阅读说明：本技术 多甲氧基黄酮在改善昼夜节律失调的用途 (Use of polymethoxyflavone for improving circadian rhythm disorder ) 是由 陈铮 S-H·柳 J·S·高桥 于 2018-03-05 设计创作，主要内容包括：公开了包括向患有或有风险患上时钟受控失调(例如代谢综合症或其组成症状)的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物的方法。公开了包括向患有或有风险患上睡眠障碍；老化；和/或患有或有风险患上心境障碍的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物的方法。多甲氧基黄酮可以是川陈皮素和/或橘皮素。所述组合物还可以包含其他化合物,例如烟酰胺核苷和/或紫檀芪,和/或预期改善代谢综合征、睡眠障碍、心境障碍、老化、心血管疾病、免疫失调、神经退行性疾病和/或癌症中的一种或多种症状的其他化合物。(Methods are disclosed that include administering a composition comprising at least polymethoxylated flavones to a mammal having or at risk of developing a clockwork-controlled disorder (e.g., metabolic syndrome or a constituent thereof). methods are disclosed that include administering a composition comprising at least polymethoxylated flavones to a mammal having or at risk of developing a sleep disorder, aging, and/or having or at risk of developing a mood disorder.)

多甲氧基黄酮在改善昼夜节律失调的用途

政府支持条款

本发明是在美国***授予的批准号AG045828和GM114424的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本公开一般涉及哺乳动物健康领域。更具体地，它涉及多甲氧基黄酮在改善昼夜节律失调的用途。

背景技术

事实上，地球上所有生物体都已经进化出一种内在的计时系统-昼夜节律时钟(circadian clock)，以预测和利用日常环境变化。在哺乳动物中，时钟系统是分层组织的，中枢起搏器在下丘脑视交叉上核(SCN)中协调外周组织时钟以执行生理功能(Takahashi等，2008)。细胞自主分子振荡器是时钟系统的基本组分，由互锁反馈回路组成(Dibner等，2010)。由阳性(转录激活因子CLOCK/BMAL1或NPAS2/BMAL1)和阴性(PER1/2和CRY1/2)臂组成的核心回路负责产生分子节律，而竞争性核受体REV-ERB和ROR调控Bmal1表达以赋予节奏稳定性和稳健性(Zhang and Kay，2010)。分子振荡器通过转录和转录后机制在整个昼夜循环中驱动组织特异性基因表达(Koike等，2012；Zhang等，2014)。

由时钟系统严格调控的基本过程是新陈代谢(Asher和Schibler，2011；Bass和Takahashi，2010；Gerhart-Hines和Lazar，2015；Green等，2008；Rutter等，2002)，正如代谢物(Eckel-Mahan等，2012)和代谢基因表达(Yang等，2006；Zhang等，2014)广泛地展示了昼夜节律振荡。在人类中，已显示昼夜节律错位引起代谢紊乱，例如葡萄糖不耐受和高脂血症(Roenneberg等，2012；Scheer等，2009)。遗传研究还揭示了时钟受破坏的小鼠的重叠代谢缺陷(Green等，2008)。例如，已经发现具有显性阴性等位基因的昼夜小鼠突变体Clock^Δ19/Δ19(Vitaterna等1994；King等1997)表现出一系列代谢失调，包括肥胖、高脂血症、肝脂肪变性、高血糖症、低胰岛素血症和呼吸解偶联(Marcheva等，2010；Shi等，2013；Turek等，2005)。

最近的研究探索了直接操纵昼夜节律以改善代谢综合征的策略(Antoch和Kondratov，2013；Chen等，2013；Farrow等，2012；Schroeder和Colwell，2013)。例如，高脂肪饮食(HFD)的限时摄入显示保护小鼠免受代谢疾病的侵害(Hatori等，2012)。在夜间特异性HFD方案中，时钟的振荡幅度和代谢基因表达显著增强，表明在活动期间，通过时钟相关途径的协同作用，身体可以最好地消耗进入的营养物。为了规避行为干预中固有的依从性问题，还研究了涉及时钟调节小分子的药理学方法(Chang等，2015；Chen等，2012，2013；Hirota等，2012；Isojima等，2009；Meng等，2010；Solt等，2012；Wallach和Kramer，2015)。例如，作用于REV-ERB核受体的小分子激动剂显示出有益的代谢作用(Solt等，2012)，表明调节化合物可通过时钟组分或时钟相关机制改善代谢。

本发明人先前使用具有高度稳健节律的报告细胞在高通量化学筛选中鉴定了几种时钟振幅增强小分子(CEM)(Chen等人，2012,2013)。当应用于培养的杂合Clock^Δ19/+PER2::Luc报告细胞时，在其中，报告基因节律以相对于野生型(WT)Clock+/+细胞较弱的振幅(约三分之一)振荡，这些CEM能够将报告基因节奏振幅恢复至接近正常水平。

然而，仍需要时钟振幅增强小分子(CEM)，包括可证明在体内哺乳动物模型中改善代谢失调的一种或多种症状的CEM。

发明内容

在一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有或有风险患上代谢综合征或其组成症状的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮(polymethoxylatedflavone)的组合物。

在一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有或有风险患上睡眠障碍的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

在一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有老化的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

在一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有或有风险患上心境障碍的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

多甲氧基黄酮，例如川陈皮素(nobiletin)和橘皮素(tangeretin)，是时钟振幅增强小分子(CEM)，如本发明人所证实，其改善体内哺乳动物模型中代谢综合征的一种或多种症状。

多甲氧基黄酮，例如川陈皮素和橘皮素，可以改善慢性疾病的一种或多种症状，这种疾病可以由哺乳动物昼夜节律的破坏而引起或加剧，包括但不限于心血管疾病、免疫失调、神经退行性疾病和癌症。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合在本文呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A呈现了川陈皮素的化学结构。

图1B显示了NIH临床库(左)和Microsource Spectrum库(右)中的川陈皮素对PER2::Luc Clock^Δ19/+报告基因节律的增强。

图1C显示了川陈皮素对来自PER2rLucSV细胞的报告基因节律的剂量依赖性影响(左)和对川陈皮素剂量的振幅应答的量化(右)。

图1D显示，川陈皮素不能挽救PER2::Luc Clock^Δ19/Δ19成纤维细胞中的报道基因节律。

图1E显示了川陈皮素在来自PER2::Luc WT(左)和PER2::Luc Clock^Δ19/+(右)报告小鼠的垂体外植体中的时钟增强作用。

图1F显示了说明溶媒或川陈皮素在用RC喂饲的WT小鼠中对昼夜行为的影响的活动变化图(n＝5)(左)。总结了指出的基因型在L：D(12小时光照，12小时黑暗)或D：D(恒定黑暗)的12-14天期间的滚轮活动的平均波浪图(n＝5)(中)；以及指出的基因型在L：D或D：D条件下的每日总滚轮活动(n＝5)(右)。

图2A显示了橘皮素的结构。

图2B显示了将橘皮素鉴定为时钟增强分子。首先用Fsk刺激完全汇合的PER2::LUCClock^Δ19/+报告细胞1小时，然后将化合物添加到板中。在EnVision酶标仪中记录4天内的报告基因发光。

图2C显示了NOB在包括来自PER2::Luc WT报告小鼠的肺(顶)和肝(底)外植体的外周组织中的时钟增强作用。该图代表至少三个实验。

图2D显示，NOB并未增强来自PER2::Luc WT报告小鼠的SCN外植体中的报告基因节律。培养(第0天)7天后更换培养基。在指定时间(虚线)给予DMSO或NOB。比较给予NOB前后的节律，未观察到NOB引起的振幅增强。

图2E显示了通过实时qPCR分析的用福司柯林(Forskolin)预处理1小时的PER2::LucSV细胞中时钟基因的mRNA水平表达。

图2F显示了如(E)中处理的细胞中昼夜节律时钟蛋白的代表性Western blot。

图2G显示了(F)中时钟蛋白的Western blot分析定量(n＝2-3)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01以及***p<0.001。NOB与DMSO相比。

图3A显示了以200mg/kg体重的剂量通过口服管饲给药，然后通过LC-MS/MS来确定小鼠血浆、脑和肝中的NOB水平(n＝3)。

图3B显示了在10周处理期结束时的体重增加(n＝8-15)。在图3B-3J中，对WT或Clock^Δ19/Δ19突变小鼠喂饲高脂肪(HF)饮食并隔天用溶媒或NOB处理(n＝8-15)。

图3C显示了在与主观夜晚和白天相对应的黑暗(实心)和光照(空心)阶段的食物摄入量。Y轴表示在黑暗或光照阶段的累积食物摄入量(n＝8-15)。

图3D显示了NOB减少的内脏WAT细胞大小。分析了三个相距200μm的区域的图像，这些图像代表>500个细胞。

图3E显示了对黑暗(实心条形)和光照(空心条形)阶段定量每个组的VO2(氧气消耗体积)(n＝8)。

图3F显示记录了昼夜循环的能量消耗(n＝8)。

图3G显示了对黑暗和光照阶段的呼吸商进行了量化(n＝8)。

图3H显示了用溶媒或NOB处理的用HFD喂饲的WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的全肝重量(n＝8-15)。

图3I显示了用溶媒或NOB处理的用HFD喂饲的WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的全肝代表性图像(I)(n＝8-15)。图3J显示了处理10周后的肝的组织学分析。用油红O对肝进行染色以使脂滴可视化。

图4A显示了WT或Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的平均体重，其用HFD喂饲并用溶媒(WT.HF.Veh和Clk.HF.Veh)或川陈皮素(WT.HF.川陈皮素和Clk.HF.川陈皮素)处理10周(n＝8-15)。

图4B显示了图4A中涉及的四组小鼠的每日食物摄入量(n＝8-15)。

图4C显示了如通过核磁共振分析的图4A中涉及的四组小鼠的体重组成(n＝3)。

图4D显示了对图4A中涉及的四组小鼠处理10周后白色脂肪(WAT)的组织学分析。对WAT进行H&E染色。

图4E显示了在图4A中涉及的四组小鼠中的VO2的昼夜节律(氧气消耗量)(n＝8)。

图4F显示了说明溶媒或川陈皮素在用HFD喂饲的WT小鼠中对昼夜行为的影响的活动变化图(n＝7)(左)；总结了指出的基因型在L：D或D：D的12-14天期间的滚轮活动的平均波浪图(n＝7)(中)；以及指出的基因型在L：D或D：D条件下的每日总滚轮活动(n＝7)(右)。

图4G显示了说明溶媒或川陈皮素在用HFD喂饲的Clock^Δ19/Δ19突变小鼠中对昼夜行为的影响的活动变化图(n＝3)(左)；总结了指出的基因型在L：D或D：D的10-12天期间的滚轮活动的平均波浪图(n＝3)(中)；指出的基因型在L：D或D：D条件下的每日总滚轮活动(n＝3)(右)。

图5A显示了在两个相反的时间点用溶媒或川陈皮素处理的用HFD喂饲的WT(左)和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠(右)中的空腹血糖水平(n＝8-15)。

图5B显示了如通过葡萄糖耐受性测试(GTT)(n＝8-15)进行测量的川陈皮素对用HFD喂饲的WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的葡萄糖耐受性的影响(左)和曲线下面积(AUC)(右)。

图5C显示了如通过胰岛素耐受性测试(ITT)(n＝8-15)进行测量的川陈皮素对用HFD喂饲的WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的胰岛素耐受性的影响(左)和曲线下面积(AUC)(右)。

图5D显示了用溶媒或川陈皮素处理的用HFD喂饲的WT小鼠和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠中的血液胰岛素水平(n＝8-15)。

图5E显示了处理10周后血液中的总甘油三酸酯(TG)水平和胆固醇(TC)水平(n＝8-15)。

图5F显示了处理10周后肝中的总TG水平和TC水平(n＝8-15)。

图5G显示了处理10周后的用HFD喂饲的WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的全肝H&E染色。

图6A显示了在9周处理期结束时的体重(n＝12)。NOB并未影响用常规食物喂饲的小鼠的代谢稳态。

图6B显示了在9周处理期结束时的体重增加(n＝12)。NOB并未影响用常规食物喂饲的小鼠的代谢稳态。

图6C显示了空腹血糖水平(n＝12)。NOB并未影响用常规食物喂饲的小鼠的代谢稳态。

图6D显示了葡萄糖耐受性测试(GTT)(n＝12)。NOB并未影响用常规食物喂饲的小鼠的代谢稳态。

图6E显示了胰岛素耐受性测试(ITT)(n＝12)。NOB并未影响用常规食物喂饲的小鼠的代谢稳态。

图7A显示了柚皮苷(NAR)和柚皮素(naringenin)的结构。

图7B显示柚皮苷未增强PER2::LucSV或PER2::LUC Clock^Δ19/+报告细胞中的报告基因发光。

图7C显示柚皮苷未增强PER2::LucSV或PER2::LUC Clock^Δ19/+报告细胞中的报告基因发光。

图7D显示柚皮素未增强PER2::LucSV或PER2::LUC Clock^Δ19/+报告细胞中的报告基因发光。

图7E显示了PER2::LucSV细胞中PER2蛋白的Western blot分析。在时间0用5μMNAR或DMSO处理细胞，每4小时收集一次至32小时，然后用抗体进行免疫印迹。

图7F显示了如关于图7E所讨论的那样处理的PER2::LucSV细胞中Per2mRNA水平的实时qPCR分析。

图8A显示了用溶媒或NAR(WT.HF.Veh、WT.HF.NAR、Clk.HF.Veh和Clk.HF.NAR)处理的用HFD喂饲的小鼠在处理10周后的平均体重(左)和体重增加(右)(n＝8-15)。

图8B显示，NAR在白天和晚上降低WT小鼠而非Clock^Δ19/Δ19突变小鼠的空腹血糖水平(n＝8-15)。

图8C显示，NAR显示出如通过葡萄糖耐受性测试(GTT)所测量的对葡萄糖耐受性的轻度影响，其在WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠之间是无法区分的(n＝8-15)。也显示了曲线下面积(AUC)的定量。

图8D显示，NAR显示出如通过胰岛素耐受性测试(ITT)所测量的对胰岛素敏感性的轻度影响，其在WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠之间是无法区分的(n＝8-15)。也显示了通过ITT的曲线下面积(AUC)的定量。

图8E显示了在WT和Clock^Δ19/Δ19突变小鼠中，NAR使血液胰岛素水平降低至相似的程度(n＝8-15)。

图8F显示了处理10周后血液总甘油三酸酯(TG)水平(n＝8-15)。

图8G显示了处理10周后胆固醇(TC)水平(n＝8-15)。

图9A显示了用RC喂饲的db/db或db/db Clock^Δ19/Δ19双突变小鼠的平均体重，其并用溶媒(Db.Veh和Db.Clk.Veh)或川陈皮素(Db.川陈皮素和Db.Clk.川陈皮素)处理10周(n＝6-8)(左)。在处理开始时，小鼠为6-8周大。右：这四组小鼠的平均体重增加。

图9B显示了在两个相反的时间点的db/db(左)和db/db Clock^Δ19/Δ19双突变小鼠(右)中的空腹血糖水平(n＝6-8)。

图9C显示了如通过GTT进行测量的川陈皮素对db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19双突变小鼠的葡萄糖耐受性的影响(n＝6-8)。右：AUC。

图9D显示了如ITT进行测量的川陈皮素对db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19双突变小鼠的胰岛素耐受性的影响(n＝6-8)。右：AUC。

图9E显示了db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19小鼠的血液总TG水平(n＝6-8)。

图9F显示了db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19小鼠的血液总TC水平(n＝6-8)。

图9G显示了川陈皮素对db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19小鼠的循环胰岛素水平的影响(n＝6-8)。

图10A显示了通过Western blotting对从用HFD喂饲的WT小鼠中采集的肝样品中时钟基因的蛋白和mRNA表达的确定，用溶媒(WT.HF.Veh)或川陈皮素(WT.HF.川陈皮素)处理小鼠。用RC喂饲的WT小鼠(WT.RC.Veh)用作比较中的对照(n＝3或4)。

图10B显示了通过实时qPCR对从用HFD喂饲的WT小鼠中采集的肝样品中时钟基因的蛋白和mRNA表达的确定，用溶媒(WT.HF.Veh)或川陈皮素(WT.HF.川陈皮素)处理小鼠。用RC喂饲的WT小鼠(WT.RC.Veh)用作比较中的对照(n＝3或4)。

图10C显示了微阵列基因表达数据的热图，其表明56种基因的表达模式被HFD改变，川陈皮素不同程度地将它们在ZT2和ZT14时间点的表达反转至接近WT小鼠肝中的RC水平。比例表示相对值的中值归一化信号强度。

图10D显示了通过GO程序对(C)中的56个基因的功能分类。显示了共享GO生物学过程的基因百分比。

图10E显示了来自经如上处理的小鼠的肝中时钟受控的代谢输出基因的mRNA表达的实时qPCR分析。

图11A示出了比率热图。计算图10C中的表达数据以得出倍数变化，这表明NOB在ZT2和ZT14时间点在小鼠肝中反转由HFD改变的56个基因的表达模式。比例显示倍数变化(比率)。NOB/HF表示HF.NOB与HF.Veh表达比率；HF/RC表示HF.Veh与RC.Veh的表达比率。

图11B显示，三十一个基因显示出时钟蛋白结合，而其余的基因则没有(空白区域)。分析基于已公开的ChIP-Seq结果(Koike等，2012；Cho等，2012)。比例表示DNA占用的量级，如通过结合每个转录因子的免疫沉淀DNA片段的富集来量化。

图11C显示了在用对照(Ctrl)或小鼠RORα/γsiRNA和溶媒(DMSO)或NOB(3μM，12h)处理的Hepa1-6细胞中RORα(左)和RORγ(右)mRNA的表达(n＝4)。

图11D显示了，网络内突出显示的是RORα/γ，其充当由NOB调控的基因的节点。指示了由HFD(左)或NOB(右)下调和上调的基因，其强度对应于倍数变化。

图12A显示了用100ng RORα-LBD(顶)和200ng RORγ-LBD(底)产生的RORα-LBD和RORγ-LBD的25-[3H]-OHC过滤结合测定的饱和度曲线(n＝3)。显示了解离常数值。

图12B显示了由图12A所得的25-[3H]-OHC的RORα-LBD(顶)和RORγ-LBD(底)的饱和曲线结果的Scatchard图，其对应于n＝3。该分析给出了解离常数(Kd)为6.10nM，结合位点总数(Bmax)对于RORα为100fmol/mg蛋白，对于RORγ为6.67nM和410fmol/mg蛋白。

图12C显示了体外竞争性放射性-配体结合测定，其表明在指定的剂量范围内，川陈皮素(NOB)(C)而不是柚皮苷(NAR)与RORα-LBD和RORγ-LBD直接结合。显示了抑制常数值。

图12D显示了体外竞争性放射性-配体结合测定，其表明在指定的剂量范围内，柚皮素与RORα-LBD和RORγ-LBD没有直接结合。

图12E显示了哺乳动物单杂交测定，其显示了川陈皮素与ROR-LBD的相互作用。用有GAL4 DBD-RORαLBD或GAL4 DBD-RORγLBD的表达载体的GAL4报告基因构建体共转染人胚胎肾293T细胞。

图12F显示了哺乳动物单杂交测定，其显示缺乏柚皮苷与ROR-LBD的相互作用。用有GAL4 DBD-RORαLBD或GAL4 DBD-RORγLBD的表达载体的GAL4报告基因构建体与共转染人胚胎肾293T细胞。SR1001用作阳性对照)。

图12G显示在Hepa1-6细胞中存在RORα或RORγ的情况下，川陈皮素与WT而不是突变RORE剂量依赖性地增加了Bmal1启动子驱动的荧光素酶报告基因的表达。REV-ERBα的异位表达消除了报道基因的激活。

图12H显示了通过siRNA敲除RORα/γ表达废除了Hepa1-6和U2OS细胞中Bmal1启动子驱动的荧光素酶报告基因表达的川陈皮素诱导。

图12I显示了来自如图10A的相同小鼠肝样品中的RORα/γ靶基因的实时qPCR分析。

在所有图中，数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.05以及###p<0.001。

具体实施方式

在一个实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向患有或有风险患上代谢综合征或其组成症状的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

“代谢综合征”是在一名患者中的以下医学症状的至少三种的集合：腹部肥胖、血压升高、空腹血糖升高、高血清甘油三酯和低密度脂蛋白(HDL)。如果哺乳动物饮食中碳水化合物(尤其是糖类)含量较高；过着久坐的生活方式；和/或经历慢性压力，以及本领域技术人员已知的其他经历和行为，则哺乳动物可能有风险患上代谢综合症。尽管不受理论束缚，但哺乳动物昼夜节律的破坏可能会引起或加剧代谢综合症的一种或多种组成症状。

黄酮类具有本领域已知的一般结构，其包括含有两个苯环和一个杂环的十五碳骨架。黄酮类的亚类包括黄酮、异黄酮和新黄酮。多甲氧基黄酮是含有至少两个甲氧基部分的黄酮。

在一个实施例中，至少一种多甲氧基黄酮具有式I：

其中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶各自独立地为–H或–OCH₃，前提是R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶中的至少两个为–OCH₃。

在进一步的实施例中，至少一种多甲氧基黄酮可以选自由川陈皮素(式II)、橘皮素(式III)和两者组成的组。

该组合物还可包含至少一种载体。所述至少一种载体可以是所述至少一种多甲氧基黄酮可以与其混合或组合成所需形式并且适合于人类或动物消耗的任何一种或多种材料。该组合物可以是选自由液体、片剂、胶囊、囊片和可溶性粉剂组成的组的形式，并且本领域技术人员将能够根据组合物的给定实施例期望的具体形式，常规地选择一种或多种合适的载体。

在一个实施例中，至少一种载体可以是或包括水、明胶或纤维素。

在一个实施例中，至少一种载体可以是或包括微晶纤维素、羟丙甲纤维素、植物硬脂酸镁或二氧化硅。

替代地或另外，该组合物还可以包含调味剂，例如柑橘调味剂、非柑橘水果调味剂、草药调味剂、香草调味剂或巧克力调味剂以及其他合适的调味剂。

替代地或另外，该组合物可包含除了预期减少一种或多种代谢综合征症状的多甲氧基黄酮以外的一种或多种成分。例如，在一个实施例中，该组合物可进一步包含肉桂，其单独或与预期减少一种或多种代谢综合征症状的其他成分一起使用。

替代地或另外，该组合物可以包含一种或多种预期减少除代谢综合征以外的症状的成分和/或一种或多种预期改善哺乳动物整体健康和舒适度的一个或多个方面的成分。例如，在一个实施例中，该组合物可以进一步包含烟酰胺核苷(nicotinamide riboside)和紫檀芪(pterostilbene)。

可以以任何剂量和速率对哺乳动物给予组合物，所述剂量和速率可在血液或其他身体组织或体液中以任何持续时间提供浓度低于有害水平的至少一种多甲氧基黄酮。期望持续时间可以足够长以降低患者的代谢综合症的严重性或降低患者患上代谢综合症的风险。

在一个实施例中，可以以20mg多甲氧基黄酮/kg哺乳动物体重至2000mg多甲氧基黄酮/kg哺乳动物体重的剂量，和每天两次至每周一次并持续至少一个星期的速率给药。在具体的实施例中，可以以200mg多甲氧基黄酮/kg哺乳动物体重的剂量，每两天一次并持续至少十周的速率给药。

在进一步的实施例中，其中，该组合物进一步包含烟酰胺核苷和紫檀芪，烟酰胺核苷的剂量可以是1mg烟酰胺核苷/kg哺乳动物体重至10mg烟酰胺核苷/kg哺乳动物体重；紫檀芪的剂量可以是0.2mg紫檀芪/kg哺乳动物体重至2.5紫檀芪/kg哺乳动物体重；而且给药速率可以是每天一次。

希望减少代谢综合症或其风险的任何哺乳动物都可以作为该方法的受试者。在一实施例中，哺乳动物可以是智人。可能希望减少代谢综合症或其风险的其他哺乳动物包括但不限于役畜、驮兽、用于运输的动物(例如马)、竞赛动物(例如马或灵狮)、肉用动物、产毛或产皮动物、奶畜、工作犬和伴侣动物等。

可以通过任何途径(例如口服、静脉内或动脉内等途径)给予组合物。在一个实施例中，可以通过口服途径给药。在该实施例中，可能希望将至少一种多甲氧基黄酮溶解在中性或口感令人愉悦的液体中，例如水、调味水、牛奶或果汁等。另外，该组合物可以是片剂或胶囊形式，并且以这种形式，该组合物可以溶解在液体中。在其他实施例中，组合物可以以当置于使用者的口中时溶解的片剂或锭剂的形式提供。在一些实施例中，可以以粉末、片剂、胶囊、凝胶、气雾剂或液体形式提供根据本文所述的任何实施例的组合物。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有或有风险患上睡眠障碍的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

如本文所用，“睡眠障碍”是指哺乳动物在期望的时间或持续时间内或期间进入、退出或保持睡眠的能力的非暂时性损害。尽管不受理论束缚，但哺乳动物昼夜节律的破坏可能会引起或加剧一种或多种睡眠障碍。在一个实施例中，睡眠障碍可以选自由失眠、嗜睡、发作性睡病、睡眠时相延迟综合征(DSPS)、睡眠时相前移综合征(ASPD)、非24小时睡眠觉醒障碍、不规则睡眠觉醒节律和轮班工作睡眠障碍组成的组。

在该实施例的方法中，包含至少一种多甲氧基黄酮和任何其他组分(例如一种或多种载体(烟酰胺核苷和/或紫檀芪))的组合物以及其任何制剂可以如上所述。在一个实施例中，用于该方法的组合物可包含除多甲氧基黄酮以外的一种或多种预期可减少一种或多种睡眠障碍症状的成分。例如，在一个实施例中，该组合物可进一步包含褪黑激素、缬草，一种或多种缬草烯酸、卡瓦、一种或多种卡瓦内酯、醉椒素、洋甘菊、芹菜素、西番莲、柠檬香蜂草、并头草属的植物(skullcap)、啤酒花、薰衣草、l-色氨酸、圣约翰草、酸樱桃、一种或多种酚酸、花色素苷以及一种或多种***素。

类似地，组合物的单独或组合给药，包括剂量、速率、持续时间和途径，也可以如上所述。

在又一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有老化的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

如本文所用，“老化”是指哺乳动物衰老的持续增加。尽管不受理论束缚，但哺乳动物昼夜节律的破坏可能会加剧老化。老化的示例性症状包括但不限于肌肉质量下降、骨密度下降、免疫系统功能下降、记忆力下降、认知功能下降、皱纹增加、肝斑增加、灰发和白发增加、脱发和整体活力下降。

在该实施例的方法中，包含至少一种多甲氧基黄酮和任何其他组分(例如一种或多种载体(烟酰胺核苷和/或紫檀芪))的组合物以及其任何制剂可以如上所述。在一个实施例中，用于该方法的组合物可包含除多甲氧基黄酮以外的一种或多种预期减少一种或多种老化症状的成分。例如，在一个实施例中，组合物可进一步包含以下中的至少一种：白藜芦醇、β-胡萝卜素、维生素A、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素E、一种或多种姜黄素、姜黄、一种或多种绿茶多酚、一种或多种儿茶素、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、葡萄籽提取物、一种或多种类胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、隐黄质、虾青素、角黄素、番茄红素、一种或多种叶黄素类、一种或多种植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、钙、一种或多种欧米珈-3脂肪酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、氨基葡萄糖、软骨素、胶原蛋白、槲皮素、膳食纤维、一种或多种益生菌、乳杆菌、双歧杆菌、一种或多种益生元、乳清蛋白、钾、锌、辅酶Q₁₀、银杏、蓝莓、蔓越莓、牛至、油桃、阿萨伊、大马士革蔷薇、可可、绿茶、橄榄油、HSP-12.6、单宁酸、咖啡酸、迷迭香酸、亚精胺或硫黄素T等。

类似地，组合物的单独或组合给药，包括剂量、速率、持续时间和途径，也可以如上所述。

在再一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有或有风险患上心境障碍的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

如本文所用，“心境障碍”是指哺乳动物的基线情绪状态的非暂时性改变。心境障碍的例子包括但不限于躁狂、轻度躁狂、单相抑郁和双相障碍等。尽管不受理论束缚，但心境障碍可以由哺乳动物的昼夜节律的破坏引起或加剧。

在该实施例的方法中，包含至少一种多甲氧基黄酮和任何其他组分(例如一种或多种载体(烟酰胺核苷和/或紫檀芪))的组合物以及其任何制剂可以如上所述。在一个实施例中，用于该方法的组合物可包含除多甲氧基黄酮以外的一种或多种预期减少一种或多种心境障碍症状的成分。例如，在一个实施例中，组合物可进一步包含以下中的至少一种：圣约翰草、一种或多种欧米珈-3脂肪酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、S-腺苷-L-蛋氨酸(SAMe)、银杏、石杉碱甲、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素D、caprylidene或椰子油等。

类似地，组合物的单独或组合给药，包括剂量、速率、持续时间和途径，也可以如上所述。

在附加实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有或有风险患上心血管疾病、免疫失调、神经退行性疾病、癌症或其两种或更多种的哺乳动物给予包含至少一种多甲氧基黄酮的组合物。

在该实施例的方法中，包含至少一种多甲氧基黄酮和任何其他组分(例如一种或多种载体(烟酰胺核苷和/或紫檀芪))的组合物以及其任何制剂可以如上所述。在一个实施例中，用于该方法的组合物可包含除多甲氧基黄酮以外一种或多种预期减少一种或多种疾病或失调症状的成分。

类似地，组合物的单独或组合给药，包括剂量、速率、持续时间和途径，也可以如上所述。

包括以下实施例以说明本发明的特定实施例。本领域技术人员应该理解，以下示例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施例中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得相似或类似的结果。

示例

示例1.川陈皮素作为时钟调节剂的鉴定

为了鉴定时钟振幅增强小分子(CEM)，使用杂合的Clock^Δ19/+PER2::Luc报告细胞筛选了具有5,300个小分子的内部化合物库，其相对于野生型(WT)细胞表现出具有衰减振幅的持续的报告基因节律。具体来说，在德克萨斯大学休斯敦健康科学中心(UTHSC-H)的化学基因组学核心设施中进行了昼夜节律时钟调节剂的化学筛选。筛选出的内部化学文库由来自国立卫生研究院(NIH)临床库、国家癌症研究所库和Microsource Spectrum库的化合物组成。筛选主要是基于先前描述的方案进行(Chen等，2012)。简而言之，将来自表达PER2::Luc生物发光报告基因的Clock^Δ19/+杂合小鼠的永生化成纤维细胞铺入96孔板。汇合后，将细胞与5μM福司柯林一起温育1-2小时，然后使用机械臂(Beckman)将化学化合物添加到板中，然后在温度受控的EnVision酶标仪(Perkin Elmer)中连续监测几天。使用MultiCycle软件(Actimetrics)进行数据分析，以测量周期、相位和幅度。

其他材料和方法如下：

动物和细胞系。除组织外植体实验外，所有研究的动物饲养均在IACUC准则下进行，并且按照德克萨斯大学休斯敦健康科学中心(UTHSC-H)批准的动物协议中的描述进行操作。雄性野生型(WT)Clock^Δ19/Δ19、db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19小鼠均处于C57BL/6J遗传背景，是使用分别从Takahashi实验室和Jackson实验室(#000697)获得的Clock^Δ19/+(Antoch等，1997年；King等，1997年)和db/+种畜从杂合育种的同窝出生仔畜获得。在标准动物设施中以12小时：12小时的光照：黑暗循环将小鼠分组饲养(2-4只/笼)。移除表现出对笼伴侣有攻击行为的小鼠。为了进行昼夜运动和代谢室研究，将小鼠以单笼饲养在UTHSC-H动物福利委员会批准的卫星设施中。根据德克萨斯大学西南医学中心(UTSW)的IACUC准则，维护用于组织外植体实验的PER2::Luc报告基因敲入小鼠。成年小鼠耳朵成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在先前已有描述(Chen等，2012)。

高通量化学筛选和验证。昼夜节律时钟调节剂的化学筛选是在UTHSC-H的化学基因组学核心设施中进行的。筛选的内部化学文库由NIH临床库、NCI库和MicrosourceSpectrum库的化合物组成。筛选主要基于先前描述的方案进行(Chen等，2012)。简而言之，将15,000个来自表达PER2::Luc生物发光报告基因的Clock^Δ19/+杂合小鼠的永生化成纤维细胞铺在96孔板的每个孔中，并温育3-4d，以使其生长至汇合。然后将细胞与5μM福司柯林温育1–2h，然后使用机械臂(Beckman)向板中添加化学化合物，然后在温度受控的EnVision酶标仪(Perkin Elmer)中连续监测几天。使用MultiCycle软件(Actimetrics)进行数据分析，以测量周期、相位和幅度。在对昼夜节律振幅和/或周期显示大于2X SD影响的化合物中，从两个子文库中独立鉴定出川陈皮素(NOB)显著增强昼夜节律振幅。从商业来源(包括Sigma和GenDEPOT)对NOB和结构相关类似物柚皮苷(naringin,NAR)进行了再次购买，并使用表现出更强生物发光信号的PER2::LucSV报告成纤维细胞进行剂量应答验证，从而允许精确测量化合物的昼夜节律时钟影响(Chen et al。，2012)。如前所述进行组织外植体实验(Chen等，2012)。

昼夜运动活性。将经NOB或溶媒处理的用RC喂饲的WT、用HFD喂饲的WT和Clock^Δ19/+小鼠用于昼夜运动活性实验。简而言之，首先将小鼠在12hr：12hr的光照：黑暗(LD)循环中维持至少2周，然后释放到恒定黑暗、***状态下。然后再将小鼠保持在恒定黑暗中2周。滚轮数据作为VitalView数据文件下载，并通过ActiView和Actogram J程序进行了分析(Schmid等，2011；Zheng等，1999)。

小鼠处理、体重和质量组成测量。对于饮食引起的肥胖症，对6周龄的雄性小鼠喂饲HFD(D12492，研究饮食)，直到实验方案结束。在整个实验期间，每隔一天在ZT8-10的时间窗口内，通过口服管饲法用溶媒(DMSO)或NOB(200mg/kg体重)对小鼠进行处理。基于多个原因，在指定的水平选择了每隔一天的剂量方案。首先，先前的体内研究已将相似的总量用于小鼠处理(100-125mg/kg/天)(Lee等，2013；Li等，2006)。在它们活动期开始之前的下午晚些时候(ZT8-10)进行了口服管饲步骤，理由是这可能与以前的研究采用的时间窗口一致。其次，没有选择每日剂量，以免将步骤本身作为人工给时者来带动实验小鼠。此外，在单剂量条件下进行了中试药代动力学(PK)测定(图S7)。与有利的PK曲线相一致，观察到血清、脑以及尤其是肝中的显著暴露。尽管在我们的研究中，单剂量给药后8小时通常无法检测到NOB，但其他研究也能够在给药后24小时测量NOB水平(Kumar等，2012；Singh等，2011)。因此，有理由认为，隔日给药有助于避免在慢性实验期间(10周)内每日清除不完全。

在10周内，对不同处理的小鼠监测每周体重。在实验结束时使用minispec mqNMR光谱仪(Bruker Optics，德克萨斯)测量体重组成(Garcia等，2013)。对对照组的小鼠喂饲常规饮食(Purina 5001)，同时两个处理组处于HFD。对于db/db和db/db Clock^Δ19/⁺小鼠，将6-8周龄的雄性小鼠分组饲养(2-3只/笼)，并保持常规饮食。如上所述用DMSO或NOB对小鼠进行口服管饲。

小鼠中的药代动力学研究。在0.25％羧甲基纤维素钠(CMC)悬浮液中以200mg/kg的剂量在ZT8口服给予NOB。口服管饲后0.0、1.0、2.0、4.0、8.0和24.0小时的每个时间点处死三只小鼠。通过LC-MS/MS(API 4000：EQ-RS-MS-006)测定血浆、脑和肝中的NOB。

能量消耗和食物摄入量测量。如所述(Chutkow等，2010；Daniels等，2010)，通过间接测热法测量耗氧量来检查能量消耗。经过上述8周处理后，将每组小鼠于室温(22℃–24℃)放置在综合实验室动物监测系统(CLAMS，Columbus Instruments，哥伦布，俄亥俄州)的室内。小鼠适应代谢室后，在24小时期间内连续记录O2消耗量和CO2产生量。计算并比较不同处理之间的平均O2消耗量。随意提供食物和水。为了测量食物摄入量，在如上处理的小鼠中，在24小时内每三小时对食物颗粒进行称重。每日食物摄入量是根据3个独立实验的平均食物摄入量计算得出的。

血清和肝脂质测定。如前所述(Jeong等，2015)，在ZT2从经处理的小鼠获得血清样品。如先前所述提取肝甘油三酸酯和胆固醇(Liu等，2012)。分别通过血清甘油三酸酯测定试剂盒(Sigma)和胆固醇测定试剂盒(Cayman)评估肝和血清中的甘油三酸酯和胆固醇水平。按照制造商的说明，用TECAN M200仪器(Tecan)读取测定板。

葡萄糖耐受性和胰岛素耐受性测试(GTT和ITT)。葡萄糖耐受性测试(GTT)和胰岛素耐受性测试(ITT)的执行大致如上所述(He等，2015；Jeong等，2015)。简而言之，过夜和5小时禁食后，分别在ZT2和ZT8进行GTT和ITT。使用ONETOUCH UltraMini血糖监测系统(LifeScan)分别在ZT2和ZT8注射1g/kg葡萄糖或0.75U/kg胰岛素(Sigma)之前和之后15、30、60或120分钟从尾血中测量葡萄糖水平。根据制造商的说明，使用大鼠/小鼠胰岛素Elisa试剂盒(Millipore)测量血清胰岛素水平。如上所述，在ZT2收集血浆样品用于脂质测定。

肝和脂肪组织的组织学分析。为了对肝中脂质堆积进行显微镜分析，收集了组织样本并立即将其包埋在Tissue-Tek OCT低温恒温器模具(Leica)中，然后在-80℃冷冻。将组织切片在0.5％油红O中染色，并用Mayer苏木精复染1分钟。另外，将肝、棕色脂肪和白色脂肪组织包埋在石蜡中，并用苏木精和伊红(H&E)染色。显微镜图像在Olympus BX60显微镜上获得。

实时qPCR和Western blot分析。对于qPCR分析，将细胞以3X 105细胞的初始密度分到6孔板中，并温育2-4天，然后进行同步化处理(5μM Fsk或100nM Dex)，然后进行化合物处理。使用PureXtract RNAsol制备RNA样品用于cDNA合成，并使用MaxPro3000Thermocycler(Agilent)进行实时PCR(GenDEPOT)。所用的qPCR引物列于示例4所示的表中。按照描述(Yoo等，2013)制备来自在60mm皿和组织提取物中类似生长和处理的细胞的全细胞裂解物(Yoo等，2013)，并进行Western blot分析(GenDEPOT)。使用了REV-ERBα(Pierce和Cell Signaling)、PER1(Lee等，2001)和其他时钟蛋白(Yoo等，2013)的抗体。

微阵列分析。从用RC喂饲、溶媒处理和HFD喂饲、溶媒或NOB处理10周的WT小鼠肝组织中制备的总RNA进行反转录为cDNA，然后用生物素-UTP标记并与Illumina小鼠WG-6v2.0Expression BeadChip杂交。使用中心相关性(Cluster 3.0)对具有统计学显著倍数变化差异的基因进行聚类，然后在Tree View上可视化为热图。此外，将来源于微阵列分析的具有统计学显著差异的基因导入Ingenuity Pathway Analysis(IPA，http：//www.ingenuity.com)。在IPA中，差异表达的基因被映射到Ingenuity Knowledge Database中的遗传网络以生成一组网络，然后按得分进行排名。使用Cluster 3.0程序生成热图。如前所述(Koike等，2012)进行了ChIP-seq数据分析。该出版物中讨论的数据已保存在NCBI的Gene Expression Omnibus(Edgar等，2002)中，可通过GEO系列登记号GSE78848获得。

质粒。在我们的实验室中，构建了包含来自小鼠Bmal1启动子的视黄酸相关孤儿受体应答元件(RORE)(pcDNA3.1B-G4DBD-RORαLBD和pcDNA3.1BG4DBD-RORγLBD)的质粒。具体而言，从小鼠基因组DNA中PCR扩增具有WT(AAAGTAGGTCA和AAAGTAGGTTA)或突变(AAAGTACACGA)RORE的小鼠Bmal1启动子的1960bp序列(-1830/+130)，并将其克隆到pGL3-启动子荧光素酶载体中。为了表达RORα或RORγ-GAL4蛋白，从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠RORα-LBD(aa 261-523)或RORγ-LBD(aa 250-516)，并将其克隆到含GAL4-DBD的载体pcDNA3.1B中。

单杂交报告基因测定。对于哺乳动物单杂交测定，将HEK293T细胞与pcDNA3.1B-G4DBD-RORα/γLBD、pGL4.31和TK启动子海肾(Renilla)荧光素酶构建体(tK.pRL)共转染。为了探索Bmal1报告基因的调控，将Hepa1-6细胞与Bmal1-WT或突变RORE报告基因质粒(RORα、RORγ或Rev-erbα表达构建体)以及tK.pRL共转染。靶向RORα和RORγ的小鼠和人siRNA购自Santa Cruz。用Lipfectamine 2000试剂(Invitrogen)进行转染，转染后24小时，用溶媒或NOB处理细胞。处理后24小时收集裂解物，并使用Dual-Luciferase Reporter System(Promega)测量萤火虫和海肾荧光素酶的活性。无论配体(激动剂或反向激动剂)的性质如何，已显示与这些嵌合受体的配体相互作用降低这些嵌合受体的转录活性(Wang等，2010a；Wang等，2010b)。

放射性配体受体结合测定。对先前描述的方案进行了少量修改(Kumar等，2010；Wang等，2010b)。对于饱和结合实验，将100ng RORα-LBD或200ng RORγ-LBD与25-[3H]-羟基胆固醇(OHC)在测定缓冲液[50mM HEPES，pH 7.4，0.05％牛血清白蛋白(BSA)，150mMNaCl和5mM MgCl2]中温育。通过过滤结合测定确定配体结合，以计算Kd值。为了进行竞争性结合测定，在4.5nM 25-[3H]-OHC存在下，将100ng RORα-LBD或200ng RORγ-LBD与各种浓度的川陈皮素、柚皮苷或柚皮素温育。Ki是使用Cheng-Prusoff方程确定的。

RNA介导的干扰。使用对照siRNA和siRNA相对小鼠RORα和RORγ(Santa Cruz)转染24孔板上的Hepa1-6细胞。转染后二十四小时，用DMSO或NOB(3μM)处理细胞。处理12小时后，收集细胞并分离总RNA。使用MaxPro3000热循环仪(Agilent)进行实时qPCR分析小鼠Rora和Rorc的mRNA表达。

统计分析。数据表示为平均值±SEM。统计学意义是根据Turkey和Dunnett检验进行多组比较的单向或双向方差分析确定的。认为P<0.05具有统计学意义。

在所有示例中，数据表示为平均值±SEM。统计学意义是根据Turkey或Dunnett检验进行多组比较的单向或双向方差分析确定的。认为P值<0.05表示有统计学意义。

分别从两个子文库发现了柑橘皮富含的天然多甲氧基黄酮，川陈皮素，可增强Clock^Δ19/⁺细胞的报告基因节律(图1A和1B)。橘皮素(一种与川陈皮素的近似的类似物)类似地增强了Clock^Δ19/⁺细胞中的PER2::Luc报告基因节律(图2A和2B)。川陈皮素稳健地增强了PER2::LucSV报告基因的节律振幅(Chen等，2012)，并且以剂量依赖性方式延长了周期，估计半数最大有效浓度<5.0mM(图1C)。与以前报道的CEM相似(Chen等，2012,2013)，川陈皮素在恢复时钟受破坏的纯合Clock^Δ19/⁺报告细胞的节律方面无效(图1D)。重要的是，川陈皮素增强了Clock^Δ19/⁺和WT报告基因敲入小鼠的外周组织外植体中的PER2::Luc报告基因节律(图1E和2C)，但在SCN中却没有，后者由于稳健的神经元间耦合而对外部扰动具有抵抗力(图2D)(Buhr等，2010；Chen等，2012；Liu等，2007)。根据SCN对川陈皮素操纵的抗性，在用川陈皮素处理的WT C57BL/6J小鼠中观察到了正常的滚轮活动和周期性(图1F)。

川陈皮素已显示出各种有益作用(Ben-Aziz，1967；Cui等，2010；Mulvihill等，2011；Nagase等，2005；Walle，2007)。但是，其作为昼夜节律时钟的调节剂的作用在先前是未知的。尽管川陈皮素轻度地改变和降低PER2::LucSV细胞在CT20的Per2转录水平(图2E)，但发现PER2蛋白积累到更高的水平(图2F-2G)，这与增加的生物发光是一致的，并表明PER2富集的转录后机制。川陈皮素也改变了其他核心时钟基因的表达(图2E-2G)。特别是CRY1(振荡器负臂中PER的异二聚体伴侣)，尽管转录水平显著降低，但仍显示出蛋白质丰度更大的轻微趋势(图2E和2F)。PER2和CRY1的同时富集与以下想法一致：PER2和CRY1蛋白使彼此稳定(Yagita等，2002)，负臂的化学计量比提高可以导致小鼠成纤维细胞的整体昼夜节律振幅增加(Lee等，2011)。

示例2.川陈皮素对饮食诱导型肥胖(DIO)小鼠的稳健的时钟依赖性代谢保护

最近的研究表明，川陈皮素对代谢综合征具有保护作用(Kurowska和Manthey，2004；Lee等，2010，2013；Mulvihill等，2011；Roza等，2007)。因此，药代动力学研究揭示，川陈皮素具有明显的脑部和全身性暴露(图3A)。为了解决川陈皮素的代谢保护是否依赖于时钟功能，选择了使用WT和时钟受破坏的Clock^Δ19/+小鼠的饮食诱导型肥胖(DIO)小鼠模型。

除组织外植体实验外，所有研究的动物饲养均在机构动物护理和使用委员会(IACUC)准则下进行，并且按照德克萨斯大学休斯敦健康科学中心(UTHSC-H)批准的动物协议中的描述进行操作。根据德克萨斯大学西南医学中心IACUC的准则，维护用于组织外植实验的PER2::Luc报告基因敲入小鼠。成年小鼠耳朵成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞在先前已有描述(Chen等，2012)。

对于饮食诱导型肥胖，对6周龄的雄性小鼠喂饲HFD(D12492；研究饮食)，直到实验方案结束。在整个实验期间，每隔一天在ZT8-ZT10的时间窗口内，通过口服管饲用溶媒(DMSO)或川陈皮素(200mg/kg体重)对小鼠进行处理。由于本文其他地方所述的几个原因，选择隔天一次的给药方案。如前所述进行代谢测定和能量消耗分析(Daniels等，2010；Garcia等，2013；He等，2015；Jeong等，2015)。

在用HFD饲喂的WT C57BL/6J小鼠中，相对于溶媒对照，川陈皮素处理10周显著降低了体重增加(图4A和3B)。相对于溶媒对照，川陈皮素并未显著改变食物摄入量(图4B和3C)。体重组成分析揭示，体重减轻主要归因于脂肪质量减少(图4C)和白色脂肪细胞大小(图4D和3D)。值得注意的是，在用HFD喂饲的Clock^Δ19/Δ19突变小鼠(图4A和3B)中，川陈皮素处理仅导致体重增加非常轻度的降低，而川陈皮素处理基本上没有改变脂肪质量和脂肪细胞大小(图4C、4D和3D)。尽管突变小鼠在光照阶段比WT小鼠消耗更多的食物(Turek等，2005)，但是川陈皮素并没有改变突变小鼠的食物摄入量(图4B和3C)。表明能量消耗增加，在整个昼夜循环中，用川陈皮素处理的WT小鼠与对照相比，耗氧量大大增加，在早期黑暗阶段发现最大增加(图4E和3E)。在用川陈皮素处理的WT小鼠中，呼吸商也增加了(图3F)，这与从脂质偏倚的代谢向所有主要常量营养素的更平衡贡献的转变一致。相反，在用川陈皮素处理后，Clock^Δ19/Δ19小鼠的能量消耗或呼吸商没有增加(图4E和3F)。与它对体重和能量消耗的影响一致，川陈皮素相对于对照处理大大提高了用HFD喂饲的WT小鼠的滚轮活动水平(图4F)；相反，在Clock^Δ19/Δ19小鼠的处理之间未检测到活动水平的显著差异(图4G)。

川陈皮素还改善了WT小鼠的葡萄糖和脂质稳态，但未改善Clock^Δ19/Δ19小鼠。川陈皮素降低了WT小鼠的空腹血糖水平(图5A)，并显著改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性(图5B和5C)。有趣的是，相对于溶媒对照，在用川陈皮素处理的WT小鼠中，血胰岛素水平大大降低(图5D)。川陈皮素也显著降低了WT血清和肝中的总甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平(图5E和5F)。苏木精和伊红(H&E)以及油红O染色揭示，川陈皮素可显著改善DIO WT肝的脂肪变性并基本消除脂滴的形成(图5G和3H-3J)。相反，与WT小鼠相比，川陈皮素并未显著改善Clock^Δ19/Δ19小鼠的葡萄糖和脂质稳态(图5)，其对Clock^Δ19/Δ19肝脂肪变性的有益作用明显减弱(图5G和3H-3J)。与HFD相反，常规饮食(RC)喂饲不会导致代谢失调，并且川陈皮素处理未显示出对代谢稳态的显著有益作用(图6)。总之，这些结果证明了川陈皮素对代谢综合征的时钟依赖性功效。

非甲氧基黄烷酮类，如柚皮苷及其糖苷配基衍生物柚皮素，也是天然存在的黄酮类(图7A)(Assini等，2013)，但它们未能在我们的初筛中增强细胞昼夜节律(图7B-7F)。与以前的研究(Mulvihill等，2009，2011)一致，与川陈皮素相比，柚皮苷显示出对体重增加以及脂质和葡萄糖稳态的显著减弱作用(图8)。重要的是，柚皮苷处理的轻度作用在WT或Clock^Δ19/Δ19C57BL/6J小鼠之间基本没有区别。

示例3.川陈皮素对db/db糖尿病小鼠的时钟依赖性代谢保护

考虑到用川陈皮素处理的DIO小鼠葡萄糖稳态的改善，我们接下来研究了川陈皮素对db/db小鼠的影响(db/db小鼠是已建立的肥胖和糖尿病的遗传小鼠模型，其缺乏功能性瘦蛋白受体)和时钟作用。川陈皮素处理在db/db小鼠中严重阻碍了体重增加(图9A)，降低了空腹血糖水平(图9B)，改善了糖耐受性和胰岛素敏感性(图9C和9D)并降低了db/db小鼠体内血清总甘油三酸酯(TG)和总胆固醇(TC)水平(图9E和9F)。相反，db/db Clock^Δ19/Δ19双突变小鼠表现出对川陈皮素的显著减弱的应答(图9)。在溶媒处理下，db/db Clock^Δ19/Δ19突变小鼠显示比db/db更低的胰岛素水平，这与先前在Clock^Δ19/Δ19小鼠中报道的β细胞缺陷和低胰岛素血症一致(Marcheva等，2010)。川陈皮素处理在db/db和db/db Clock^Δ19/Δ19突变小鼠中均大大降低了循环胰岛素水平，前者表现出更明显的降低(图9G)。这些结果与相对于db/db的db/db Clock^Δ19/Δ19中较低的胰岛素敏感性一致。考虑到Clock^Δ19/Δ19中胰腺β细胞增殖和胰岛素分泌的年龄依赖性缺陷(Marcheva等，2010)，未来的研究将探索川陈皮素对胰岛素水平与β细胞功能和/或胰岛素敏感性的作用之间的机制关系。

示例4.通过微阵列对肝的川陈皮素应答基因的鉴定

为了表征川陈皮素在用HFD喂饲的WT小鼠中的作用的分子基础，研究集中在主要的代谢器官肝上，在该器官中，我们观察到川陈皮素具有很强的保护作用。具体地，将来自持续10周的RC.Veh和HF.Veh或HF川陈皮素WT小鼠的肝组织制备的总RNA逆转录为cDNA，然后用生物素-UTP标记并与Illumina小鼠WG-6v2.0 Expression BeadChip杂交。该出版物中讨论的数据已保存在国家生物技术信息中心的基因表达文集(GEO)中，可通过GEO系列登记号GSE78848获得。如前所述(Yoo等，2013)，进行昼夜节律基因表达的实时qPCR和westernblotting分析。所用引物如下：

对于哺乳动物单杂交测定法，无论配体(激动剂或反向激动剂)的性质如何，已显示与这些嵌合受体的配体相互作用降低这些嵌合受体的转录活性(Wang等，2010a，2010b)。对于放射性配体受体结合测定，采用了先前描述的的方案并略作修改(Kumar等，2010；Wang等，2010b)。

与以前的研究(Kohsaka等，2007)一致，相对于缺乏RC喂饲、溶媒处理(RC.Veh)的小鼠，用HFD喂饲、溶媒处理(HF.Veh)的小鼠的肝中时钟基因表达的振荡幅度通常更低(图10A和10B)。川陈皮素改善了昼夜节律时钟转录振荡，并在很大程度上恢复了时钟蛋白节律(图10A和10B)(用HFD喂饲、川陈皮素处理的小鼠[HF.川陈皮素]与HF.Veh小鼠相比)，与其稳健的生理学功效一致。为了表征代谢输出基因表达，进行了微阵列分析。进行比较分析来以成对比较分析在时间点ZT2和ZT14的基因表达变化，即，HF.Veh与RC.Veh比较(比较表示为HF/RC)以及HF.川陈皮素与HF.Veh比较(表示为川陈皮素/HF)，其分别揭示544、229、915和243个基因的表达发生了变化(数据未显示)。重要的是，总共鉴定出251个和56个基因，它们显示了对HFD(HF/RC)应答的改变的基因表达模式，分别在一个或两个时间点(ZT2和/或ZT14)被川陈皮素(川陈皮素/HF)逆转(图10C和11A；未显示附加数据)。这些川陈皮素应答基因的功能分类(基因本体论[GO])强调了在代谢调控中的突出作用(图10D；未显示其他数据)。实时定量PCR(qPCR)分析进一步说明了川陈皮素在代谢输出基因表达中的广泛调节功能(图10E)。例如，相对于RC.Veh，已知在脂滴形成中起作用(Eckel-Mahan等，2013；Matsusue等，2008；Puri等，2007)的Cidec/Fsp27的转录表达在HF.Veh小鼠肝中被诱导为>10倍，并通过川陈皮素恢复到基线水平，这与川陈皮素在缓解肝脂肪变性的功效一致(图5G)。川陈皮素还改变了糖异生和糖酵解涉及的基因的表达(例如，Pdk4和Pkm2)。

示例5.视黄酸受体样孤儿受体(ROR)作为川陈皮素的直接蛋白靶标。

对先前的昼夜节律染色质免疫沉淀测序研究的交叉检查(Cho等，2012；Koike等，2012)揭示，63％的川陈皮素应答基因显示了核心时钟蛋白的启动子占用(图11B)，特别是REV-ERB(由c-erbA的反向DNA链编码的蛋白质)。REV-ERB和ROR分别作为负转录因子和正转录因子竞争与RORE启动子元件的结合，在昼夜节律、新陈代谢和炎症中起重要作用(Gerhart-Hines等，2013；Jetten等，2013；Kojetin和Burris，2014年)。在以前的RORγt抑制剂筛选中，川陈皮素在许多主要筛选命中，反而激活了RORγt，因此未得到进一步验证(Huh等，2011)。ROR家族受体由α、β和γ同种型组成。RORα和RORγ在组织分布和配体结合结构域结构上更相似，而RORβ更趋异(Kallen等，2002；Solt等，2010；Stehlin等，2001)。

为了表征川陈皮素与ROR蛋白之间的直接相互作用，使用25-[3H]-羟基胆固醇(25-[3H]-OHC)进行ROR竞争性放射性配体结合测定(Kumar等，2010；Wang等，2010b)。饱和曲线和Scatchard图验证了该测定，使用了与先前报道相似的Kd值(图12A和12B)(Kumar等，2010；Wang等，2010b)。重要的是，川陈皮素显示出对RORα和RORγ的LBD的稳健竞争结合，对RORγ具有更高的亲和力(图12C；参见Ki比较)。相反，柚皮苷或其糖苷配基衍生物柚皮素在相同浓度范围内显示出显著降低的结合力(图12C和12D)。与这些结合测定结果一致，川陈皮素表现出稳健的活性，如同在哺乳动物单杂交报告基因测定中GAL4-RORα和GAL4-RORγ嵌合受体的已知ROR配体SR1001(Solt等，2011)，而柚皮苷则没有活性(图12E和12F)。值得注意的是，无论配体(激动剂或反向激动剂)的性质如何，与这些嵌合受体的配体相互作用已显示出降低了这些嵌合受体的转录活性(Wang等，2010a，2010b)。这些结果一起表明川陈皮素与RORα和RORγ直接结合。

使用功能测定表征川陈皮素对RORα/γ转录活性的影响。发现在Hepa1-6细胞中存在RORα或RORγ的情况下，川陈皮素与WT而不是突变RORE元件一起剂量依赖性地增加了Bmal1启动子驱动的荧光素酶报告基因的活性(Preitner等，2002)(Fig.12G)。相反，通过小干扰RNA(siRNA)敲除编码RORα/γ的Rora/c基因废除了在Hepa1-6和U2OS细胞中对Bmal1启动子驱动的荧光素酶报告基因活性的川陈皮素介导的诱导(图12H和11C)。相对于对照处理，在用川陈皮素处理的DIO小鼠肝中诱导了若干ROR靶基因(例如Cyp7b1、IkBa和Gck)(图12I)，并且Ingenuity pathway analysis还显示了ROR在全基因组川陈皮素应答中的重要作用(图11D)。总之，这些结果表明，川陈皮素直接结合并激活ROR，并且RORα/γ对于川陈皮素对Bmal1转录的增强活性是必需的。

示例总结

总而言之，我们的无偏化学筛选鉴定了时钟增强的多甲氧基黄酮，尤其是川陈皮素。遗传学和药理学研究的有力证据表明，川陈皮素在预防小鼠代谢综合征中具有Clock基因依赖性的功效，为哺乳动物提供了证据，证明昼夜节律振幅增强是代谢疾病和其他时钟相关病状(如年龄相关下降)的药物干预策略。昼夜节律振幅增强的有益结果可能包括增强生理机能的功效、扩大刺激范围和敏化应答，这表明昼夜节律振幅增加可增强能量代谢、限时进食，因此增强能量消耗，在确定由HFD进食引起的肥胖的程度方面起主要作用。

多甲氧基黄酮在小鼠和人中引起多种益处，包括减轻对癌症、炎症、动脉粥样硬化以及最近的代谢性失调和神经退行性疾病的影响(Cui等，2010；Evans等，2012；Kurowska和Manthey，2004；Lee等，2013；Mulvihill等，2009；Nohara等，2015a)。多甲氧基黄酮通常显示出良好的药代动力学特征(Evans等，2012；Saigusa等，2011)，在本研究和以前的研究中，在长期处理小鼠中未观察到明显的毒性(Lee等，2013；Mulvihill等，2011年)。发明人小组显示了川陈皮素在通过尿素循环调控的氨处理中的作用，并且川陈皮素在Clock^Δ19/Δ19突变小鼠中对限速Cps1基因的转录诱导受到损害(Nohara等，2015a)。本研究说明了川陈皮素在昼夜节律时钟的增强，特别是ROR受体的激活中的直接作用。这些发现共同表明了控制多甲氧基黄酮的多种生理作用的统一的昼夜节律机制。ROR核受体被鉴定为川陈皮素的分子靶标。

总之，川陈皮素是一种时钟增强的天然化合物，其以时钟依赖性的方式激活ROR并防止代谢综合征，这暗示这种时增强钟化合物可应用于其他疾病(例如，心境和睡眠障碍)和老化。

根据本公开，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对组合物和方法以及在本文描述的方法步骤中或步骤顺序中加以变化。更具体地，显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都认为落入所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

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以下参考文献在一定程度上为本文阐述的过程或其他细节提供了示例性的过程或其他细节的补充，这些参考文献通过引用明确地并入本文。

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