阅读说明：本技术 一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用 (Mutant gene for breast cancer auxiliary diagnosis and application thereof ) 是由 沈洪兵 胡志斌 马红霞 江玥 闻洋 于 2015-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程及肿瘤医学领域,公开了一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用。该突变基因具有下列一个或多个突变位点：与正常BRCA1基因序列相比具有g.41215910delA、g.41244291delT、g.41223130A>T、g.41256139T>A突变位点；与正常BRCA2基因序列相比具有g.32912699A>G、g.32912799T>C、g.32929399dupT、g.32911757C>T、g.32911659-32911662delAAAA、g.32910963T>G等突变位点。本发明提供了乳腺癌致病的突变位点组合,可用于早期诊断乳腺癌。(The invention belongs to the field of genetic engineering and tumor medicine, and discloses a mutant gene for breast cancer auxiliary diagnosis and application thereof. The mutant gene has one or more of the following mutation sites: compared with the normal BRCA1 gene sequence, the gene has g.41215910delA, g.41244291delT, g.41223130A > T and g.41256139T > A mutation sites; compared with the normal BRCA2 gene sequence, the mutant sites of g.32912699A > G, g.32912799T > C, g.32929399dupT, g.32911757C > T, g.32911659-32911662delAAAA, g.32910963T > G and the like are provided. The invention provides a mutation site combination for breast cancer pathogenesis, which can be used for early diagnosis of breast cancer.)

一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用

本申请是分案申请，原申请的申请号为201510297157X，申请日为2015年6月2日，发明名称为“一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用”。

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用。

背景技术

乳腺癌是全球第二大常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中居首位。据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性恶性肿瘤发病的25％。同时乳腺癌是全球第五位常见的恶性肿瘤死亡原因，居女性恶性肿瘤死亡原因之首，全球共52万人因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的14.7％。而2012年，中国女性乳腺癌新发病例18.7万，发病人数仅次于肺癌，其中4.8万女性因乳腺癌死亡，居女性恶性肿瘤死亡的第六位。

乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，5-10％的乳腺癌是因为携带高外显率的乳腺癌易感基因突变所致。BRCA1，BRCA2，TP53，PALB2，PTEN，CHEK2，ATM，RAD50等被认定为乳腺癌易感基因，携带这些基因胚系突变的乳腺癌被称为遗传性乳腺癌，其中至少30％的遗传性乳腺癌是由于BRCA1和BRCA2突变所致。

突变位点的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此突变位点可能是导致个体对常见疾病发病易感性差异的重要遗传基础。将疾病的突变位点谱用于疾病的辅助诊断，具有广阔的应用前景。近年来，利用突变位点对疾病进行辅助诊断已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤、先天性疾病和心脑血管疾病等常见重大疾病上的应用价值已初见端倪。

遗传性乳腺癌在临床上更多的表现为家族聚集性、发病年龄提前、双侧乳腺癌以及合并其他肿瘤的特点，因此这些人群被认为是乳腺癌的高危人群。针对高危人群的遗传风险评估和基因检测已成为欧美许多国家的标准化医疗选择。并且针对突变携带者会采取一系列的预防措施，例如较早的进入乳腺癌筛查，并提高筛查频率，预防性药物的使用以及各种预防性手术的实施。约30％的遗传性乳腺癌是由于BRCA1和BRCA2突变所致，而携带BRCA1和BRCA2功能性突变也极有可能发展为乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史携带者。中国的BRCA1和BRCA2基因检测起步较晚，尽管有几项相关的研究，但是尚未发现足够量的突变“热点”，尤其是中国人群特异的乳腺癌相关突变。并且由于种族差异，欧美国家的突变谱也不完全适用于中国人群，若能筛选出乳腺癌发病相关的突变位点作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国乳腺癌筛查和早期诊断必将是一次有力的推动。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因。

本发明另一个目的是提供检测上述突变位点的特异性引物。

本发明第三个目的是提供上述突变基因及特异性引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第四个目的是提供一种乳腺癌辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的突变，寻找与乳腺癌相关的高特异性的突变位点，并研制出可临床或人群应用的乳腺癌辅助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因，该突变基因具有下列一个或多个突变位点：

与正常BRCA1基因序列相比具有g.41215910delA、g.41244291delT、g.41223130A>T、g.41256139T>A突变位点；

与正常BRCA2基因序列相比具有g.32912699A>G、g.32912799T>C、g.32914767-32914768delTT、g.32906615-32906619del5、g.32929399dupT、g.32911757C>T、g.32911659-32911662delAAAA、g.32914173-32914174insA、g.32910963T>G、g.32929083C>A突变位点。

正常BRCA1基因在NCBI参考数据库GRCh37.p13中的编号为NC_000017.10(41196312-41277500)，正常BRCA2基因在NCBI参考数据库GRCh37.p13中的编号为NC_000013.10(32889617-32973809)。

用于检测上述的突变基因中突变位点的特异性引物，其中各突变位点对应的引物序列为：

g.41215910delA的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

g.41244291delT的引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

g.41223130A>T的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

g.41256139T>A的引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

g.32912699A>G的引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；

g.32912799T>C的引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；

g.32914767-32914768delTT的引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；

g.32906615-32906619del5的引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；

g.32929399dupT的引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；

g.32911757C>T的引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；

g.32911659-32911662delAAAA的引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；

g.32914173-32914174insA的引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；

g.32910963T>G的引物为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；

g.32929083C>A的引物为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28。

上述的突变基因在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

上述的引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中上述的突变基因。即检测外周血DNA中是否具有下列突变位点中的一个或多个：BRCA1基因上是否具有g.41215910delA、g.41244291delT、g.41223130A>T、g.41256139T>A突变位点；BRCA2基因上是否具有g.32912699A>G、g.32912799T>C、g.32914767-32914768delTT、g.32906615-32906619del5、g.32929399dupT、g.32911757C>T、g.32911659-32911662delAAAA、g.32914173-32914174insA、g.32910963T>G、g.32929083C>A突变位点。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述引物中的一种或多种。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂。

具体地说：

本发明采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变。

随后进行无家族史中国汉族乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；8例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；3例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；5例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；8例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；5例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；4例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；6例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；2例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的中国汉族正常女性对照人群中，未发现突变个体。因此，该组突变组合物对乳腺癌的阳性预测值为100％，人群家族性乳腺癌患者中发生率为20％，散发性乳腺癌中发生率为1.83％。

本发明解决问题的技术方案包括：(1)筛选出人群中BRCA1和BRCA2基因与乳腺癌发生相关的新突变，提供位点的突变后碱基序列(2)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(3)突变筛选和验证其作用：采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变。随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；8例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；3例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；5例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；8例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；5例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；4例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；6例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；2例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的中国汉族正常女性对照人群中，未发现突变个体。(3)对筛选出的突变位点，需要满足在正常人群中无频率，且未被各类数据库报道(如dbSNP、HGMD、COSMIC等)。(4)乳腺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据乳腺癌病例所独有的突变位点开发突变位点辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Sanger测序对BRCA1基因和BRCA2基因的外显子编码区域进行扫描。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择(均为中国汉族)

(1)经病理学明确诊断的具有乳腺癌家族史的乳腺癌病例；

(2)经病理学明确诊断的散发型乳腺癌病例；

(3)与病例年龄匹配的健康女性对照；

本研究共采用6070例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.Sanger测序技术筛选突变位点

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)采用Primer 3软件在线设计引物；

(3)采用Sanger测序对BRCA1和BRCA2基因的外显子编码区进行扫描；

(4)检测并比较各基因型在乳腺癌病例与健康女性对照中的分别差异。

4.突变位点组合采用Sanger测序平台进行基因分型

(1)取受试者DNA样本；

(2)采用Primer 3软件在线设计引物；

(3)采用Sanger测序对BRCA1基因和BRCA2基因突变的外显子编码区进行扫描；

(4)检测并比较乳腺癌病例与健康女性对照中不同基因型的分布差异。

5.诊断试剂盒制备方法

采用Sanger测序对BRCA1和BRCA2基因的外显子编码区进行扫描和单个突变位点检测后确定乳腺癌病例与健康对照中基因型分布差异的突变位点，作为乳腺癌诊断的指标。最后筛选出的与乳腺癌发病有关的突变位点组合组成辅助诊断试剂盒(BRCA1基因上的g.41215910delA；g.41244291delT；g.41223130A>T；g.41256139T>A；和BRCA2基因上的g.32912699A>G；g.32912799T>C；g.32914767-32914768delTT；g.32906615-32906619del5；g.32929399dupT；g.32911757C>T；g.32911659-32911662delAAAA；g.32914173-32914174insA；g.32910963T>G；g.32929083C>A)。诊断试剂可以包括该突变位点的特异性引物以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。

以下是本发明进一步的说明：

在上述70例有家族史的乳腺癌病例中我们采用Sanger测序对BRCA1和BRCA2基因的外显子编码区进行扫描得相关结果。

根据Sanger测序检测结果，本发明人检测到70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变。

随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；8例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；3例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；5例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；8例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；5例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；4例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；6例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；2例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。

根据上述实验结果，本发明人发现了一组能用于乳腺癌辅助诊断的突变位点组合。

具体而言，以上突变的组合有助于乳腺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的突变位点序列改变作为乳腺癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)突变位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为乳腺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用Sanger测序对BRCA1和BRCA2基因的外显子编码区进行扫描以获取疾病相关的突变位点谱，并应用Sanger测序方法在大样本散发型乳腺癌患者中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了突变位点生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物；通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2004年开始至2013年从南京医科大学肿瘤中心及社区正常人群中收集了大量的中国汉族女性乳腺癌患者及正常人群的血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列标准的样本Sanger测序扫描分型的实验样品：

1、病理学明确诊断的具有乳腺癌家族史的乳腺癌患者70例；

2、病理学明确诊断的无家族史散发型乳腺癌患者3000例；

3、无肿瘤家族史，与病例年龄匹配的健康女性对照3000例；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA中突变位点的测序扫描

在上述70例有家族史的的乳腺癌患者和健康对照中，采用Sanger测序检测获得相关结果。测序过程遵循Sanger测序的标准操作，人工设计Sanger测序引物，引物序列由南京金斯瑞公司合成(详见表1)。

具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、PCR反应体系30微升，包括：模板50ng；引物F：1微升和引物R：1微升；2×MIX 15微升；H₂O补足至30微升。

9、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

10、采用ABI3730平台进行Sanger测序；

11、使用Chromas2软件进行序列比较和分析。

12、Sanger测序结果的分析与处理:在乳腺癌患者中发现有患者存在BRCA1基因和BRCA2基因突变。我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；1例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变。

实施例3单个突变位点的Sanger测序基因分型

将上述Sanger测序扫描发现与乳腺癌发病有关的突变位点在3000例病理学明确诊断的无家族史散发型乳腺癌患者和3000例无肿瘤家族史，与病例年龄匹配的健康女性对照中进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、采用Sanger测序平台对于发生突变的外显子进行基因分型。对Sanger测序扫描发现与乳腺癌发病有关的突变位点设计特异性引物(表1)。

9、PCR反应体系30微升，包括：模板50ng；引物F：1微升和引物R：1微升；2×MIX 15微升；H₂O补足至30微升。

10、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

11、采用ABI3730平台进行Sanger测序；

12、使用Chromas2软件进行序列比较和分析，在3000例中国汉族无家族史散发性乳腺癌患者中，发现有患者存在BRCA1基因和BRCA2基因突变；我们发现有1例患者存在BRCA1基因上的g.41215910delA突变；8例患者存在BRCA1基因上的g.41244291delT突变；3例患者存在BRCA1基因上的g.41223130A>T突变；5例患者存在BRCA1基因上的g.41256139T>A突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32912699A>G突变；8例患者存在BRCA2基因上的g.32912799T>C突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914767-32914768delTT突变；1例患者存在BRCA2基因上的g.32906615-32906619del5突变；5例患者存在BRCA2基因上的g.32929399dupT突变；4例患者存在BRCA2基因上的g.32911757C>T突变；6例患者存在BRCA2基因上的g.32911659-32911662delAAAA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32914173-32914174insA突变；3例患者存在BRCA2基因上的g.32910963T>G突变；2例患者存在BRCA2基因上的g.32929083C>A的突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。

因此，本发明人证明了采用BRCA1基因和BRCA2基因上存在的突变组合能够很好地将健康对照和乳腺癌患者区分。

实施例4用于乳腺癌辅助诊断突变位点试剂盒的制作

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于Sanger测序扫描检测分型技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.41215910delA的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；g.41244291delT的引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；g.41223130A>T的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；g.41256139T>A的引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；g.32912699A>G的引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；g.32912799T>C的引物为SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12；g.32914767-32914768delTT的引物为SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14；g.32906615-32906619del5的引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；g.32929399dupT的引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；g.32911757C>T的引物为SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20；g.32911659-32911662delAAAA的引物为SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22；g.32914173-32914174insA的引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；g.32910963T>G的引物为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；g.32929083C>A的引物为SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28)，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表1.相关突变位点引物信息

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctccccta gacttccaaa t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaactcag actcagcatc ag 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcaacgaaa ctggactcat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgtatggg tgaaagggct 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accaacactg tattcatgta ccc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattctggct tctccctgct 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttggtgtc ttagctttag tga 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caatttgggg agccgaggt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagtggggtt taggggcttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcccacttgc agtctgaaaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggccagttta tgaaggaggg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggcaccaca gtctcaatag a 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagcaagtgg aaaatctgtc ca 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcctgttct tttcccaaaa c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggacctagg ttgattgcag 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgaggcagga tcgcttga 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcaaatgagg gtctgcaaca 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agggctttaa aattaccacc acc 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acaagcaacc caagtgtcaa 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcaacaggcc agcaaacttc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acaagcaacc caagtgtcaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcaacaggcc agcaaacttc 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtgactagc tcttcaccct g 21

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgttctggag tacgtatagc agt 23

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcatgaaaat gccagcactc t 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcctgcccat ttgttcatgt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcaaatgagg gtctgcaaca 20

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agggctttaa aattaccacc acc 23