阅读说明：本技术 ***的检测方法 (Method for detecting cervical cancer ) 是由 林东旭 魏国鹏 于 2018-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种宫颈癌的检测方法,其包括通过检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数来确定受试者是否患有宫颈癌或处于发展宫颈癌的风险中。更具体地,本发明涉及通过实时定量PCR(qPCR)来检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数。本发明还涉及用于检测宫颈癌的试剂盒。(The present invention relates to a method for detecting cervical cancer, which comprises determining whether a subject has or is at risk of developing cervical cancer by detecting the relative copy number of a 3q amplification hotspot region on chromosome 3. More specifically, the present invention relates to the detection of the relative copy number of the 3q amplification hotspot region on chromosome 3 by real-time quantitative pcr (qpcr). The invention also relates to a kit for detecting cervical cancer.)

***的检测方法

技术领域

本发明涉及一种***的检测方法，其包括通过检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数来确定受试者是否患有***或处于发展***的风险中。更具体地，本发明涉及通过实时定量PCR (qPCR)检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数。本发明还涉及用于检测***的试剂盒。

发明背景

***在世界范围内是位居女性第3位最常见疾病和病死率位居第4位的癌症，且近年来其发病年龄呈明显年轻化趋势。尤其是在发展中国家，由于***筛查工作的不完善，其发生率是发达国家的6 倍，且发病率每年在以2％-3％的速度增长。***的发生和发展有一个渐进的演变过程，时间可以从数年到数十年，一般认为演变分几个阶段：轻度(CINI)、中度(CINII)和重度上皮内瘤样病变(CINIII)、***。所以对CINIII进行有效筛查可以很好的降低***患病率，从而降低癌症死亡率。

***的病因学研究已证实主要是人***瘤病毒(HPV)感染。 HPV有多种亚型，约40种涉及生殖道感染，其中高危型HPV(16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58，59和69)持续感染，尤其是HPV16、18型可以引发***。但是HPV感染并不一定会导致***，此外绝大多数HPV感染者1-2年内可以通过自身免疫系统来清除HPV病毒，从而避免癌症。而目前针对***的早期筛查仍然以细胞学检查占主要地位。TCT即液基薄层细胞检测是目前国际上较先进的一种宫颈脱落细胞学检查技术，与传统的宫颈刮片巴氏涂片检查相比明显提高了标本的满意度及宫颈异常细胞检出率，有数据显示细胞学筛查CINII级及以上级别病变的灵敏度和特异度分别为 51.5％和73.4％，而HPV检测同一病变的灵敏度和特异度分别为88.2％和57.8％。TCT方法的特异性高，HPV检测的灵敏度高。所以两种方法对于***和癌前病变的筛查各有利弊。

虽然HPV检测应用广泛，但是罹患***的患者中有5-10％发现是HPV阴性，说明这些患者的癌变机制和HPV感染无关，对这一类人群进行HPV早期癌症筛查是无效的。TCT检测同样存在问题，由于方法本身限制只能观察细胞学形态，所以人为因素影响比较大，而且不能提供更深层次比如基因方面的信息。***镜作为一种常规的临床检测方法的准确率更是很大程度上取决于是否能够观察到完整的转化区，但由于患者的年龄、病变累及宫颈的范围及严重程度、***镜的分辨率、临床医师的操作及诊断水平等差异，其本身就存在诊断不足及诊断过度的问题。有研究将***镜下宫颈活检病理与最终诊断病理结果进行比较得出，其CINIII级及原位癌的诊断不足率为42％。

因此，仍然需要用分子标志物来直接鉴定***并监测疾病进展的方法。

发明概述

本发明提供了一种与***相关的拷贝数变异(CNV)标志物。具体地，本发明人令人惊讶地发现，三号染色体长臂(3q)中特定区域(在本发明中称为3q扩增热点区域)的拷贝数扩增可以作为判断***发生的标志物。在优选的实施方案中，3q扩增热点区域的拷贝数扩增特别适合用于检测CINII级及以上级别的***病变。

在一个方面，本发明提供了一种确定受试者是否患有***或处于发展***的风险中的方法，所述方法包括：

a.提供来自所述受试者的样品，和

b.检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数，

其中与对照样品中3q扩增热点区域的相对拷贝数相比，所述受试者的样品中3q扩增热点区域的相对拷贝数的升高指示所述受试者患有***或处于发展***的风险中。

在具体的实施方案中，本发明提供了一种确定受试者是否患有***或处于发展***的风险中的方法，所述方法包括：

a.提供来自所述受试者的样品，

b.检测所述样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的拷贝数，

c.检测所述样品中参考染色体区域的拷贝数，和

d.将所述3q扩增热点区域相对于所述参考染色体区域的拷贝数进行归一化，从而获得所述3q扩增热点区域的相对拷贝数，

其中与对照样品中3q扩增热点区域的相对拷贝数相比，所述受试者的样品中3q扩增热点区域的相对拷贝数的升高指示所述受试者患有***或处于发展***的风险中。

在具体的实施方案中，3q扩增热点区域包含3q26.2至3q29的染色体区域。

在具体的实施方案中，3q扩增热点区域包含3q27至3q29的染色体区域。

在具体的实施方案中，3q扩增热点区域包含DLG1基因的染色体区域。

在具体的实施方案中，参考染色体区域包含单拷贝基因的染色体区域。

在具体的实施方案中，参考染色体区域包含ALB基因的染色体区域。

在具体的实施方案中，使用正向引物P1和反向引物P2通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的拷贝数，其中P1和P2与所述3q扩增热点区域上的靶核酸序列杂交。

在具体的实施方案中，使用正向引物P3和反向引物P4通过qPCR 检测所述样品中参考染色体区域的拷贝数，其中P3和P4与所述参考染色体区域上的靶核酸序列杂交。

在另一个方面，本发明提供了用于检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数的试剂在制备试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒适于在本发明的如上文所述的方法中使用。

在另一个方面，本发明还提供了用于确定受试者是否患有***或处于发展***的风险中的试剂或试剂盒，其包含用于检测受试者的样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数的试剂。

在具体的实施方案中，所述用于检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数的试剂包括用于通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的拷贝数的试剂，和用于通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中参考染色体区域的拷贝数的试剂。

在具体的实施方案中，所述3q扩增热点区域包含3q26.2至3q29 的染色体区域。

在具体的实施方案中，所述3q扩增热点区域包含3q27至3q29 的染色体区域。

在具体的实施方案中，所述3q扩增热点区域包含DLG1基因的染色体区域。

在具体的实施方案中，所述参考染色体区域包含单拷贝基因的染色体区域。

在具体的实施方案中，所述参考染色体区域包含ALB基因的染色体区域。

在具体的实施方案中，所述用于通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的拷贝数的试剂包含与所述3q扩增热点区域上的靶核酸序列杂交的正向引物P1和反向引物 P2。

在具体的实施方案中，所述用于通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中参考染色体区域的拷贝数的试剂包含与所述参考染色体区域上的靶核酸序列杂交的正向引物P3和反向引物P4。

具体实施方式

图1显示了不同***样品中三号染色体区域的拷贝数扩增情况。

图2显示了使用设计的引物通过qPCR扩增的靶核酸的凝胶电泳结果。

图3显示了使用设计的引物进行qPCR扩增的扩增曲线。

发明详述

本发明具有许多具体的实施方案，并且本发明的技术细节依赖于本领域技术人员已知的许多专利、申请案和其他参考文献。因此，当在下文中引用或重复专利、申请案或其他参考文献时，应当理解，其全部内容通过引用并入本文。

除非另有说明，否则本发明的实践可以使用在本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。可以通过参考下文的实施例来获得适当技术的具体说明。但是，当然也可以使用其他等效的常规程序。这样的常规技术和描述可以在标准的实验室手册中找到，例如GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using Antibodies:A LaboratoryManual，Cells:A Laboratory Manual，PCR Primer:A Laboratory Manual，和MolecularCloning:A Laboratory Manual(均来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer,L. (1995)Biochemistry(4th Ed.)Freeman,New York,Gait, “OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach”1984，IRL Press， London,Nelson and Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry 3^rd Ed.，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.和Berg 等人(2002)Biochemistry，5^thEd.，W.H.Freeman Pub.，New York， N.Y.，所有这些文献出于所有目的通过引用整体并入本文。

除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。涵盖本文包括的术语的各种科学词典是本领域技术人员公知的并且是可获得的。

定义

如本文所用，术语“受试者”指实施本发明的方法的任何个体或患者。尽管如本领域技术人员所认识的，受试者可以是动物，但是一般而言受试者是人。因此，其他动物，包括哺乳动物比如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、包括母牛、马、山羊、绵羊、猪等农场动物和灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)，都包括在本发明的受试者的定义内。

如本文所用，术语“样品”或“样本”指适合本发明提供的方法的任何样品。本方法中使用的细胞样品可获得自受试者的组织样品或体液，或者通过活检过程(例如，针活检)或外科过程获得的组织。因此，示例性样品包括但不限于组织样品、冷冻组织样品、活检样本、外科样本、细胞样本、脱落细胞样本、细胞系、异种移植物、肿瘤、细针吸出物、全血液、骨髓、脑脊髓液、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、羊膜液、粘液、血浆、尿、乳糜、粪便、痰、汗液、眼泪、***、***抽吸、唾液和其任意组合。

在具体的实施方案中，术语“样品”或“样本”包括核酸样品。如本文所用，术语“核酸样品”是指包含核酸的样品。在具体的实施方案中，核酸样品可以是包含基因组的样品，例如包含受试者的所有或部分基因组的样品。在优选的实施方案中，样品是来自受试者的基因组样品。

如本文所用，术语“对照样品”或“对照样本”是指已知无拷贝数变异的样品。例如，这样的样品可以是来自健康受试者或未患有***的受试者的样品。

如本文所用，术语“拷贝数”指的是给定染色体或染色体区域或基因在基因组中出现的拷贝的数量。在本发明的上下文中，提及的染色体通常是指人的染色体。

如本文所用，术语“3q扩增热点区域”是指三号染色体长臂(3q) 中与***相关的一段区域。本发明人已经发现，3q扩增热点区域的拷贝数扩增可以作为判断***发生的标志物。在具体的实施方案中，3q扩增热点区域包含三号染色体上3q26.2至3q29的染色体区域或由其组成。在更具体的实施方案中，3q扩增热点区域包含三号染色体上3q26.2、3q26.31、3q26.32、3q26.33、3q27.1、3q27.2、3q27.3、3q28 或3q29的染色体区域或前述任何基因座之间的染色体区域或由其组成。在优选的实施方案中，3q扩增热点区域包含位于热点区域的3q29 上(从197042560bp到197299272bp)的DLG1(Discs large homolog 1)基因或由其组成。

如本文所用，术语“拷贝数扩增”是指与参考染色体或染色体区域或基因相比，给定染色体或染色体区域或基因在基因组中出现的拷贝数增加。

如本文所用，“参考染色体”、“参考染色体区域”或“参考基因”可互换使用，其是指与目标染色体、染色体区域或基因不同的染色体、染色体区域或基因。其可以是单拷贝的染色体、染色体区域或基因或拷贝数已知的染色体、染色体区域或基因。在一些实施方案中，参考染色体、染色体区域或基因在与目标染色体、染色体区域或基因相同或不同的核酸分子(例如，染色体)上。在优选的实施方案中，“参考染色体”、“参考染色体区域”或“参考基因”是单拷贝的染色体、染色体区域或基因。单拷贝的染色体、染色体区域或基因的实例包括但不限于编码以下蛋白的基因以及包含这样的基因的染色体或染色体区域：CD3、CD4、36B4(其编码酸性核糖体磷蛋白P0(RPLP0))、 ATP-合酶亚基5B(A5B)、肿瘤蛋白翻译控制蛋白1(TPT1)、信号识别粒子14kDa(SRP14)、TATA结合蛋白(TBP)、真核延伸因子1A1(EEF1A1)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)、多泛素(Ubi)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PD)、β-肌动蛋白(ACTB) 和ALB。其他的单拷贝基因的合适实例是本领域技术人员已知的。在优选的实施方案中，参考染色体或染色体区域或基因是ALB基因或包含ALB基因的染色体区域。本发明人发现，位于4号染色体上(4q13.2，从73404255bp到73421412bp)的ALB基因是较少发生拷贝数变异的单拷贝基因，其特别适合在本发明的方法中用作参考基因。

如本文所用，“聚合酶链式反应(PCR)”是一种本领域熟知的快速核酸扩增方法(参见，例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；和 4,965,188)。PCR通常包括向样品(模板)添加聚合酶、dNTP、缓冲液、引物(例如，一对寡核苷酸引物)，并使该PCR主混合物经历至少一个循环，包括变性(熔化)、退火(或杂交)和延长(或延伸) 步骤。

如本文中所用，术语“引物”指在合适的缓冲液中和在适当的温度下，例如在存在4种不同的核苷三磷酸和聚合酶的情况下，能充当核酸合成的起始点的多核苷酸。因此，引物包括与靶核酸(模板)杂交的靶向序列。引物一般是寡核苷酸，而且是单链的，然而，引物可指具有双链区段的多核苷酸。适于引物的靶向序列的合适长度取决于引物的预期用途。短的引物分子通常需要较低的温度，以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不必反映核酸模板的确切序列，但是必须是充分互补的，以便与核酸模板杂交。在本文所述的方法中，引物通常可以使用四种天然存在的脱氧核苷酸dATP，dTTP，dCTP和 dGTP合成。在本发明的一些实施方案中，引物还可以掺入通常不存在于DNA中的天然或合成的脱氧核苷酸类似物。可以使用本领域技术人员已知的标准引物设计计算机软件技术来设计引物。在引物设计期间考虑的变量可以包括引物长度、GC对含量、解链温度和由引物或引物对扩增的靶核酸的大小。一般而言，引物不应形成发夹结构或自身或异源引物对。在优选的实施方案中，引物可以包含与模板的一部分互补的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、 45、50或更多个碱基的序列。

如本文所用，术语“互补”或“基本互补”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对或者双链体形成。如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)或者C和G。当在最佳地比对和比较并适当地进行了核苷酸***或缺失的情况下，一条链的核苷酸与另一条链的至少大约80％、通常至少大约90％到约95％，甚至大约98％到100％配对时，这两个单链RNA 或DNA分子被称为基本互补。

如本文所用，术语“杂交”是指两个单链核酸通过碱基互补配对形成双链结构。杂交可发生于完全互补的核酸链之间或存在少量错配区的“基本互补”核酸链之间。只能在完全互补核酸链间发生杂交的条件称为“严格杂交条件”或“序列特异杂交条件”。基本互补序列的稳定双螺旋体可在非严格杂交条件下获得。耐受的错配程度可通过适当调节杂交条件控制。本领域的技术人员通过考虑一些变量能凭经验可以确定双螺旋的稳定性。这些变量包括：寡核苷酸的长度和碱基对的浓度、离子强度、碱基对错配率。建立用于设计本发明的寡核苷酸或探针的严格和非严格杂交条件的定性和定量考虑事项可参见，例如， Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(4th ed.，John Wiley&Sons 1999)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)：Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach(B.D.Hames &S.J.Higgins eds.，IRL Press 1985)。

如本文所用，术语“聚合酶”是指合成核酸链或聚合物的酶，包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。优选地，本文所用的聚合酶是DNA 聚合酶。可以使用的一种聚合酶是Sequenase^TM(来源于噬菌体7 DNA 聚合酶的酶，其被修饰以改善其测序性质-参见Tabor andRicharson， Proc.Nat.Acad.Sci.USA，84:4767-4771(1987)，可购自例如United StatesBiochemical Corporation，Cleveland，Ohio)。可用于代替 Sequenase^TM的其它聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I的Klenow片段，AMV逆转录酶以及Taq聚合酶。关于可用于本文所述的方法的聚合酶的其他描述还可参见WO05024010和WO06120433，其全部内容通过引用并入本文。

通常使用的引物延伸条件是本领域已知的适合于上述聚合酶的聚合条件。在Sequenase^TM的情况下，聚合条件包括在约室温至约45℃范围内的温度；pH 7至8的缓冲液，优选pH 7.3至7.7；酶浓度为约0.01单位/微升至约1单位/微升，反应时间为约1至约20分钟，优选 1至5分钟。用于Sequenase^TM的典型缓冲液由以下组成：0.040M Tris HCl(pH7.5)0.050M氯化钠，0.010M氯化镁，0.010M二硫苏糖醇。在DNA聚合酶I的Klenow片段的情况下，这些典型的条件包括在约 10℃至约45℃范围内的温度，优选约15℃至约40℃；pH 6.8至7.4的缓冲液，优选pH 7.0至7.4；酶浓度为约0.01单位/微升至约1单位/ 微升，优选约0.02至约0.15单位/微升，反应时间为约1至约40分钟。用于DNA聚合酶I的Klenow片段的典型缓冲液由以下组成：0.05M 三羟甲基氨基甲烷氯化物，pH 7.5 0.05M氯化镁，0.05M氯化钠，0.010M二硫苏糖醇。

应当理解，这些条件仅是示例性的。当使用其它聚合酶时，应该使用最适合它们的条件，因为通常希望尽可能快地进行聚合反应。为此，通常对于逆转录酶使用42℃的温度；对于Klenow聚合酶为24℃；对于Sequenase^TM为37℃；和对于Taq聚合酶为72℃。此外，为了增强反应，特别是在使用经修饰的dNTP的情况下，使用显著过量的 dNTP(超过化学计量)或修饰其他条件如盐浓度可以是有利的。

基因组样品的制备

制备基因组样品的各种方法可用于本发明的方法中。在本发明中，基因组的制备包括消化样品中的蛋白质和RNA，提取和沉淀DNA，并将DNA(即基因组)沉淀重悬于溶液(例如水)中。通常，蛋白酶 (例如蛋白酶K)用于消化样品中包含的蛋白质，而RNase(例如RNase A)用于消化RNA。随后通过例如沉淀纯化剩余的DNA。各种 DNA纯化方法是本领域已知的，并且可以用于本发明的方法中。

3q扩增热点区域的相对拷贝数的检测

本领域已知多种技术可用于检测染色体和基因的拷贝数的改变。因此，可以使用本领域已知的检测相对拷贝数的任何方法来执行本发明的3q扩增热点区域的相对拷贝数的检测。这样的方法包括例如比较基因组杂交(CGH)、多色荧光原位杂交(M-FISH)以及实时定量 PCR(qPCR)。

在本发明的优选的实施方案中，通过实时定量PCR(qPCR)检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数。

如本文所用，术语“实时PCR”、“定量PCR”、“实时定量 PCR”和“qPCR”可互换使用，其是一种基于PCR的技术，其用于扩增并定量靶遗传物质(例如染色体、染色体区域或基因)。qPCR 能够对DNA样品中的特定序列进行检测和定量(当对DNA加入量或其它参考基因进行标准化时，能定量拷贝数的相对水平或绝对水平)。 qPCR遵循PCR的一般程序，且具有在qPCR每个循环后实时定量正在累积的所扩增DNA的额外特征。这样的定量可通过***正在积累的DNA的荧光物质或者与所扩增DNA序列互补的核酸探针的普通方法来实现，所述核酸探针与正在积累的DNA结合时产生可检测的信号。qPCR方法是本领域技术人员已知的，且描述在现有技术中，例如Sambrook and Russell,Molecular Cloning:a LaboratoryManual. Volumes 1,2and 3(2001,3^rd Edition)；“Guide to Performing RelativeQuantitation of Gene Expression Using Real-Time Quantitative PCR,”Part Number4371095,和Arya等人(2005)Expert Rev.Mol. Diagn.5:209-19,其各自通过引用整体并入本文。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过实时定量PCR (qPCR)检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数来确定受试者是否患有***或处于发展***的风险中的方法，所述方法包括：

a.提供来自所述受试者的样品，

b.检测所述样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的拷贝数，

c.检测所述样品中参考染色体区域的拷贝数，和

d.将所述3q扩增热点区域相对于所述参考染色体区域的拷贝数进行归一化，从而获得所述3q扩增热点区域的相对拷贝数，

其中与对照样品中3q扩增热点区域的相对拷贝数相比，所述受试者的样品中3q扩增热点区域的相对拷贝数的升高指示所述受试者患有***或处于发展***的风险中。

在具体的实施方案中，所述3q扩增热点区域包含3q26.2至3q29 的染色体区域。

本发明人还发现，位于热点区域的3q29上(从197042560bp到 197299272bp)的DLG1基因特别适合用于表征3q扩增热点区域的拷贝数扩增，从而特别适合用于诊断***。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了表征来自所述受试者的样品中3q扩增热点区域的拷贝数扩增的方法，其包括检测所述样品中 DLG1基因的相对拷贝数，其中与对照样品中DLG1基因的相对拷贝数相比，所述受试者的样品中DLG1基因的相对拷贝数的升高指示所述3q扩增热点区域的拷贝数发生扩增。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过实时定量PCR(qPCR) 检测DLG1基因的相对拷贝数来确定受试者是否患有***或处于发展***的风险中的方法，所述方法包括：

a.提供来自所述受试者的样品，

b.检测所述样品中DLG1基因的拷贝数，

c.检测所述样品中参考染色体区域或参考基因的拷贝数，和

d.将所述3q扩增热点区域相对于所述参考染色体区域的拷贝数进行归一化，从而获得所述3q扩增热点区域的相对拷贝数，

其中与对照样品中DLG1基因的相对拷贝数相比，所述受试者的样品中DLG1基因的相对拷贝数的升高指示所述受试者患有***或处于发展***的风险中。

试剂和试剂盒

本发明还涉及用于检测***的试剂或试剂盒，其包含用于检测相对拷贝数所必需、足够或有用的试剂(例如，引物、染料或探针、聚合酶、核苷酸、缓冲液、对照、说明书等)。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括用于目的染色体区域(或基因)和参考染色体区域(或基因)的扩增的引物。在一些实施方案中，试剂盒包括分析软件(例如，以分析扩增数据)。

如前文所述，可以使用本领域已知的检测相对拷贝数的任何方法来执行本发明的3q扩增热点区域的相对拷贝数的检测。本领域技术人员能够根据具体的检测方法来确定用于检测受试者的样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数的试剂。这样的试剂也是本领域所熟知的。

例如，在通过qPCR来检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数的实施方案中，用于检测3号染色体上的3q扩增热点区域的相对拷贝数的试剂包括用于通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中3号染色体上的3q扩增热点区域的拷贝数的试剂，和用于通过实时定量PCR(qPCR)检测所述样品中参考染色体区域的拷贝数的试剂。

用于qPCR的试剂典型地可以包括例如聚合酶、游离的核苷酸(例如dNTP)、缓冲液、荧光染料(例如SYBR green)或荧光报告探针 (例如Taqman探针)以及正向和反向引物。

在具体的实施方案中，试剂盒可以包含与3q扩增热点区域上的靶核酸序列杂交的正向引物P1和反向引物P2以及与所述参考染色体区域上的靶核酸序列杂交的正向引物P3和反向引物P4。在具体的实施方案中，除了上述引物以外，试剂盒还包含可以引物、2×SYBRGreen qPCR Mix、去离子水和对照样品中的一种或几种。

在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，其包含引物、探针、聚合酶、核苷酸、缓冲液、对照等。在一些实施方案中，试剂盒的各组分包装在分开的容器中。在一些实施方案中，容器在同一试剂盒或箱内包装和/或运输以一起使用。在一些实施方案中，试剂盒的一个或多个组分分开运输和/或包装。

本发明的有益技术效果

本发明人令人惊讶地发现，在所有检测的***患者中，都能够检测到如本文所述的3q扩增热点区域的拷贝数的扩增。而三号染色体上在如本文所述的3q扩增热点区域之外的染色体区域的拷贝数扩增则不能在所有***患者中检测到。因此，如本文所述的3q扩增热点区域的相对拷贝数可用于检测受试者中的***。

本发明人还发现可以通过对DLG1基因进行qPCR拷贝数检测来判断3q扩增热点区域的扩增情况，从而检测***。qPCR的方法不仅能够准确检出***3q扩增，而且降低了实验成本，缩短了检测周期。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：来自***患者的样本中3q染色体的拷贝数扩增

本发明人发现，一部分携带3q突变的***样本是3q整臂扩增突变(图1A-B)，其他的会发生3q部分染色体扩增突变，扩增的区域和程度各不相同(图1C-F)。但所有样本都会包含3q端粒端从3q26.2 到3q29大小30M左右的区域，我们把这个区域定义为***3q扩增热点，我们以这个热点区域的相对拷贝数作为判断***的一个标准。

实施例2：qPCR检测DLG1基因的相对拷贝数

引物设计

选择CNV发生较少的4号染色体上的ALB基因(4q13.2， 73404255..73421412)为参考基因。引物列表如下：

表1 qPCR引物

使用上述两对引物分别可以扩增出长度为200bp(DLG1)和210bp大小的片段。

qPCR实验设计：

应用以下步骤：

(1)提取待测患者的基因组DNA；

(2)以待测患者的基因组DNA为模板，利用引物进行实时荧光定量PCR检测3q的CNV；

(3)通过对待测样本和对照样本的TERC及参考基因ALB进行相对定量，得到Ct值，然后根据2^-△△Ct方法统计检测样本候选基因的拷贝数，如果拷贝数为等于或大于2，则认为待测患者存在3q扩增；如果拷贝数为1，则待测患者为正常。

步骤(2)中进行实时荧光定量PCR所使用的扩增体系为20μl，组分列表如下：

表2 qPCR组分

组分	体积
		10ng/μl模板DNA	1μl
10pmol/μl正向引物	1μl
		10pmol/μl正向引物	1μl
2×SYBR Green qPCR Mix	10μl
		去离子水	7μl

待测样本的DLG1和ALB各做三个重复，对照样本的DLG1和 ALB同时各做三个重复。

进行实时荧光定量PCR采用的反应条件：

表3 qPCR反应条件

具体实验：

a.基因组DNA提取：

本实验采用Qiagen凯杰的mini kit进行基因组DNA的提取，具体操作如下：

1)将样本转移至新的50ml离心管中1600xg离心10min，弃上清，不要吸到沉淀。

2)向样本中加入1ml PBS,将沉淀重悬，转移至新的2ml离心管中，1600xg离心5min，弃上清，不要吸到沉淀。

3)向样本中加入400ul PBS重悬沉淀。转移200ul到新的2ml 离心管中。

4)剩余样本至于-80℃保存

5)向离心管的底部加入3μL的RNase A，室温孵育2min。

6)向离心管的底部加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)和200ul AL，稍微涡旋混匀2-3s，在56℃中孵育10min.(如果没有裂解完全，可以延长裂解时间)

7)向离心管的底部入200μL无水乙醇，迅速混合均匀，瞬时离心

8)将所有液体转移到Qiagen吸附柱上(吸附柱放在收集管里) 8000rpm离心1min倒掉废液，吸附柱放回收集管；

9)向吸附柱中加入500uL Buffer AW1，8000rpm离心30S，倒掉废液，放回收集管；

10)向吸附柱中加入600uL Buffer AW2，8000rpm离心30s，倒掉废液，放回收集管；

11)将吸附柱放在一个新的2mL收集管中，14000rpm离心3 min，彻底去除残余液体。

12)将吸附柱放入一个新的标记了样本编号和提取信息的 1.5mlEP管中，向吸附膜中央悬空加70uL Buffer TB，56℃孵育 2-5min，14000rpm离心1min收集DNA。

提取后DNA浓度测定使用Thermo Fisher的Qubit3.0。

b.目标基因和参考基因区域的扩增：

通过对健康人DNA进行常规PCR来确定引物扩增的特异性，通过qPCR扩增检测引物的扩增曲线来确定引物是否适用于qPCR分析。从胶图上来看条带单一且明亮，大小吻合，无引物二聚体和非特异性扩增出现(图1)可以用于后续qPCR扩增测试。目标序列和参考序列的引物配合稀释到10ng/ul浓度健康人DNA模板进行qPCR 时，其扩增曲线基本吻合在一起，且曲线走势平滑(图2)。

使用博日科技的9600plus定量PCR仪对5例经组织病理学确诊***的患者的脱落细胞样本和正常人的脱落细胞样本进行检测，每个样本使用10ng基因组DNA作为模板，SYBR Green试剂采用Qiagen 凯杰的QuantiFast系列进行定量PCR，PCR反应体系和条件见表2和3。

c.结果分析：

每个样本设置三个重复孔，重复之间Ct值差异如果超过1(1个循环)，将被剔除出实验分析。拷贝数分析过程如下：1、首先计算待测样本和对照样本的目基因的平均Ct值，同时计算对应内参基因Ct平均值；2、用待测样本的目的基因平均Ct值减去对照样本目的基因的平均Ct值，即为目的基因△Ct，参考基因的△Ct用同样算法计算；3、计算△△Ct＝△Ct(目的基因)-△Ct(参考基因)；4、待测样本目的基因的拷贝数＝2^-△△Ct。

当2^-△△Ct计算出的数值为1左右时，待测样本3q正常，无相对拷贝数。经2^-△△Ct计算出的数值为0.5左右，则认为3q存在拷贝数缺失。经2^-△△Ct计算出的数值为1.5左右，则认为3q拷贝数增加一个拷贝(拷贝数为3)，如果经2^-△△Ct计算出数值在4左右，认为3q拷贝数增加两个拷贝(拷贝数为4)；3q拷贝数进一步扩增情况以此类推。

d.上述方法用于检测***阳性样本

实验对象选择4例经组织病理学确诊***的患者，其全部来自于北京协和医院。所有样本都使用拷贝数变异检测芯片确认了3q的扩增，但3q扩增的程度各不相同。从对比结果表4来看，本发明的qPCR 方法能够很好的反映芯片检测的3q拷贝数的扩增情况，对于不同程度的扩增，能够给出相应的拷贝数，最高甚至84个拷贝。而且对于拷贝数扩增程度很低的阳性样本4，qPCR方法也能可以精确检出，说明低至两个拷贝也能检测出，所以本方法的检测下限是双拷贝。

表4 qPCR和芯片比较

注：芯片结果1为正常，即3q不存在相对拷贝数；大于1 为3q拷贝数增加。