阅读说明：本技术 Arl14作为肿瘤标志物在制备预测肺腺癌预后及靶点药物中的用途 (Application of ARL14 as tumor marker in preparation of medicine for predicting lung adenocarcinoma prognosis and target spot ) 是由 邵春林 郭飞 潘燕 张江虹 朱琳 张俊伶 于 2018-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学技术领域,涉及ARL14作为肿瘤标志物在制药中的新用途,本申请经实验显示,ARL14通过KRAS/CIDEC/ERK/p38信号通路调控肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,影响细胞周期分布,并与细胞休眠密切相关以及显示γ射线照射对休眠细胞损伤作用微弱；结果表明,ARL14可作为临床肺腺癌治疗靶点和预后评估的指标,或成为临床肺腺癌患者放疗指针,所述的ARL14作为肿瘤标志物可用于制备预测肺腺癌尤其是针对肺腺癌细胞预后的试剂及靶点药物。(The invention belongs to the technical field of biomedicine, and relates to a new application of ARL14 in pharmacy as a tumor marker, and experiments show that ARL14 regulates and controls the proliferation, migration and invasion of lung adenocarcinoma cells through a KRAS/CIDEC/ERK/p38 signal channel, influences the cell cycle distribution, is closely related to cell dormancy and shows that gamma-ray irradiation has weak damage effect on dormant cells; the result shows that ARL14 can be used as an index for clinical lung adenocarcinoma treatment target and prognosis evaluation or a clinical lung adenocarcinoma patient radiotherapy pointer, and ARL14 can be used as a tumor marker for preparing a reagent and a target medicine for predicting lung adenocarcinoma, particularly lung adenocarcinoma cell prognosis.)

ARL14作为肿瘤标志物在制备预测肺腺癌预后及靶点药物中 的用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及ARL14作为肿瘤标志物在制药中的新用途，特别涉及ARL14在制备预测肺腺癌预后及靶点药物中的用途；本发明涉及ARL14表达与肺腺癌的增殖、迁移、侵袭、辐射敏感性和预后的关系及其机制，更具体的说是ARL14可用于制备预测肺腺癌预后的试剂及靶点药物。

背景技术

现有技术公开了肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，该疾患在全世界普遍流行患病，且其每年发病率和死亡率逐渐增加，据统计显示，肺癌的死亡率位居所有癌症死亡的榜首。据研究报道，根据生物学特点的差异，可将原发性肺癌分为非小细胞型肺癌和小细胞型肺癌；临床上常见的是非小细胞型肺癌，占80％～85％左右，如鳞形细胞癌、未分化癌、腺癌和肺泡细胞癌等，其5年生存率仅为15％左右；因为早期缺乏特异性检测指标和诊断方法，确诊时70％-80％的患者已出现远处转移，失去手术机会。有流行病学研究发现，肺腺癌是临床上较为常见的一种原发性肺癌，且其不同分型的影像学和病理学特点有一定的差异。一份来自美国的肺癌流行病学调查报告显示，肺腺癌的患病率占肺癌总患病率的40％左右，是美国肺癌发病率最高的一种临床类型。调查显示，肺腺癌发病人群逐渐趋向年轻化，尤其是女性人群，而且肺腺癌在早期阶段极易通过血液系统进行传播，因此，肺腺癌的临床治疗效果和预后效果要比肺鳞形细胞癌差。因此，探索肺癌发病机制，寻找肺癌相关特异性生物标志和治疗靶点，有效地预防和治疗手术后肺癌的复发和转移，尤其是肺腺癌，已成为医疗实践中亟待解决地重要问题。

近年来，随着经济的发展和科技的进步，高通量测序技术在生命科学领域得到普遍应用，以及越来越多肿瘤学数据库的涌现和公开，使得该项工作变得更为方便和简单。基于此，本发明的研究团队通过对TCGA(The Cancer Genome Atlas)公共数据库进行数据挖掘，进行了全基因组范围内mRNA与肺腺癌预后的相关性探索，拟发现影响肺腺癌预后的mRNA，为肺腺癌预后相关标志物的研究提供理论基础和科学依据。

基于现有技术的基础，本发明拟提供ARL14作为肿瘤标志物在制备预测肺腺癌预后及靶点药物中的用途，经检索PubMed及相关数据库表明，迄今ARL14在肿瘤中的功能尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供ARL14作为肿瘤标志物在制药中的新用途，特别涉及ARL14在制备预测肺腺癌预后及靶点药物中的用途；本发明涉及ARL14表达与肺腺癌的增殖、迁移、侵袭、辐射敏感性和预后的关系及其机制，所述的ARL14作为肿瘤标志物可用于制备预测肺腺癌(尤其是针对肺腺癌细胞)预后的试剂及靶点药物。

本发明通过TCGA数据库筛选出10对在肺腺癌组织及其对应的癌旁正常组织中差异表达的mRNA与肺腺癌预后相关，并通过实验检测表明ARL14在肺腺癌细胞中的表达明显高于肺正常细胞中的表达；

本发明中，检测时，首先利用TCGA数据库分析肺腺癌组织以及癌旁正常组织中mRNA的表达差异，发现ARL14在肺腺癌组织中的表达高于癌旁正常组织；其次，利用TCGA数据库分析ARL14表达水平对肺腺癌预后的影响，发现ARL14高表达，预后较差；通过细胞学实验检测，证实了ARL14在肺腺癌细胞表达水平高于肺正常细胞，与肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和辐射抵抗等活动相关；结果表明，ARL14可作为判断肺腺癌预后的筛选标志物，可用于制备肺腺癌放疗适应症的诊断制剂。

本发明中，采用CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖和存活能力，发现敲低ARL14基因表达可显著抑制肺腺癌细胞的增殖和克隆形成能力，但是对肺正常细胞的增殖和克隆形成能力没有影响；同时，敲低ARL14基因表达可增强肺腺癌细胞的辐射抵抗性；以Transwell法检测迁移和侵袭能力，发现敲低ARL14基因表达后，肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力减弱，但可轻度增强受辐射细胞的迁移和侵袭能力，这从另一个角度说明，ARL14低表达肺腺癌细胞的辐射抵抗性增加。

本发明中，采用流式细胞术检测细胞周期和免疫荧光技术检测Ki67，进行ARL14低表达抑制肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和辐射敏感性的探究，结果显示，敲低ARL14表达后，肺腺癌细胞中G0/G1期细胞比例增加，照射24h后，G2/M期阻滞程度减弱，Ki67阳性细胞数比例减少；而敲低CIDEC基因表达后肺腺癌细胞中G0/G1期细胞比例减少，S期和G2/M期细胞比例增加，表明CIDEC与ARL14可能呈负相关，明确了ARL14通过诱导肺腺癌细胞进入G0期而出现休眠现象，从而导致增殖、迁移和侵袭等活动减少，逃避放疗，实验结果为相关的基础和临床研究提供了新的思路。

本发明中，采用Western blot技术进行了ARL14/CIDEC表达发生改变时ERK/p38信号通路的研究，结果显示，敲低ARL14表达后细胞中ERK1/2、p38、p16、p21、p27、p53、CyclinD1的蛋白和磷酸化水平明显上调，CIDEC的mRNA和蛋白水平均升高；而敲低CIDEC表达的细胞中ERK1/2、p38、p16、p21、p27、p53、Cyclin D1蛋白和磷酸化水平明显下调，表明ARL14和CIDEC均可以激活ERK/p38信号通路，CIDEC是ARL14的下游负相关基因，实验结果表明，ARL14可作为筛选治疗肺腺癌的药物的药靶。

本发明中，采用qRT-PCR和Western blot技术检测KRAS基因表达发生改变对ARL14表达的影响，结果显示，敲低KRAS基因表达水平可使细胞中ARL14的mRNA和蛋白水平均明显上调，由于KRAS是非小细胞肺癌最常见的驱动基因，结果表明，ARL14可作为肺腺癌预后情况的判断指标和筛选治疗肺腺癌的药物的药靶。

本发明提供了ARL14作为肿瘤标志物在制药中的新用途，所述的ARL14作为肿瘤标志物可用于制备预测肺腺癌(尤其是针对肺腺癌细胞)预后的试剂及靶点药物。

附图说明

图1，ARL14在肺腺癌组织和癌旁正常组织中的表达。

图2，ARL14在肺腺癌中的预后意义。

图3，ARL14在肺腺细胞和肺正常细胞中的表达。

图4，抑制ARL14表达对肺腺癌细胞和肺正常细胞增殖能力的影响，其中，

图A和B分别为qRT-PCR和western blot方法检测ARL14干扰片段在A549和PC9细胞中的干扰效率；图C和D分别为CCK8法检测抑制ARL14表达对A549和PC9细胞增殖能力的影响；图E为抑制ARL14表达对A549和PC9细胞克隆形成能力的影响；图F和G分别为qRT-PCR和western blot方法检测ARL14干扰片段在MRC-5和BEAS-2B细胞中的干扰效率；图H和I分别为CCK8法检测抑制ARL14表达对MRC-5和BEAS-2B细胞增殖能力的影响；图J为抑制ARL14表达对MRC-5和BEAS-2B细胞克隆形成能力的影响；图K和L为CCK8法检测抑制ARL14表达对A549和PC9照射后4天的增殖情况的影响。

图5，抑制ARL14表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，其中，

图A和B分别为Transwell法检测抑制ARL14表达对A549和PC9细胞迁移和侵袭能力的影响。

图6，抑制ARL14表达对肺腺癌细胞增殖标志物Ki67及相关信号蛋白的影响，其中，图A为免疫荧光法检测抑制ARL14表达对Ki67表达的影响；图B为Ki67免疫荧光实验的定量分析；图C和D分别为western blot方法检测抑制ARL14表达对A549和PC9细胞中ERK和p38以及下游的p16、p21、p27、p53和Cyclin D1的蛋白和磷酸化水平的影响。

图7，CIDEC是ARL14的下游基因。其中图A和B分别为qRT-PCR和western blot方法检测抑制A549和PC9细胞中ARL14表达对CIDEC的mRNA和蛋白表达水平的影响。

图8，抑制CIDEC表达对肺腺癌细胞和肺正常细胞增殖能力的影响，其中，

图A和B分别为qRT-PCR和western blot方法检测CIDEC干扰片段在A549和PC9细胞中的干扰效率；图C和D分别为CCK8法检测抑制CIDEC表达对A549和PC9细胞增殖能力的影响；E为抑制CIDEC表达对A549和PC9细胞克隆形成能力的影响；图F和G分别为qRT-PCR和western blot方法检测CIDEC干扰片段在MRC-5和BEAS-2B细胞中的干扰效率；图H和I分别为CCK8法检测抑制CIDEC表达对MRC-5和BEAS-2B细胞增殖能力的影响；图J为抑制CIDEC表达对MRC-5和BEAS-2B细胞克隆形成能力的影响；图K和L为CCK8法检测抑制CIDEC表达对A549和PC9照射后4天的增殖情况的影响。

图9，抑制CIDEC表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，其中，

图A和B分别为Transwell法检测抑制CIDEC表达对A549和PC9细胞迁移和侵袭能力的影响。

图10，抑制CIDEC表达对细胞休眠休眠相关蛋白的影响，其中，

图A和B分别为western blot方法检测抑制CIDEC表达对A549和PC9细胞中ERK和p38以及下游的p16、p21、p27、p53和Cyclin D1的蛋白和磷酸化水平的影响。

图11，KRAS是ARL14的上游基因，其中，

图A和B分别为qRT-PCR和western blot方法检测KRAS干扰片段在A549和PC9细胞中的干扰效率；图C和D分别为qRT-PCR和western blot方法检测抑制A549和PC9细胞中KRAS表达对ARL14的mRNA和蛋白表达水平的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体的实施方案进行详述。除非特别说明，本发明中所涉及的技术手段均为本领域内的技术人员所公知的方法。此外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域内的技术人员而言，在不违背本发明的实质和范围的前提下，对本发明涉及的试剂进行成分和用量的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所涉及细胞及试剂均在市场上有销售。

本发明中所涉及：

1.方法

1.1 细胞系

人支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞由南京医科大学惠赠；人胚胎成纤维细胞株MRC-5细胞以及人肺腺癌细胞株A549细胞均购于中国科学院上海细胞库；人肺腺癌细胞株PC9细胞均由复旦大学生命科学学院惠赠。

1.2 主要试剂

胎牛血清购于美国Gibco公司；DMEM和α-MEM培养基购于美国Gibco公司，SYBRGreen PCR试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；Transwell小室及配套24孔板购于康宁生命科学有限公司；qRT-PCR的引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成，纯化方式为PAGE；ARL14、CIDEC和KRAS的siRNA购于广州市锐博生物科技有限公司；β-actin、p-p21、p-p27、p38以及ARL14抗体购于英国abcam公司；ERK、p-ERK、p27、p53、p-p53、p-p38以及Ki67购于美国CST公司；p16、p21以及Cyclin D1抗体购于美国Santa Cruz公司；p-p16和p-CyclinD1抗体购于美国SAB公司；CIDEC和KRAS美国protein-tech公司；Alexa594 goatanti-mouse IgG(H+L)(荧光二抗)购于美国Life Technology公司；细胞周期检测试剂盒购于美国BD公司；CCK-8检测试剂盒、DAPI Fluromount-GTM、预染三色蛋白Marker购于上海翊圣生物技术有限公司。

1.3 细胞培养

人肺腺癌细胞株A549和PC9以及人肺正常细胞BEAS-2B和MRC-5的培养条件为含有10％胎牛血清的DMEM或α-MEM培养基，37℃下在含有5％C0₂的培养箱中培养。

1.4 细胞转染

用ARL14/CIDEC/KRAS的siRNA瞬时转染BEAS-2B、MRC-5、A549和PC9细胞，其干扰序列如表1所示。

表1 siRNA干扰序列

1.5 qRT-PCR基因检测

qRT-PCR检测转染细胞中ARL14、CIDEC和KRAS的表达，转染后48h收集各组细胞，利用柱式离心法提取细胞中总RNA，用Nano Vue核酸蛋白检测仪定量检测。RNA样品用逆转录反应合成cDNA后，用SYBRGreen PCR试剂盒检测样本中ARL14、CIDEC和KRAS含量，其引物序列如表2所示，反应条件为95℃预变性30s，95℃、5s，55℃、30s；72℃、1min，40个循环，反应结束后得到各个样本ARL14、CIDEC、KRAS和内参β-actin的基本循环数(Ct值)。根据公式计算目的基因相对含量，即为ARL14、CIDEC和KRAS相对含量，实验重复三次。

表2 基因引物序列

1.6 CCK8法检测细胞增殖和辐射敏感性

每种细胞设置对照组和实验组。将处于对数生长期的对照组和实验组的细胞株，胰蛋白酶消化，稀释细胞使其浓度为5×10³个细胞/ml培养液，分别取200ul至96孔培养板，每种细胞每块板接种6个同样的孔作为复孔，1×10³个细胞/孔，以200μl培养液做空白对照，放置5％CO₂、37℃恒温细胞培养箱中继续培养。接种第1、2、3、4和5天，完全弃去旧的培养液，每孔加入反应液(培养液∶CCK8试剂＝10∶1)110μl。在细胞培养箱放置2h，然后利用酶标仪检测在450nm波长下各样品孔的吸光度(OD)值。各检测样品孔OD₄₅₀值减去空白孔OD₄₅₀均值，就是各检测样品孔的有效OD₄₅₀值，然后计算各组样品孔OD₄₅₀均值记录每块板的数值，制作细胞生长曲线。若接种细胞数为1.5×10³～2.5×10³个细胞/孔，在照射后第4天检测，计算相对增殖率，可以反映细胞辐射敏感性。

1.7 克隆形成实验

每种细胞设置对照组和实验组。将处于对数生长期的对照组和实验组的细胞株，胰蛋白酶消化，稀释细胞使其浓度为2.5×10²个细胞/ml培养液，分别取1ml至已加入2ml培养液的6孔培养板中，每组处理均设置3个平行样，放置5％CO₂、37℃恒温细胞培养箱中继续培养10～14天。

1.8 Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力

实验前24h将不同分组的细胞换成无血清DMEM培养基，并将24孔板和Transwell小室以及所用EP管和枪头放置-20℃冰箱，同时BD matrigel放于4℃冰箱中过夜；用预冷的无血清DMEM培养基按1∶40的比例稀释matrigel基质并混匀；在transwell小室的上室中央垂直加入110μl稀释的matrigel(3个平行样)，避免产生气泡，然后放置5％CO₂、37℃细胞培养箱孵育至少2h，使之凝固；消化细胞，用无血清DMEM培养基洗涤并重悬细胞，稀释到1～1.4×10⁵/ml个细胞/ml，每个小室加入0.5ml细胞悬液(5～7×10⁴/室)，同时下室加入0.9ml含10％胎牛血清的DMEM培养基，每组处理均设置3个平行样，置于37℃培养箱中培养24h；每孔加入0.8ml甲醇溶液，室温固定30min；吸去固定液，用1×PBS洗涤3次，每孔加0.8ml结晶紫染色液，室温染色30min，清水清洗3次；用1×PBS预湿的棉签小心擦去transwell小室内没有侵袭到小室下表面的细胞，晾干，置于显微镜下观察和拍照。

细胞迁移能力检测方法同细胞侵袭能力，只是不用铺胶。

1.9 免疫荧光实验

将生长至对数期的细胞，用含0.25％EDTA的胰酶消化并计数，接种到8孔细胞培养板中载玻片，根据不同细胞系视情况调整细胞浓度至每孔2～4×10⁴个；转染48h时，1×PBS(4℃预冷)清洗三次，然后每孔加入0.2ml免疫染色固定液，室温固定15min，1×免疫染色洗涤液清洗三次；每孔加入0.2ml免疫染色通透液，室温静置15min，1×免疫染色洗涤液清洗三次；每孔加入0.2ml免疫染色封闭液，放摇床上，室温下缓慢晃动1～2h；用免疫染色一抗稀释液按1∶500的比例配制Ki67的一抗，每孔加入0.2ml稀释好的Ki67一抗，然后放置4℃冰箱中过夜；1×免疫染色洗涤液清洗三次，然后用免疫荧光染色二抗稀释液按1∶100的比例配制Alexa594 goat anti-mouse IgG(H+L)二抗，每孔加入0.2ml稀释好的二抗，放置摇床上，室温避光，缓慢晃动1～2h；弃尽二抗，1×免疫染色洗涤液清洗三次；使用载玻片配套的工具小心撬开载玻片，保留底部，加入适量DAPI Fluromount-GTM，盖上盖玻片，然后用无纺纱布轻轻按压，室温避光染色5min；在Zeiss Axioplan型正置荧光显微镜下进行观察，40倍镜下观察，随机选取至少10个视野拍照，图像采用ZEN 2处理并合成。

1.10 细胞周期实验

将生长至对数期的细胞用含0.25％EDTA的胰酶消化并计数，接种到六孔细胞板中，根据不同细胞系视情况调整细胞浓度至每孔2.5～4×10⁵个；转染48h时后进行γ射线照射，照射后24h开始收集细胞，首先将培养液收集在15ml离心管中，1×PBS清洗三次，也加入收集培养液的15ml离心管中；然后用含0.25％EDTA的胰酶消化细胞至可以被用加样枪轻轻吹打下来时，加入新的培养液终止消化，轻轻吹打下所有的贴壁细胞并吹散，然后收集到相应的上述同一离心管中；4℃离心，1000r/min×10min，PBS清洗三次，转移至1.5ml EP管中；用加样枪小心吸掉上清，然后沿管壁缓慢加入1ml预冷的70％乙醇，轻轻弹击1.5ml EP管的底部使细胞分散均匀，避免成团，放置-20℃冰箱过夜；4℃离心，12 000r/min×10min，PBS清洗三次，用加样枪小心吸掉上清，然后加入0.5ml PI染液，混匀，室温避光染色30min；按照仪器操作说明进行流式检测，采用的激发光波长488nh。

1.11 Western blot实验

Western blot检测转染细胞中相关蛋白的表达，转染后48h收集各组细胞，利用RIPA裂解液(强)提取细胞中总蛋白并进行BCA蛋白定量，然后加入0.25倍体积的5×loading buffer，混匀，煮沸法进行蛋白变性。SDS-PAGE电泳条件：根据蛋白相对分子量的大小配制适宜浓度的分离胶和5％的浓缩胶，每孔加入等量经过变形处理的蛋白样本，样品两侧的孔内加入预染三色蛋白Marker；打开电源，将电压设置到60V恒压，当待测样本的蛋白跑至分离胶时调换至100V，待Marker最下面蓝色条带距离胶底1cm左右，终止电泳。转膜条件：冰水浴，100V，1～2.5h(具体时间根据目的蛋白相对分子量大小进行调整)，封闭条件：放入1×TBST配制的封闭液(5％脱脂奶粉)，放置水平摇床上，室温下缓慢晃动2h。一抗孵育条件：按照说明书(1∶1000)用一抗稀释液配制相应的一抗孵育液，4℃孵育过夜。二抗孵育：回收多余一抗，1×TBST清洗三次；按照说明书(1∶4000)用1×TBST配制所需体积二抗孵育液，浸没目的条带，放置垂直摇床上，室温下上下缓慢晃动2h。显影：1×TBST清洗三次，按照说明书配制化学发光底物(A液∶B液＝1∶1)，使其均匀覆盖目的条带膜表面，启动化学发光成像系统，进行显影成像，最终使用Quantity One软件分析所有检测目标条带的灰度值。

2.统计学处理

实验结果均为3～5次重复实验的平均值，采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，Student’s-t检验进行统计分析，P＜0.05则认为差异具有统计学意义。

实施例1

ARL14在临床样本中和细胞水平的表达情况

利用TCGA数据库分析发现ARL14在肺腺癌组织中的表达高于癌旁正常肺组织(图1)，进一步的生存分析显示ARL14高表达的肺腺癌预后较差(图2)；qRT-PCR检测发现，ARL14在肺腺癌细胞中的表达高于肺正常细胞(图3)。

实施例2

抑制ARL14表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

CCK8和克隆形成实验显示，siARL14转染的A549和PC9细胞的增殖速度、克隆形成能力以及辐射敏感性远远低于对照组(图4A-E和4K-L)，但是抑制MRC-5和BEAS-2B正常肺细胞中ARL14的表达，生长速度和克隆形成能力都没有显著改变(图4F-J)，表明ARL14可能成为临床上肺腺癌治疗的靶点，在治疗肺腺癌的同时，对周围正常组织影响不大；

除了采用siRNA手段瞬时降低ARL14表达，还构建ARL14敲除载体转染肺腺癌细胞筛选稳定细胞株。96孔板筛选单克隆细胞(有限稀释法)发现ARL14敲除载体转染的肺腺癌细胞的克隆形成率极低(＜5％)，且较长时间(超过3个月)汇合度达不到50％，说明ALR14基因的敲除极大地抑制了肺腺癌细胞的增殖，这从另一个角度说明ARL14可能成为临床上肺腺癌预后的指标和治疗的靶点；

如图5所示，γ射线照射和抑制ARL14表达均有效抑制A549和PC9细胞的迁移和侵袭能力；但是，γ射线照射并不能抑制siARL14转染的A549和PC9细胞的迁移和侵袭能力，甚至有轻微增加趋势，这说明ARL14可能影响肺腺癌的转移，并成为临床上肺腺癌放疗的指针。

实施例3

抑制ARL14表达影响细胞增殖、迁移和侵袭的机制

采用流式细胞术检测A549和PC9细胞周期各时期情况，如表3所示，γ射线照射24h后，A549和PC9细胞的对照组和siARL14转染组均发生G2/M期阻滞，但是siARL14转染组细胞的周期阻滞程度远远小于对照组。此外，对未照射A549细胞，siARL14转染组G0/G1期细胞比例多于对照组。这说明抑制ARL14表达减弱γ射线照射诱导的G2/M期阻滞，甚至有可能诱导细胞积聚在G0/G1期；

采用免疫荧光方法检测A549和PC9细胞中Ki67表达情况，发现ARL14表达的降低导致A549和PC9细胞中Ki67阳性细胞数减少(图6A和B)，证实了抑制ARL14表达可能诱导A549和PC9细胞进入G0期，出现休眠状态，从而阐明ARL14低表达细胞增殖、迁移、侵袭以及γ射线照射效应减弱的原因；

Western blot结果显示，抑制ARL14表达，A549和PC9细胞中的ERK1/2和p38的总蛋白和磷酸化水平均增加(图6C)，p53、p27、p16和Cyclin D1的总蛋白和磷酸化水平也均增加，而p21的总蛋白和磷酸化水平，则是在A549细胞中增加，PC9细胞中减少(图6D)，这说明抑制ARL14的表达导致A549和PC9细胞中的ERK和p38同时激活，从而激活下游的p16、p21、p27、p53和Cyclin D1，诱导细胞进入G0期，出现休眠现象。

实施例4

CIDEC是ARL14的下游基因

GESA分析TCGA数据库中肺腺癌数据发现，CIDEC与ARL14正相关。运用qRT-PCR和western blot方法检测发现，siARL14转染的A549和PC9细胞中CIDEC的mRNA和蛋白水平均增加(图7)，CCK8和克隆形成实验显示，siCIDEC转染的A549和PC9细胞的增殖速度、克隆形成能力以及辐射抵抗性远远高于对照组(图8A-E和8K-L)，但是抑制MRC-5和BEAS-2B细胞中CIDEC的表达，生长速度和克隆形成能力都没有显著改变(图8F-J)，这表明CIDEC也可能成为临床上肺腺癌治疗的靶点，在治疗肺腺癌的同时，对周围正常组织影响不大；Transwell实验显示，siCIDEC转染的A549和PC9细胞的迁移和侵袭能力在照射前后均高于对照组(图9)；细胞周期检测结果显示，siCIDEC转染的A549细胞的G0/G1期细胞比例减少，S期细胞比例增加，γ射线照射诱导的G2/M期阻滞程度远远小于对照组，而siCIDEC转染的PC9细胞的G0/G1期细胞比例减少，S期和G2/M期细胞比例均增加，γ射线照射诱导的G2/M期阻滞程度与对照组相似(表3所示)，Western blot结果显示，抑制CIDEC的表达，A549和PC9细胞中的ERK和p38以及下游的p16、p21、p27、p53和CyclinD1的蛋白和磷酸化水平均增加(图10)，以上实验表明，CIDEC可能是ARL14的下游基因，并与ARL14在增殖、迁移和侵袭等活动中的作用相反。

表3 基因干扰对细胞周期分布的影响

实施例5

KRAS是ARL14的上游基因

运用qRT-PCR和western blot方法检测发现，siKRAS转染的A549和PC9细胞中ARL14的mRNA和蛋白水平均增加(图11)，结合文献报道RAS-RAF-ERK信号通路以及KRAS在肺癌发展中的决定性作用，表明KRAS可能是ARL14的上游基因。

綜上，本申请经实验显示，ARL14通过KRAS/CIDEC/ERK/p38信号通路调控肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，影响细胞周期分布，并与细胞休眠密切相关；此外，还显示γ射线照射对休眠细胞损伤作用微弱；结果表明，ARL14有成为临床肺腺癌治疗靶点和预后评估的指标，也可成为临床肺腺癌患者放疗指针，通过设计针对ARL14的单克隆抗体等方法沉默ARL14基因的表达，并在此基础上开发有关药物，有助于阻止或延迟患者肺腺癌进展，达到改善患者预后的目的。