基因生产的环化试剂盒进行。

上述方法中，所述待测样本可为(A1)或(A2)或(A3)或(A4)或(A5)：(A1)人宫颈脱落细胞；(A2)人宫颈上皮组织；(A3)血液；(A4)尿液；(A5)唾液。

上述方法中，所述待测样本的基因组DNA具体可为YH的基因组DNA或健康人宫颈脱落细胞的基因组DNA。所述YH的基因组DNA具体可为深圳华大基因研究院的产品。

所述步骤(1)中，进行PCR扩增的反应体系具体可为反应体系1和反应体系2。

反应体系1可为50μL，由25μL2×KAPA2G Fast ReadyMix2、2μL待测样本的基因组DNA(含20ng待测样本的基因组DNA)、1μL Multi-PCR Primer Pool 1(由b1)至b100)的上游特异引物和b196)至b295)的下游特异引物组成)、0.6μL TMAC(浓度为5M)和21.4μL蒸馏水组成。反应体系1中，各个引物的浓度为0.25μM。

反应体系2可为50μL，由25μL 2×KAPA2G Fast ReadyMix2、2μL待测样本的基因组DNA(含20ng待测样本的基因组DNA)、1μL Multi-PCR Primer Pool 2(由b101)至b195)的上游特异引物和b296)至b390)的下游特异引物组成)、0.6μL TMAC(浓度为5M)和21.4μL蒸馏水组成。反应体系2中，各个引物的浓度为0.25μM。

上述任一所述2×KAPA2G Fast ReadyMix 2具体可为KAPA BIOSYSTEMS公司的产品，货号为KK5802。

所述步骤(1)中，进行PCR扩增的反应程序可为：96℃10min；96℃1min，60℃15min，72℃1min，5个循环；68℃10min；4℃保持。

所述步骤(2)和(4)中，所述纯化可为采用AgencourtAMPure XP磁珠进行纯化。

所述步骤(3)中，进行PCR扩增的反应体系具体可为反应体系3。

反应体系3可为50μL，由25μL2×KAPA2G Fast ReadyMix2、24μL纯化产物1、0.4μL通用引物对的水溶液和0.6μL TMAC(浓度为5M)组成。反应体系3中，各个引物的浓度为40μM。

所述步骤(3)中，进行PCR扩增的反应程序可为：96℃10min；96℃1min，62℃1min，72℃1min，20个循环；68℃10min；4℃保持。

所述步骤(5)中，测序可采用BGISEQ-500测序平台、MGISEQ-200测序平台或MGISEQ-2000测序平台进行测序。测序平台的读长模式可为PE100、SE100或SE120。

本发明提供的试剂盒基于BGISEQ-500测序平台多重PCR检测BRCA1/2基因突变，其不仅检测性能优良，能提供全面的变异位点解析，而且检测时间大大缩短，检测成本大大降低。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为特异引物对的上下游引物的结构示意图。

图2为基于BGISEQ-500测序平台的检测人类BRCA1/2基因突变的文库构建示意图。

图3为聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、基于BGISEQ-500测序平台的人类BRCA1/2基因突变高通量检测试剂盒的制备

基于BGISEQ-500测序平台的人类BRCA1/2基因突变的高通量检测试剂盒包括195个特异引物对和74个通用引物对。每个引物对均由两条引物组成。

每个特异引物对由上游特异引物和下游特异引物组成，上游特异引物(由5’到3’)由DNA片段甲、Ω环1(Ad153接头序列1)和DNA片段乙组成，下游特异引物(由5’到3’)由DNA片段丙、Ω环2(Ad153接头序列2)和DNA片段丁组成。DNA片段甲为25-30个核苷酸组成的单链DNA分子，Ω环1为28-32个核苷酸组成的单链DNA分子，DNA片段乙为12-15个核苷酸组成的单链DNA分子，DNA片段甲和DNA片段乙分别与BRCA1基因或BRCA2基因上的两个区段相同且两个区段在BRCA1基因或BRCA2基因上的距离为12-15个核苷酸。DNA片段丙为25-30个核苷酸组成的单链DNA分子，Ω环2为28-32个核苷酸组成的单链DNA分子，DNA片段丁为12-15个核苷酸组成的单链DNA分子，DNA片段丙和DNA片段丁分别与BRCA1基因或BRCA2基因上的两个区段相同且两个区段在BRCA1基因或BRCA2基因上的距离为12-15个核苷酸。Ω环1和Ω环2均不能与BRCA1基因或BRCA2基因结合，造成上游特异引物和下游特异引物与BRCA1基因或BRCA2基因结合时呈凸起的鼓泡状。每个特异引物对检测的靶区域长度为81-146bp。由于特异引物对的上下游引物的核苷酸序列不同，各个特异引物对可以结合至BRCA1基因或BRCA2基因的不同位置。所有特异引物对的靶区域拼接后可以覆盖BRCA1基因和BRCA2基因的编码区。

每个通用引物对由上游通用引物和下游通用引物组成，上游通用引物(由5’到3’)由5’磷酸化的DNA片段1(Ad153接头序列3)组成，下游通用引物(由5’到3’)由DNA片段2(即测序接头序列)、Barcode标记序列、TT(增加TT的目的是在进行PCR过程中滑动识别模板)和DNA片段3组成。DNA片段1为21个核苷酸组成的单链DNA分子，与Ω环1的核苷酸序列部分相同。DNA片段3为20个核苷酸组成的单链DNA分子，与Ω环2的核苷酸序列部分相同。添加测序接头序列和Barcode标记序列的目的是为了便于进行测序，根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。

上游特异引物的核苷酸序列分别见表1中第2行至第196行，与之对应的下游特异引物的核苷酸序列依次见表1中第197行至第391行。特异引物对的引物的结构示意图见图1。

上游通用引物的核苷酸序列具体见表2中第2行。下游通用引物的核苷酸序列分别见表2中第3行至第76行。

表1

表2

注：/5Phos/表示5’磷酸化。

实施例2、采用实施例1制备的试剂盒检测人类BRCA1/2基因突变

基于BGISEQ-500测序平台的检测人类BRCA1/2基因突变的文库构建示意图见图2。

待测DNA为YH gDNA(深圳华大基因研究院的产品)或健康人宫颈脱落细胞的gDNA。2×KAPA2G Fast ReadyMix 2为KAPA BIOSYSTEMS公司的产品，货号为KK5802。

一、第一轮多重PCR扩增

1、配置反应体系1和反应体系2。

反应体系1为50μL，由25μL2×KAPA2G Fast ReadyMix2、2μL待测DNA水溶液(浓度为10ng/μL)、1μL Multi-PCR Primer Pool 1(由编号为1至100的上游特异引物和编号为196至295的下游特异引物组成)、0.6μL TMAC(浓度为5M)和21.4μL蒸馏水组成。反应体系1中，各个引物的浓度为0.25μM。

反应体系2为50μL，由25μL 2×KAPA2G Fast ReadyMix2、2μL待测DNA水溶液(浓度为10ng/μL)、1μL Multi-PCR Primer Pool 2(由编号为101至195的上游特异引物和编号为296至390的下游特异引物组成)、0.6μL TMAC(浓度为5M)和21.4μL蒸馏水组成。反应体系2中，各个引物的浓度为0.25μM。

2、取所述反应体系1，进行PCR扩增，得到第一轮多重PCR扩增产物1。取所述反应体系2，进行PCR扩增，得到第一轮多重PCR扩增产物2。

反应程序：96℃10min；96℃1min，60℃15min，72℃1min，5个循环；68℃10min；4℃保持。

二、纯化

取步骤一得到的第一轮多重PCR扩增产物1和第一轮多重PCR扩增产物2，混合，然后加入80μLAgencourtAMPure XP磁珠，然后按照AgencourtAMPure XP磁珠的说明书步骤进行纯化，最后用24μLTE溶液溶解，得到纯化产物1。

三、第二轮多重PCR扩增

1、配置74个反应体系3。每个反应体系3为50μL，由25μL2×KAPA2G FastReadyMix2、24μL纯化产物1、0.4μL通用引物对的水溶液和0.6μL TMAC(浓度为5M)组成。反应体系3中，各个引物的浓度为40μM。

74个反应体系3中通用引物对的上游通用引物的核苷酸序列均具体见表2中第2行。74个反应体系3中通用引物对的下游通用引物的核苷酸序列分别见表2中第3行至第76行。每个反应体系3中的下游通用引物的核苷酸序列均不同。

2、取所述反应体系3，进行PCR扩增，得到第二轮多重PCR扩增产物。

反应程序：96℃10min；96℃1min，62℃1min，72℃1min，20个循环；68℃10min；4℃保持。

四、文库的获得

分别取步骤三得到的第二轮多重PCR扩增产物，混合，然后加入40μLAgencourtAMPure XP磁珠，然后按照AgencourtAMPure XP磁珠的说明书步骤进行纯化，最后用20μL TE溶液溶解，得到文库。

五、聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定

取3μL步骤四获得的文库，在6％(m/v)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测。

实验结果见图3(M为DNA Marker，23为YH gDNA，24为健康人宫颈脱落细胞的gDNA)。结果表明，多重扩增子均分布在200-300bp之间，相邻扩增子或相邻几个扩增子的引物干扰造成的非特异性大片段均大于400bp。

六、文库的单链环化

1、取步骤四获得的文库，先使用Qubit对文库进行定量，然后将该文库根据标签接头编号等量混合。

2、完成步骤1后，取所述文库(约168ng)，按照华大基因生产的环化试剂盒的说明书操作步骤进行单链环化。

七、测序及结果分析

1、取完成步骤六的文库，采用BGISEQ-500测序平台进行测序(读长模式为PE100)，得到下机数据。

2、取步骤1得到的下机数据(单个样本≤1M reads可满足需求，Error rate用于体现原始测序质量的指标)，进行Barcode拆分，得到拆分率等数据信息。

3、完成步骤2后，取所述测序数据，先进行质量过滤(目的为去掉测序质量低的reads)，然后去接头，得到过滤后质量值(Q值)和测序结果。

4、将步骤3得到的测序结果和人类基因组数据库(hg19)进行比对，得到相关的比对率和测序深度及所包含的重复序列占下机数据的百分比等信息，对覆盖到人类基因组序列的这部分数据再进一步比对到所要捕获的目标基因编码区序列上(BRCA1/2编码区)，获得目标区域深度分布情况，计算捕获率、覆盖率和均一性等。

YH gDNA的检测结果见表3和表4。结果表明，对YH gDNA进行BRCA1/2基因突变检测，得到15个SNP位点，这15个SNP位点与YH gDNA的全外显子组检测(whole exomesequencing，WES)的位点完全一致。

表3

注：第一列Barcode的编号和表2中编号为392至465的下游通用引物中的Barcode一一对应；Q20表示过滤后的reads中质量值大于20的碱基数占总碱基数的百分比；Q30表示过滤后的reads中质量值大于30的碱基数占总碱基数的百分比；比对率：将测序数据与人类全基因组重测序进行比对，序列一致的碱基占测序碱基总数的比率；捕获率：测序数据与靶基因参考序列进行比对，考察多重PCR技术捕获效率的高低；平均深度：测序平均深度，一般>2000X；覆盖度：测序数据经过组装、比对，被定位到染色体上，这里指测序数据覆盖到BRCA基因区域的深浅；均一性：一般设置0.2X的系数，保证扩增子间拷贝数差异控制在平均深度测序深度0.2X以上。

表4

健康人宫颈脱落细胞的gDNA的检测结果见表5。结果表明，对来源于HPV分型检测的样本(即人宫颈脱落细胞)，可以实现人BRCA1/2基因突变的检测，实现一份样本多种检测，即“N检合一”。

表5

注：第一列Barcode的编号和表2中编号为399至402的下游通用引物中的Barcode一一对应；Q20表示过滤后的reads中质量值大于20的碱基数占总碱基数的百分比；Q30表示过滤后的reads中质量值大于30的碱基数占总碱基数的百分比；比对率：将测序数据与人类全基因组重测序进行比对，序列一致的碱基占测序碱基总数的比率；捕获率：测序数据与靶基因参考序列进行比对，考察多重PCR技术捕获效率的高低；平均深度：测序平均深度，一般>2000X；覆盖度：测序数据经过组装、比对，被定位到染色体上，这里指测序数据覆盖到BRCA基因区域的深浅；均一性：一般设置0.2X的系数，保证扩增子间拷贝数差异控制在平均深度测序深度0.2X以上。

由此可见，实施例1制备的试剂盒用于检测人类BRCA1/2基因突变具有较高的准确性。

关于人类BRCA1/2基因突变的检测，采用探针杂交捕获+二代测序(NGS)方法的检测费用为几百元/例，检测时间为10-14天/例。而采用实施例1制备的试剂盒的检测费用为100元/例，检测时间约5天；具体如下：DNA样本制备2h，费用6元；文库构建7h，费用20元；DNA纳米球(DNB)制备与加载12h，上机测序72h，费用60元；数据分析解读12h，临床报告出具12h。由此可见，采用实施例1制备的试剂盒检测人类BRCA1/2基因突变，不仅检测成本降低，而且检测时间缩短。