阅读说明：本技术 预测患有肝细胞癌(hcc)或胆管癌(cca)的受试者的生存结果的方法 (Method of predicting survival outcome in a subject with hepatocellular carcinoma (HCC) or cholangiocarcinoma (CCA) ) 是由 朱拉蓬·玛希敦公主殿下 马图罗斯·鲁奇拉瓦特 吉蒂珀恩·沙伊桑蒙空 斯蒂芬·梅里尔·休伊特 于 2017-05-29 设计创作，主要内容包括：本公开提供用于产生受肝癌影响的受试者的预测性生存结果的方法。该方法优选地包括提供受试者的组织样本,该组织样本为肝细胞癌或胆管癌中的一种；进行基于核酸和/或基于蛋白质组学的试验中的至少一种,以量化所提供的样本中的polo样激酶1(PLK1)和上皮细胞转化2(ECT2)的转录组和/或蛋白质表达；推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率；和根据所推导出的比率产生受试者的预测性生存结果,当推导出的比率小于预定值时,认为受试者具有第一预测性生存结果,或当推导出的比率等于或大于预定值时,认为受试者具有第二预测性生存结果。第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％-60％的总生存百分比,并且第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％-60％或更低的总生存百分比。(The present disclosure preferably includes providing a tissue sample of the subject, the tissue sample being of hepatocellular carcinoma or cholangiocarcinoma, performing at least of nucleic acid-based and/or proteomic-based assays to quantify transcriptome and/or protein expression of polo-like kinase 1(PLK1) and epithelial cell transformation 2(ECT2) in the provided sample, deriving a ratio of PLK1 expression to ECT2 expression within a defined region on the provided sample, and generating a predictive survival result for the subject according to the derived ratio, the subject being considered to have a predictive survival result when the derived ratio is less than a predetermined value, or a second predictive survival result when the derived ratio is equal to or greater than the predetermined value, the predictive survival result corresponding to a total survival percentage greater than 40% -60% within a predetermined time period in the analysis, and the second survival result corresponding to a total survival percentage greater than 40% -60% or less within the predetermined time period in the analysis.)

预测患有肝细胞癌(HCC)或胆管癌(CCA)的受试者的生存结果 的方法

技术领域

本公开涉及用于产生患有肝癌的受试者的预测性生存结果的方法。更具体地，预测性生存结果是基于两种基因或蛋白质的表达谱产生，即，从受试者获取的癌组织样本中表现出的polo样激酶1(PLK1)和上皮细胞转化2(ECT2)。本公开还提供了配备用于通过所公开的方法产生预测性生存结果的装置。

背景技术

原发性肝癌由两个主要的组织学上不同的亚型组成，即，肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(CCA)，其诊断和治疗决策是唯一基于其基线临床特征。HCC或CCA的广泛的肿瘤异质性归因于存在复杂的、多因素病因，包括环境因素比如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、寄生虫感染和化学致癌物质。除了性别和种族/族群差异之外，其他风险因素包括不健康的生活方式，比如吸烟、过量饮酒和膳食因素³，其中肝癌主要影响男性，并且在亚洲人群中非常普遍(http://globocan.iarc.fr/)。HBV和HCV是HCC的主要致病因素，占全球肝癌的高达90％，而CCA在除了东南亚之外并不常见，比如泰国东北部，肝吸虫(O.viverrini)感染是地方病并且约60％的肝癌是CCA⁴。这些全球差异可归因于不同族群群体中存在不同病因因素。一种假设是各种致病因素可诱发不同分子机制独立地启动恶性转化，这导致肿瘤间基因组异质性。像许多其他实体癌症一样，每种类型的所提及的HCC和CCA的生物学和基因异质性式它们对治疗具有高度抗性，将它们列为全世界第二大致死性恶性肿瘤^1,2。所以，已经努力鉴定在驱动癌症发展中表达的潜在基因或蛋白质，使得患者可根据所鉴定的癌症驱动因子更好地分层，因此通过精准医学促进治疗。

例如，Chen等人⁴⁵发现ECT2表达与促进早期HCC复发中的Rho/ERK信号传导轴的激活密切相关。Sun等人⁴⁶也证明另一种基因PLK1在HCC样品中表达显著更高并且可为适用于诊断和治疗的HCC的独立预后因子。Takai等人⁴⁷在他们的出版物中得出类似的结论，支持了Sun等人46的发现。研究人员利用肝癌和PLK1或ECT2表达之间建立的关联，进一步想到几种诊断或预后手段。例如，美国专利公开第2011/03119280号公开了通过扫描包括PLK1的多个基因标记的用于HCC诊断的DNA生物芯片。大部分前述方法集中在癌症预后与候选基因或蛋白质的个体表达相关，而不是根据候选基因或蛋白质之间的相关性产生的深入信息，尽管基于多个表达候选基因的相互关系推导出诊断结果在与其他癌症类型有关的一些出版物中已经提出。Somma等人在他们的美国专利公开第2012/0197540号提供了通过测量癌症患者的组织样品中包括PLK1和ECT2的多个基因的表达水平来预测乳腺癌患者的死亡风险的方法；该方法随后采用每个测量的基因表达水平，通过预定算法计算指示受试者的死亡风险的预后评分。但是，已经公开了没有类似的方法或平台利用共表达基因或蛋白质的相互关系用于肝癌的预后或诊断。源自这种方法或平台的预后结果应适用于促进更高的治疗结果或分配医学资源。

发明内容

本公开涉及用于测量或量化从受试者获取的组织样本或样品中的PLK1和ECT2的表达的方法。尤其，本文所述的表达可指样本中转录组或蛋白质表达中的至少一种。优选地，组织样品是受HCC或CCA影响的。

本公开的一个目的是提供一种使用组织样本中测量或量化的PLK1和ECT2表达产生关于受HCC或CCA影响的受试者的预后或诊断结果的方法。预后或诊断结果一般涉及受试者的预测性生存结果或死亡风险。医生可参考预后或诊断结果来进行精准医学。

本公开的另一个目的是提供一种装置，该装置配置为，优选地以全自动或半自动方式量化PLK1和ECT2的表达，然后产生相对于受肝癌影响的受试者的医学条件的预后或诊断结果。

通过本发明可全部或部分地满足前述目的中的至少一个，其中实施方式中的一个包括用于产生受肝癌影响的受试者的预测性生存结果的方法，该方法包括：提供受试者的组织样本，该组织样本包括或为肝细胞癌或胆管癌中的一种；进行基于核酸和/或基于蛋白质组学的试验中的至少一种，以量化所提供的样本中的polo样激酶1(PLK1)和上皮细胞转化2(ECT2)的转录组和/或蛋白质表达；推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率；和根据推导出的比率产生受试者的预测性生存结果，当推导出的比率小于预定值时，认为受试者具有第一预测性生存结果，或当推导出的比率等于或大于预定值时，认为受试者具有第二预测性生存结果。更具体地，第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％-60％的总生存百分比，并且和第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％-60％或更低的总生存百分比。通常或优选地，预定时间段为，但不限于12至36个月。

在许多实施方中，基于核酸的试验为基于微阵列的技术和包括数字PCR的基于聚合酶链反应的技术中的任何一种或组合。

在数个实施方式中，基于蛋白质组学的试验包括或是人组织的组织微阵列和免疫组织化学染色的集。

在本公开的另一方面，公开了用于产生患有肝癌的受试者的预测性生存结果的装置。该装置包括：第一模块，该第一模块能够鉴定、检测或确定受试者的组织样本中的polo样激酶1(PLK1)和上皮细胞转化2(ECT2)的转录组和/或蛋白质表达；和第二模块，该第二模块配置用于推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率并且根据推导出的比率产生受试者的预测性生存结果，第二模块配置为当推导出的比率小于预定值时，认为受试者具有第一预测性生存结果，或当推导出的比率等于或大于预定值时，认为受试者具有第二预测性生存结果。更具体而言,第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％的总生存百分比，并且第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％或更低的总生存百分比。通常或优选地，基于核酸的试验上面提到的可指任何基于微阵列的技术(比如为真理)和基于聚合酶链反应的技术(包括数字PCR)中的任何一种或组合。同样地，基于蛋白质组学的试验可为人组织的组织微阵列和免疫组织化学染色。

对于多个实施方式，所公开的装置进一步包括测试模块，该测试模块能够进行基于核酸的试验或基于蛋白质组学的试验中的至少一种，以将PLK1和ECT2的表达的转录组或蛋白质与信号传导部耦合，该信号传导部形成为连续或周期性地发射第一模块可检测的信号。

在一些实施方式中，受试者优选地具有亚洲血统以获得更大准确度的结果。此外，受试者的组织样本包括或是作为肝细胞癌或胆管癌中的一种的癌。

附图说明

图1显示了利用层次聚类算法的一致性聚类的结果，左图：对应于聚类数(K)＝2-8的范围内的一致性矩阵的经验累积分布(CDF)图，中间图：相应的CDF下面积变化，右图：对应于范围在2和5之间的聚类数K的一致性矩阵。CCA或HCC样品的结果分别显示在顶行或底行；

图2(a)是基于最可变基因的一致性聚类和层次聚类的CCA亚型的热图，x-轴表示CCA亚型一致性聚类，CCA样品以列表示，由树状图分组为4个主聚类，并且基因以行表示，通过t-检验鉴定为C1和C2之间的差异表达的1189个基因的表达(FDR<0.05，倍数变化>2)显示在-3至3的log₂中；(b)是如(a)中所示的基于1020个差异表达基因(FDR<0.05，倍数变化>2)的HCC亚型的热图，x-轴表示HCC亚型一致性聚类；并且(c)是CCA和HCC亚型的子类映射，聚类之间的显著关系由Bonferroni调整p-值表示；

图3显示了VENN图，其指示由学生T检验限定的CCA和HCC的C1或C2样品之间的差异表达的基因数(FDR<0.05，倍数变化>2)，左图显示在CCA(n＝578)和HCC(n＝656)的C1中基因上调的数以及重叠基因(n＝218)，其中重叠基因的概率在统计学上是显著的(p＝3.20x10-97；超几何分布检验)，并且右图显示了对于C2上调基因的类似的结果；

图4显示了CCA亚型(上图)或HCC亚型(下图)的Kaplan-Meier生存分析；

图5显示了由GSEA分析鉴定的HCC或CCA C1或C2亚型的显著路径，由2至0的log10p-值表示(p-值从0.01至1)；

图6显示了(a)泰国人CCA亚型和y-轴上指示的已公布的签名之间的比较，每列表示肿瘤样品，每个签名的阳性由灰色条表示，阴性由黑色条表示，并且FDR>0.05的病例用白色表示，以及(b)泰国人HCC亚型和y-轴上指示的已公布的签名之间的比较；

图7显示了(a)对于HCC的染色体畸变(上图)或具有频率>30％的HCC的染色体畸变(下图)的频率，以及(b)对于CCA的类似结果；

图8显示了(a)对于CCA C1亚型(上图)或CCA C2亚型(下图)的染色体畸变的频率，拷贝数增益或损失分别以浅灰色或黑色显示，以及(b)对于HCC C1亚型(上图)或HCC C2亚型(下图)的染色体畸变的频率；

图9显示了高一致性基因和肿瘤亚型之间的关系以及具有拷贝数变化(CNV)的样品的频率；

图10是所有378个HCC病例的Kaplan-Meier图；

图11显示了基于PLK1(左图)或ECT2(右图)的免疫组织化学染色的在200x放大倍数下CCA和HCC病例的代表性图像；

图12揭示了(a)CCA病例(上图)或HCC病例(下图)中的PLK1(左图)或ECT2(右图)阵列表达和TMA评分的相关性，以及(b)CCA或HCC病例中PLK1和ECT2阵列表达或TMA评分的相关性；

图13显示了基于PLK或ECT2的中值截止的CCA病例(左图)或HCC病例(右图)的Kaplan-Meier生存分析的结果；

图14显示了(a)基于蛋白质表达(ECT2/PLK1)的比率组合的所有CCA和HCC病例的Kaplan-Meier生存分析，低截止和高截止由ECT2/PLK1比≤1(对于低组)和>1(对于高组)限定，以及(b)显示了如(a)中的HCC病例的Kaplan-Meier生存分析；

图15显示了(a)泰国人HCC与中国人HCC亚型、(b)亚裔美国人(AsA)亚型、(c)泰国人CCA与日本人CCA亚型、(d)泰国人HCC与欧洲裔美国人(EA)HCC亚型的子类映射和相关Kaplan-Meier生存分析，以及(e)泰国人CCA与白种人CCA亚型的子类映射，聚类之间的显著关系由0至1的Bonferroni-调整p值表示，并且亚型以群组(cohort)表示，泰国人群组中没有匹配的亚型，用X表示，并且聚类之间的显著关联以浅灰色表示，p<0.05；

图16显示了对于泰国人HCC、亚裔美国人HCC和泰国人CCA病例的C1和C2亚型的具有中值和标准偏差的BMI的箱线图；

图17显示了(a)表示CCA样品中的代谢产物丰度和基因表达的相关性的热图，以及(b)热图显示表示HCC样品中的代谢产物丰度和基因表达的整体相关性，浅灰色条和黑色条分别指示基于-1至1的皮尔逊R值的正或负相关性；

图18显示了(a)81种代谢产物的层次聚类分离HCC-C1(浅灰色条)和C2病例(黑色条)，和(b)77种代谢产物的层次聚类分离CCA-C1(浅灰色条)和C2病例(黑色条)，其中样品以列表示，代谢产物以行表示，并且代谢产物丰度以log2表示；

图19显示了(a)高度一致的代谢产物/基因网络的独创性路径分析，和(b)高度一致的代谢产物/基因网络的独创性路径分析，C1亚型或C2亚型的上调代谢产物分别以浅灰色和深灰色表示；

图20显示了(a)具有学生T检验p-值的C1(n＝15)和C2(n＝14)HCC样品中的三种代表性胆汁酸相关代谢产物的丰度的箱线图，和(b)C1(n＝33)和C2(n＝18)CCA样品中的三种代表性胆汁酸相关代谢产物的丰度的箱线图用学生T检验p-值显示；

图21显示了(a)HCC C1与HCC C2亚型的CIBERSORT分析，和(b)CCA C1与CCA C2亚型的CIBERSORT分析，细胞类型之间的高到低的关联分等级为1至-1，并且圆圈的尺寸表示关联的显著性，圆圈越大表示显著性越高；

图22显示了(a)具有标准偏差和学生T检验p-值的C1和C2 HCC样品中的三种白细胞类型的丰度的箱线图，和(b)具有标准偏差和学生T检验p-值的C1和C2 CCA样品中的三种白细胞类型的丰度的箱线图。

具体实施方式

下文，应描述根据本发明的代表性或优选的实施方式并通过参考所附的说明书和附图来描述本发明。但是，应理解，对应于这样的实施方式的说明书和附图是为了清楚的目的并且有助于理解，并且可以预期相关领域普通技术人员在不背离由所附的权利要求限定的本发明的范围的情况下可设计各种修改。

如本文使用的术语“基因”可指具有功能意义的DNA序列。它可为天然核酸序列，或源自天然来源或合成结构的重组体核酸序列。术语“基因”也可用于指，例如但不限于，由基因组DNA序列直接或间接编码或源自其的cDNA和/或mRNA。

本文使用的术语“转录组”意指特异性组织中转录的RNA转录体的集合，无论是编码的还是非编码的，并且优选包含该组织中产生的所有或基本上所有RNA转录体。除了大范围的其他转录体之外，这些转录体包括未翻译成蛋白质的信使RNA(mRNA)、可变剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)，比如小核RNA(snRNA)，反义分子比如短干扰RNA(siRNA)和微小RNA以及未知功能的其他RNA转录体。转录组也可指从RNA转录体翻译的蛋白质作为基因转录的延伸。

本公开的一个方面涉及用于产生受肝癌影响的受试者的预测性生存结果的方法。基本上，该方法包括如下步骤：提供受肝细胞癌或胆管癌中的一种影响的受试者的组织样本；进行基于核酸和/或基于蛋白质组学的试验中的至少一种，以量化所提供的样本中的polo样激酶1(PLK1)和上皮细胞转化2(ECT2)的转录组和/或蛋白质表达；推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率；和根据推导出的比率产生受试者的预测性生存结果，当推导出的比率小于预定值时，认为受试者具有第一预测性生存结果，或当推导出的比率等于或大于预定值时，认为受试者具有第二预测性生存结果。优选地，第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％-60％的总生存百分比，并且第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％-60％或更低的总生存百分比。本公开的发明人发现，携带肝细胞癌或胆管癌或受其影响的患病组织中的PLK1和ECT2(肿瘤标记)的相对表达与所测试的受试者的生存结果或不利地影响受试者的肝癌的急性相关。所获取的预测性生存结果可为根据所测试的受试者的医学需要促进战略治疗计划和医疗资源的相应安排的有效工具。

根据数个实施方式，本公开中受肝细胞癌或胆管癌影响的组织样本可通过本领域中已知的任何操作或医学程序获取。优选地，组织样本通过肝活组织检查的方式提取，该方式可为，但不限于，经皮、基于经颈静脉(transjangular)或基于腹腔镜的程序。对于许多实施方式，肝活组织检查的类型进行取决于用于量化与PLK1和/或ECT2相关的转录组和/或蛋白质的表达的下游试验。例如，通过腹腔镜检查获取的组织样本更适于基于蛋白质组学的试验，比如组织微阵列，其需要要制备用于免疫化学染色和信号检测的样本中的足够区域。另一方面，优选经皮活组织检查获得的受试者组织样本用于基于核酸的试验，使得对应于从样本提取的PLK1和/或ECT2的表达的mRNA或转录组，按比例扩增，并最终量化。

对于许多实施方式，基于核酸的试验为基于微阵列的技术和基于聚合酶链式反应的技术，包括数字PCR中的任何一种或组合。基于核酸的试验一般涉及从预定尺寸的组织样本提取总mRNA或转录组，随后在有或没有选择性扩增PLK1和/或ECT2的mRNA或转录组的情况下，选择性量化与PLK1和/或ECT2表达相关的mRNA或转录组。优选地，PLK1和/或ECT2的转录组在平台上锚定的基本上互补的探针上杂交。杂交过程配置为发射信号，优选地光信号，可由位于接***台或在平台内的一个或多个传感器检测。探针用信号传导部标记，该信号传导部形成为在杂交并形成双链的核酸时产生光信号。所发射的信号优选地与平台中已发生的杂交反应的数量成比例，该杂交反应能够通过参考预先建立的标准随后量化PLK1和/或ECT2表达。

类似地，对于多个实施方式，基于蛋白质组学的试验是人组织的组织微阵列和免疫组织化学染色，通过其PLK1和/或ECT2的表达的蛋白质或肽选择性耦合至一个或多个信号传导部，随后检测从耦合的信号传导部释放的信号传导，从而使得量化PLK1和/或ECT2表达。例如，在组织微阵列(TMA)中，所获取的组织样品用于制备0.5-2.0mm的***固定和石蜡包埋的组织样品的核。所制备的组织样品以载玻片的形式以1至10μm TMA切片进行免疫组织化学处理。此外，包含组织样本的修剪区段的载玻片在二甲苯中脱石蜡，并在分级醇中再水合。然后用酸性缓冲液在压力下进行抗原修复5至60分钟。将抗PLK1(小鼠单克隆)以1:1000稀释度在2％脱脂乳溶液中在室温下施用于处理的组织样品1至4小时。将抗ECT2(小鼠单克隆)以1:500的稀释度在2％脱脂乳溶液中施用。通过使抗体与靶向肿瘤标记或蛋白质接触，所公开的方法导致通过传感器或系统(比如商业上可得的那些，例如，Envision+系统(Dako)同时使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB))可分离的抗原-抗体复合物的产生。优选地，载玻片用苏木精复染，脱水，清除并盖上盖玻片。标记或染色的PLK1和/或ECT2的检测可在200X或更高的放大倍数下进行，以量化限定区域内的PLK1和/或ECT2表达。值得注意的是，量化可由受过训练的人员手动进行，或在耦合到计算设备的信号传感器或图像分析仪的辅助下进行。优选地，可对处理的组织样本进行各种图像参数或属性(比如肿瘤细胞与指示信号或染色的强度的百分比)的评分。产生的不同图像属性的评分可进一步操控，比如通过彼此相乘的方式或输入到一个或多个算法中，以产生关于受肝细胞癌或胆管癌影响的受试者的更有见地的发现。在许多实施方式中，所公开的方法中的PLK1或ECT2的表达水平对应于或从处理的样本获取的评分或对于处理的样本捕获的图像相乘来限定。表达水平可通过将表达PLK1或ECT2的肿瘤细胞的百分比的评分与表达PLK1或ECT2的信号或染色的强度的评分相乘的方式来量化，提供评分基本上代表每个肿瘤标记的表达水平的计算评分。对于这种实施方式，所考虑的肿瘤标记的表达水平对应于计算评分。对于每个图像属性的评分的等级的范围可为1-15，更优选地1-10，并且最优选地1-4。对处理的样本的多个区域进行独立地评分；在所公开的方法使用这些独立评分计算平均值以获得PLK1和/或ECT2表达的更好的表示的一些实施方式中，潜在地产生更大准确度的结果。

利用通过基于核酸或基于蛋白质的试验检测和量化的所表达的转录组和/或蛋白质，所公开的方法旨在推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率。例如，当PLK1的表达水平被数字地表示为12并且计算的ECT2的表达水平为8时，推导出的比率为1.5。对于数个实施方式，该比率可通过将使用ECT2和PLK1表达水平的前述比率的分子和分母分别倒置作为分子和分母来计算或运算。优选地，该区域具有的尺寸为，但不限于，长度为0.1mm至1.0mm，0.1mm至1.0mm且厚度为1mm至4um。为了简化推导出受试者的预测性生存结果的过程，所公开的方法认为受试者在推导出的比率小于预定值时具有第一预测性生存结果或在推导出的比率等于或大于预定值时具有第二预测性生存结果。在各种实施方式中，预定值可为与所使用的评分的0-4等级相关的0至16的范围内的任何数量，但不限于此。预定的数量可在0.001至1的范围内，也取决于相关实施方式中应用的评分的等级。此外，推导出的比率可被分析或在数学上进一步与与肝细胞癌或胆管癌相关的其他基因或蛋白质的表达水平相关联，以产生进一步或更能具决定性的预测或观察。

如所上述，根据一些实施方式，第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％-60％的总生存百分比，并且第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％-60％或更低的总生存百分比。另外，产生的生存百分比可被视为提供关于所测试的受试者对于肝细胞癌或胆管癌的一般治疗的潜在反应性的经验信息的指标。当受试者与第二预测性生存结果或相对差的生存百分比相关联或指定为此时，所测试的受试者可能必须经历可选的治疗选项而不是常规的补救。本公开的发明人还注意到，所公开的方法对于亚洲基因构成或亚洲血统的那些受试者产生更可靠的或稳健的结果。

在一些实施方式中，预测性生存结果描绘或仅描绘受试者在预定时间段内的生存百分比，该预定时间段优选地跨越6至48个月，或更优选地12至36个月。

根据本公开的另一方面，公开了用于产生受肝癌影响的受试者的预测性生存结果的装置。尤其，所公开的装置包括：第一模块，该第一模块能够鉴定或检测受试者的组织样本中的PLK1和ECT2的转录组和/或蛋白质表达；和第二模块，该第二模块配置为推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率，并根据所推导出的比率产生受试者的预测性生存结果，第二模块配置为当推导出的比率小于预定值时，认为受试者具有第一预测性生存结果，或当推导出的比率等于或大于预定值时，认为受试者具有第二预测性生存结果。优选地，第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％-60％的总生存百分比，并且第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％-60％或更低的总生存百分比。

本公开中描述的第一模块可为在基因、蛋白质组学、免疫化学和/或组织化学的原理下可操作的任何已知平台，以选择性地使PLK1和/或ECT2表达可通过人或机器阅读检测。所以，在一些实施方式中，所公开的装置可进一步包括测试模块，该测试模块能够进行基于核酸的试验或基于蛋白质组学的试验中的至少一种，以将PLK1和ECT2的表达的转录组或蛋白质与信号传导部耦合，该信号传导部形成为连续或周期性地发射第一模块可检测的信号。尤其，第一模块配置为表达PLK1和/或ECT2的转录组和/或蛋白质与能够释放可检测的信号的信号传导部附接或耦合，以突出信号传导部耦合的表达的转录组或蛋白质的存在。本公开的第一模块可由多个工作站组成，多个工作站布置成运行顺序过程以制备和处理组织样本从而最终导致鉴定PLK1和/或ECT2表达。这些多个工作站可根据所公开的实施方式的优选相互连接或彼此独立地操作。优选地，在更多实施方式中，第一模块包括照明设备，用于第一模块突出PLK1和/或ECT2的表达，和设计用于创建被照射的样本的数字图像的图像捕获设备；第一模块为第二模块上传拍摄图像，以分析并推导出预测性生存结果。最优选地，第一模块在通信中将创建的数字图像存储在数据库使得可回忆并进行进一步分析存储的图像。例如，第一模块可为基因表达微阵列或组织微阵列系统，用于检测并量化受肝细胞癌或胆管癌影响的组织样品中的PLK1和/或ECT2的表达。

根据许多实施方式，第二模块适于推导出所提供的样本上限定的区域内PLK1表达与ECT2表达的比率，或反之亦然，并产生与推导出的比率相关的受试者的预测性生存结果。第二模块可为安装有呈计算程序的形式的命令集的计算装置，以对捕获的图像运行分析，可根据进行的分析相应地操控捕获的图像的属性。优选地，第二模块分析处理的组织样本，或更优选地处理的组织样本的图像，并提供对各种图像参数或属性(比如肿瘤细胞的百分比和指示信号的强度或所显示的染色)的评分。第二模块可进一步操控产生的不同图像属性的评分，比如将评分彼此相乘或将评分输入到一个或多个算法中以产生关于受肝细胞癌或胆管癌影响的受试者的更有见地的发现。此外，在更多实施方式中，第二模块在数字计算的评分中限定PLK1或ECT2的表达水平，该评分是由处理的组织样本捕获的图像中的多个属性单独关联的不同评分得到的。例如，第二模块通过将所检测的表达PLK1或ECT2的肿瘤细胞的百分比的评分与信号的强度或表达PLK1或ECT2的染色的评分相乘来量化表达水平，产生基本上代表每个靶向肿瘤标记的表达水平的计算评分。对于这种实施方式，感兴趣的肿瘤标记的表达水平由对应于计算评分的所公开的装置来考虑。对每个图像属性的评分的等级的范围可为1-15，更优选地1-10，并且最优选地1-4。在一些实施方式中，第二模块对处理的样本的多个区域产生单独评分，第二模块计算这些独立评分的平均值以获得捕获的图像中的PLK1和/或ECT2表达的更好表示。

此外，第二模块在所提供的样本的限定区域内计算或推导出PLK1表达与ECT2表达的比率，或反之亦然。优选地，该预期具有长度为0.1至1.0mm，0.1至1.0mm和厚度为1至4um的尺寸。为了简化推导出受试者的预测性生存结果的过程，所公开的第二模块，当推导出的比率配置为当推导出的比率小于预定值时，认为受试者具有第一预测性生存结果，认为受试者具有第一预测性生存结果，或当推导出的比率等于或大于预定值时，认为受试者具有第二预测性生存结果。预定值可为任何数量，但在0至16的范围内不限，这取决于实施的评分的等级。如上面提到的，第一预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内大于40％-60％的总生存百分比，并且第二预测性生存结果对应于生存分析中预定时间段内40％-60％或更低的总生存百分比。优选地，预定时间段优选地跨越6至48个月，或更优选地12至36个月。

对于一些实施方式，基于核酸的试验是用于DNA和/或RNA多核苷酸检测的基于微阵列的技术，和基于聚合酶链式反应的技术(包括数字PCR)中的任何一种或组合。

在其他实施方式中，基于蛋白质组学的试验是人组织的组织微阵列组织微阵列和/或免疫组织化学染色。

下述实施例旨在进一步阐释本发明，而没有任何意图将本发明限于其中描述的特定实施方式。

实施例1

群组和临床样本

在本研究中使用源自TIGER-LC群组的199名连续患者(130名CCA患者和69名HCC患者)的398个手术配对肿瘤和非肿瘤样本集。肿瘤诊断由病理学评估确认。临床、人口统计学、社会经济学和发病率数据从综合问卷和医学图表记录中摘录。在本研究中评估的临床变量的列表在增补表S1中提供。来自TCGA的156名亚洲HCC患者和163名白种人HCC患者的特征也用于本研究(TCGA Research Network:http://cancergenome.nih.gov/.)。最近描述了来自独立群组的104名白种人CCA患者和182名日本患者的特征^14，25。先前描述了来自LCI的247名中国患者的HCC群组³⁵。从本研究中包括的所有患者获得知情同意书并由各自机构的机构审查委员会批准。

RNA分离和转录组学

根据制造商的方案，使用TRIzol(Invitrogen)从冷冻组织提取总RNA。仅包括用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)确认的具有良好RNA质量的RNA样品用于阵列研究。Affymetrix人转录组阵列2.0用于测量配对肿瘤和非肿瘤组织样本中的转录体。使用稳健多阵列平均(RMA)方法和草图分位数归一化方法将原始基因表达数据归一化。对于具有多于一个探针集的基因，计算平均基因表达。按照MIAME指南(GEO系列GSE76297)，将微阵列平台和数据提交给NCBI的基因表达汇编(Gene Expression Omnibus，GEO)公共数据库。三个独立群组的基因表达数据可通过GEO系列(GSE14520和GSE26566)、TCGA和欧洲基因组-表型组档案(European Genome-phenome Archive，EGA)数据库(EGA00001000950)获得。所有表达数据都是log₂转化的。一致性聚类(c聚类；层次聚类；皮尔逊(Pearson)距离；完全连锁；1000重采样迭代)用于使用2615个最可变基因集限定HCC或CCA中的亚型，其在TIGER-LC HCC和CCA群组(基因过滤器：从基因的中值变化1.5倍，Log强度变化p值>0.01)中都是共有的。使用单独群组和上述的2615个最可变基因之间的共有的基因进行验证群组的c聚类。层次聚类(Partek基因组套件6.6；皮尔逊距离；完全连锁)用于确定和可视化由c聚类限定的各个亚组之间的关系。使用SubMap模块(http://genepattern.broadinstitute.org/)¹¹中的默认设置，使用无监督子类映射方法(SubMap)来鉴定独立群组之间的共有亚组。

之前的研究已显示，HCC和CCA具有广泛的肿瘤间，但在较小程度上，肿瘤内异质性，如由转录组分析所确定^5-7。为了限定泰国人CCA和HCC患者中的分子同质肿瘤亚组，对源自199名患者的398个手术样本进行Affymetrix人转录组阵列2.0。其中，153名通过了质量控制测试并用于转录组分析。一致性聚类(c聚类)用于限定HCC和CCA中的亚型，如先前所述8。基于共有分布的以及相应的一致性矩阵(图1)，c聚类揭示了CCA的4个主要亚组和HCC的3个主要亚组。由c聚类限定的各种亚组之间的关系可通过无监督层次聚类(图2A-B)来可视化。该分析揭示了具有不同基因表达模式的HCC或CCA病例中的独特亚组。

数个最近的研究描述了CCA和HCC之间的转录组学相似性^9,10。本公开使用子类映射(SM)以更好地限定CCA和HCC的分子亚组之间的关系¹¹。该分析揭示了CCA-C1和HCC-C1亚型具有类似的基因表达矩阵，而CCA-C2和HCC-C2/C3亚型类似(图2C)。但是，在非肿瘤组织中未观察到该关系，表明亚型相关的基因是肿瘤特异性的。C1和C2亚型中基因表达一致性的分析揭示了基因聚类1(GC1)中上调的基因在CCA-C1和HCC-C1之间是类似的(图2A-B和图3)。在GC2基因聚类中观察到了类似的结果。有趣的是，限定为CCA-C1和HCC-C1的病例具有差的生存率，而CCA-C2和HCC-C2中的那些具有较好的生存率，如图4中所揭示。如图5中所示，亚型特异性基因签名的基因集富集分析(GSEA)揭示了CCA-C1和HCC-C1亚型均富含有丝***检查点信号传导路径，表明该亚型包含高染色体不稳定性。相反，CCA-C2和HCC-C2亚型富含细胞免疫性相关的路径，表明炎症性反应与C2亚型相关。这些结果指示尽管CCA和HCC之间不同的组织学差异，但存在具有类似的基因表达矩阵和肿瘤生物学的共有亚型。

数个基因签名与HCC/CCA预后亚型、癌症干细胞特征和肿瘤转移相关^5,6,12-15。因此我们使用最近模板预测算法检查了泰国人HCC亚型和已知签名之间的关系¹⁶。我们发现CCA-C1和HCC-C1亚型都富含S1-2相关基因-基于Hoshidas的研究^6,11,16，干细胞基因-基于Lees的研究^12，34和EpCAM基因-基于Yamashitas的研究¹³。类似地，CCA-C1亚型富含S1-2基因、干细胞基因和EpCAM基因(图6)。另外，CCA-C2和HCC-C2都富含上述签名为阴性的病例，而C3/4亚型包含混合病例。相反，2级签名¹⁴和增殖签名¹⁵没有很好地分离出共有亚型。

肝癌的主要标志是其与各种类型的病因因素的关联和其在临床表现和潜在肿瘤生物学中的高异质性。因此，大多数患有肝癌的患者难以治疗并具有令人沮丧的结果。改善其结果所需的基本要求之一是提供能够准确限定同质分子亚型的诊断工具试剂盒，每个分子亚型表现出示独特的肿瘤生物学和潜在地成药驱动基因以便选择基于分子亚型实施合理的治疗。因此，开发注释良好的癌症患者生物库，比如TCGA和ICGC的尝试，是进一步发展精准医学目标的关键资源。目前，TCGA和ICGC主要包括主要源自北美、欧洲和日本的HCC样本。考虑到HCC和CCA在亚洲人群中更为普遍，本公开建立了TIGER-LC联盟以在肝癌(尤其CCA)常见的泰国进行病例对照研究。

肝癌发生是几十年内各种癌症驱动因子的基因和表观基因改变的积聚导致的复杂过程。由于各个肿瘤细胞需要适应由不同病因因素诱导的微环境应激的事实，因此预期不同肿瘤类型之间肿瘤进化会有很大差异。因此，肝癌尤其容易是基因异质性的。虽然全基因组/外显子组测序方法在鉴定潜在癌症驱动因子方面是有效的，但候选HCC或CCA相关驱动因子突变是非常异质的，因为各个肿瘤以各种组合携带许多低频率突变的基因^25,31,32。此外，全外显子组测序表征的大部分这些基因异常已被认为是对被诊断的肿瘤没有任何功能影响的乘客或组织学突变³³。对于表征为候选驱动因子的具有相对较高突变频率的那些基因，携带这些候选驱动因子的不同组合的不同肿瘤病变之间的巨大肿瘤间异质性是明显可见的^31,32。可想到，不同癌症驱动因子的组合可作为新的收敛适应性路径出现，用于为不同亚型独特的癌细胞生存而重新布线。应注意，癌症驱动因子不仅仅可由体细胞突变获取，而且也经表观基因机制，比如致癌基因或肿瘤抑制因子基因的DNA甲基化获取。这可解释为何通过全外显子组测序找到具有独特肿瘤生物学的稳定肿瘤亚型是非常有挑战性的，因为它仅捕获了一部分肿瘤特征。相反，转录组学分析已经成功限定了可反映其独特肿瘤生物学的稳定HCC亚型^6,13,34-36，但是通过基于转录组的方法限定不同肿瘤亚型之间的关键驱动基因一直具有挑战性。与基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据相关的综合组学可能是解决肿瘤异质性和癌症驱动因子的关键。

实施例2

DNA分离和体细胞的拷贝数改变(SCNA)

使用苯酚/氯仿提取方案从冷冻组织提取总DNA。包括具有足够量的双链DNA的样品，如由Quant-iT PicoGreen dsDNA试验试剂盒(Thermo Fisher Scientific)确认，用于阵列研究。Affymetrix全基因组人SNP阵列6.0用于测定配对的肿瘤和非肿瘤组织样本中体细胞的拷贝数改变(SCNA)。原始SCNA数据可通过GEO系列GSE76213访问。使用Partek基因组套件7.5分析CCA和HCC的SCNA，对于每个患者，使用配对的非肿瘤组织作为参照。使用Partek中的基因组分割算法发现CCA和HCC中的分割区域。为了鉴定与SCNA一致调节的基因，在拷贝数分割区域和来自CCA或HCC组织的转录组数据之间计算皮尔逊相关值。为了限定C1和C2亚型特异性一致基因，考虑位于具有正相关值和p-值≤0.005的分割区域的基因。为了限定CCA和HCC中的C1和C2亚型的拷贝数一致基因，使用来自学生T检验的p-值和用于C1和C2 CCA或HCC亚型之间的类别预测的最可变基因中log₂转化表达值的倍数变化。为了鉴定CCA和HCC中的C1亚型特异性拷贝数一致基因，当比较C1和C2亚型时，本公开的发明人选择了具有学生T检验p-值≤0.005的基因。

接下来本公开的发明人使用Affymetrix全基因组人SNP阵列6.0确定泰国肿瘤样本和配对的非肿瘤组织(作为对照)中的体细胞的拷贝数改变(SCNA)。与先前公布的研究¹⁷一致，在如图7A中所呈现的，在HCC样本中，分别在1q、6p、8q和4q、8p、13q、16、17p上具有反复性增益和损失的典型SCNA谱是明显的。发现HCC和CCA之间的SCNA谱差别很大(图7B)。但是，当发明人分析基于C1和C2亚型的SCNA谱时，与CCA-C2和HCC-C2图8A-B比较时，在CCA-C1和HCC-C1中均发现存在明显更高程度的反复性增益和损失。该结果与转录组和GSEA分析一致，并且表明CCA-C1和HCC-C1包含有丝***检查点缺陷，这可导致更高程度的非整倍性。

为了基于驱动基因应在SCNA和基因表达中具有高度一致性改变的概念^17，18来确定潜在的亚型相关驱动基因，本公开的发明人首先在SCNA和转录组之间进行皮尔逊相关性。该分析揭示了基因的子集之间有显著的正相关性(增补图5A-B)，即，对于CCA-C1的239个基因和对于HCC-C1肿瘤样本的89个基因。其中，51个基因在CCA-C1和HCC-C1之间重叠，表明在HCC和CCA中存在共有亚型特异性驱动因子。一致地，如图9中所示，更多拷贝数增益和升高的表达与C1亚型，而不是与C2亚型相关联。与上述发现一致，这51个基因的网络分析揭示了富含与PLK1信号传导相关的有丝***检查点信号传导路径。另外，ECT2是在C1和C2亚型之间排名最高的差异表达基因。使用图10中所呈现的TCGA HCC数据集观察到了类似的结果。

实施例3

免疫组织化学

对于胆管癌和肝细胞癌，用已被SH 44检验为的独立TMA的来自固定的***、石蜡包埋的组织的1.0mm核构建组织微阵列(TMA)。将来自患者的正常组织的匹配TMA构建为参照。所有TMA包含内部对照组织。在5μm TMA切片上进行免疫组织化学。将第一载玻片在二甲苯中脱石蜡，并在分级醇中再水合。用pH6柠檬酸酯缓冲液在高压锅中进行抗原修复20分钟。在室温下，将1:1000稀释的抗PLK1(小鼠单克隆，克隆CN05-844，Millipore)以1:1000稀释度在2％脱脂乳溶液中施用2小时。将抗ECT2(小鼠单克隆，“E-1”cat SC-514769,SantaCruz Biotechnology)1:500的稀释度在2％脱脂乳溶液中施用。用Envision+(Dako)二级和DAB检测抗原-抗体复合物。将载玻片用苏木精复染，脱水，清除并盖上盖玻片。进行阳性和阴性对照。将匹配的正常肝的TMA与肿瘤TMA同时染色。在200X放大倍数下进行免疫组织化学染色的解释。针对染色的肿瘤细胞的百分比(以四分位计0-4)和染色的强度(0-4)对肿瘤评分。将两个值相乘(0-16范围)。正常组织TMA未能显示肿瘤标记的染色。使用中值评分确定高或低水平的PLK1或ECT2。从原始数据计算ECT2/PLK1比率，并且低组的切点确定为ECT2/PLK1比率≤1，并且高组的切点为>1，类似于先前描述的24，并且绘制为Kaplan-Meier图。Cox-Mantel对数秩检验用于统计分析。

使用基因集富集分析(GSEA)版本16和独创性路径分析(IPA)版本24718999进行路径分析。使用GraphPad Prism 6将Kaplan-Meier生存分析用来比较患者生存，并且通过Cox-Mantel对数秩检验产生统计p-值。除非另有说明，否则所有p-值为双侧的，并且统计显著性限定为p<0.05。使用基于预测置信度错误发现率(FDR)截止值0.05，在GenePattern中实施的最近模板预测算法来确定先前报告的签名与泰国人CCA和HCC群组之间的关系。使用CIBERSORT 30进行来自CCA或HCC的组织表达谱的免疫/炎症性细胞子集的相对分数的评估。通过log2标度表达矩阵的分位数归一化转换基因表达数据，并且根据具有使用内置LM22签名矩阵(LM22)的所实施的分析的网站(cibersort.stanford.edu/)量化CCA和HCC的C1和C2亚型中的白细胞的相对分数。实用Welch双样品t-检验来比较C1和C2亚型之间的22个相对白细胞分数中的每一个。使用皮尔逊相关性分析来确定C1和C2亚型中的白细胞和BMI之间的相关性。

获取的数据表明ECT2和PLK1可为有利于检测HCC和CCA亚型的临床相关的功能性生物标记，因为这两种基因先前已与肿瘤进展相关联^19-21。因此本公开的发明人通过免疫组织化学(IHC)对199名泰国患者的组织微阵列(TMA)评估ECT2和PLK1。构建了CCA和HCC的TMA。PLK1在细胞质中检测到，但是在正常肝细胞中不表达(图11)。ECT2在细胞核中表达，但是在正常肝细胞中不存在。通过IHC的表达检测与图12A中提供的mRNA数据相关。进一步的分析，图12B，证实了在RNA水平和蛋白质表达水平上PLK1和ECT2表达的相关性。对PLK1和ECT2进行生存分析分别显示，图13，具有PLK1或ECT2的高TMA评分的患者具有不良结果的趋势。鉴于PLK1和ECT2之间的表达的实质相关性和以及已证实PLK1在体外磷酸化ECT2的事实²²，发明人评估两个生物标记的组合以预测结果。基于相关生物标记的比率组合的先前实例^23,24，本公开从TMA评分产生PLK1/ECT2比率，并进行生存分析，如图14A-B所示，其表明PLK1/ECT2比率对于区分结果是稳健的(CCA，p＝0.01，HCC，p＝0.012)。

进行的实验揭示了C1亚型与有丝***检查点缺陷相关，并且PLK1和ECT2是对C1的两个临床相关的关键基因。发现PLK1和ECT2表达在C1亚型中均高度表达，并且在使用IHC限定肿瘤亚型方面是稳健的。这具有临床意义，因为IHC是病理学诊断的优选方法。ECT2基因也在C1亚型中优选扩增或突变，其对于该亚型是驱动基因的假设是一致的。一致地，PLK1和ECT2均在功能上与癌症相关。PLK1是有丝***丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一，并且是启动有丝***和调节纺锤体装配所需要的。已经在人肿瘤(包括HCC)中发现过度反应性的PLK1信号传导，并且因为其在致癌网络中的关键功能节点，已经提出其用作治疗癌症的潜在靶标¹⁹。目前许多PLK1抑制剂正在实体瘤中测试³⁷。ECT2属于Ras超家族GEF和GAP²⁰，并且基于其转化NIH 3T3细胞的能力最初在1991年鉴定的经典癌基因²¹。已提出其作为癌症疗法(包括HCC)的的易处理靶标的作用，因为其负责促进HCC的早期复发^20，38。获取的结果提示PLK1和ECT2表达可用作用于亚洲HCC和CCA的C1亚型的患者分层和分子靶标的生物标记。

实施例4

种族/族群相关的共有肿瘤亚型

为了确定我们在泰国样品中观察到的CCA和HCC的共有分子亚型是否是通用的，本公开的发明人检查了具有来自亚洲、欧洲和北美居住的患者的可用转录组数据的数个独立群组。这些包括来自中国的247名HCC患者、来自美国的378名HCC患者(TCGA数据)、来自欧洲的104名CCA患者和来自日本的128名CCA患者。SM用于确定由转录组鉴定的各种亚型之间的相似性。我们发现C1或C2预后分子亚型在中国人HCC患者、亚裔美国(AsA)HCC患者、日本人CCA患者中观察到，但是在欧洲裔美国人(EA)HCC患者中或在欧洲CCA患者中未观察到(图15)。在来自美国的HCC患者中也观察到显示51个共有亚型相关基因和种族/族群相关预后的关联的类似结果。一并考虑，这些结果表明CCA和HCC的共有预后分子亚型也与种族/族群有关。

因为128个日本人CCA肿瘤的基因突变数据是可用的，所以本公开试图确定该研究中鉴定的共有亚型和由Nakamura等人²⁵描述的32个突变的基因之间是否存在任何关系。本公开发现，虽然突变数据不能清楚地区分共有亚型，且对于每种亚型的突变频率在1-43％的范围内，但TP53、KRAS、MYC和GNAS(>10％突变)中的突变显示在预后不良的C1亚型中富集，并且BAP1和IDH1中的突变在X亚型中更频繁，X亚型是与C1/C2亚型不匹配但是与良好预后相关的亚组。值得注意的是，15％的X亚型携带IDH1突变，但是C1和C2亚型都不携带IDH1突变，这表明独立于C1和C2的该独特的CCA的亚型具有明显的基因模式和更好的预后。有趣的是，发现，基于SCNA和转录组(图9)的统计学上显著数量的基因(51个驱动基因中的3个，即，NRAS、PRKCI和ECT2)与这32个突变基因重叠(p＝0.0004；超几何分布检验)。值得注意的是，6％的日本人CCA-C1亚型也显示ECT2中的突变，与我们的发现，ECT2是共有C1亚型的功能驱动因子一致。

实施例5

肥胖、代谢组学和肿瘤亚型

为了确定任何病因/人口统计学/临床特征是否与所鉴定的肿瘤亚型相关，本公开基于可用的临床变量，包括年龄、性别、吸烟和饮酒、体重指数(BMI)和肿瘤特征比较了C1和C2亚型。仅年龄、BMI状态和肿瘤尺寸在泰国人HCC的C1和C2亚型之间似乎不同。应注意，饮酒、HBV和HCV状态、由Child-Pugh评分的肝硬化、碱性磷酸酶(ALP)的水平，CA19-9、α-胎蛋白(AFP)以及肿瘤分期在CCA和HCC之间有显著差异。有趣的是，这些病因因素与共有分子亚型无关，但是它们与组织学亚型有关。

采用Metabolon's Discover HD4平台来测量配对的肿瘤和非肿瘤组织样本之间的小生物化学物质。采用以正模式和负模式(LC+/LC-)的液相色谱/质谱以及气相色谱分析/质谱(GC/MS)。总计测量了718种代谢产物。使用每种代谢产物的最小值估算缺失值。在每个群组中选择HCC和CCA群组中共有的178种最可变的代谢产物(过滤器：从代谢产物的中值变化1.5倍，对数强度变化p值>0.01)。分别计算对于每个群组的选择代谢产物和最可变基因之间的皮尔逊相关值。进一步分析中仅包括相同样品中显著相关的代谢产物和基因(P<0.05)。此外，选择与至少20％的基因显著相关的代谢产物。

进一步确定具有可用的BMI数据的泰国AsA和EA患者的BMI概况。本公开发现EA患者倾向于具有比亚洲患者更高的BMI，无论他们是否生活在亚洲或美国。C2亚型倾向于具有比C1亚型更高的BMI，并且差异是统计学显著的(图16)。为了确定BMI的差异是否与肿瘤代谢的变化有关，我们在199名来自泰国患者的HCC和CCA肿瘤样本和配对非肿瘤组织中进行了非靶向代谢组学分析。因为整合代谢产物和基因表达谱是减少假阳性和增加限定功能代谢产物的机会的有力方法²⁶，所以本公开在代谢产物和基因表达谱之间进行了全局皮尔逊相关性分析。图17中揭示了获得的结果。来自总计178种最可变代谢产物的总计77种CCA代谢产物和81种HCC代谢产物显示出与基因表达的高相关性(-0.5<R<0.5；P<0.05并且与至少20％的基因相关)。在CCA和HCC之间发现统计学上显著数量的重叠代谢产物(n＝46)(超几何分布p＝0.0007)。而且，显示与基因表达高度一致的代谢产物区分出C1和C2亚型，如图18A-B中所阐释。来自HCC和CCA的最显著的代谢产物的顶部网络非常相似(图19A-B)。本公开发现胆汁酸相关代谢产物，比如牛磺鹅脱氧胆酸盐和牛磺熊脱氧胆酸盐(TUDCA)，在HCC-C2和CCA-C中比在C1亚型中显著更更丰富(图20A-B)。

C2亚型与增加的BMI相关，已知BMI与代谢疾病和细胞炎症有关^27,28。另外，已知C2亚型相关胆汁酸代谢产物与炎症和免疫性有关²⁹。因此本公开的发明人使用CIBERSORT³⁰检查了泰国人HCC和CCA中的浸润性免疫细胞。发现C2亚型中的白细胞浸润的活性远高于C1亚型。结果如图21A-B中所示。值得注意的是，升高的CD4+记忆T细胞，以及γδT细胞，但是减少的Treg细胞，与C2亚型相关(图22A-B)。总之，结果表明，虽然C1亚型包含具有改变的PLK1和ECT2的有丝***检查点缺陷，但C2亚型具有升高的BMI、免疫细胞异常和异常的胆汁酸代谢。

本公开发现CCA和HCC，无论它们在组织学和相关病因学上的差异如何，都由仅在亚洲患者中共享的数个共有分子亚型组成。有趣地，共享不同基因表达矩阵的共有CCA和HCC亚型具有相似的预后结果，表明存在超出传统观察的组织学肿瘤亚型的共有分子类型。癌症转录组、SCNA和代谢组的系统整合揭示了侵袭性分子亚型有关的关键致癌驱动因子。具体而言，C1亚型包含有丝***检查点缺陷，而C2亚型与炎症、肥胖和胆汁酸生物发生有关。这些结果表明治疗分层不应基于组织学类型，而应基于分子类型。

代谢肝病和肥胖与肝脏炎症和癌症有关^27,28,39,40。但是，这些关联的分子机制尚不清楚。我们发现与C2亚型有关的共有临床特征是增加的BMI，表明可能与肝脏相关代谢疾病有关。由于BMI与炎症性反应和代谢疾病有关，因此我们还检查了分子限定的亚型中的肿瘤相关白细胞。发现淋巴细胞比如CD4+记忆T细胞和γδT细胞，但不是髓样细胞，在C2亚型中显著升高。这些结果与C2亚型的基因表达数据一致，C2亚型富含细胞免疫性相关路径，再次证实了炎症性反应与C2亚型有关的观点。有趣的是，在HCC和CCA中，数种胆汁酸代谢产物比如TUDCA、牛磺胆酸和甘氨酰脱氧胆酸在C2亚型中也始终比在C1亚型中更丰富。胆汁酸最近已作为调节胆固醇代谢、能量和葡萄糖稳态的多功能信号传导分子而出现，其形成了开发用于治疗常见代谢和肝脏疾病的新型药物靶标的基础⁴¹。可想到这些药物中的一些可适用于治疗肝癌的C2亚型。获得的结果也与最近的研究一致，最近的研究表明肥胖诱导的肠道微生物代谢产物脱氧胆酸通过衰老分泌促进肝癌发生以及膳食可改变人类肠道微生物组，促进膳食相关疾病，比如肥胖^29,42。而且，膳食-脂肪-诱导牛磺胆酸促进IL1缺陷小鼠的病理性扩展和结肠炎，揭示了具有某些饱和脂肪的膳食在遗传易感宿主中诱导免疫介导的疾病的貌似合理的机制基础⁴³。

虽然获得的结果表明共有C1-C2亚型主要与亚洲患者相关，但该种族/族群相关关联的原因并不清楚。貌似合理的是，西式膳食可在亚洲人和白种人之间诱导不同地生态失调，并且种族/族群相关的肠道微生物组差异可能与胆汁酸代谢协同作用以诱导亚洲人相关的共有C2亚型中观察到的不同致癌过程。C2亚型中的增加的浸润性T细胞也表明这些肿瘤可对免疫检控点抑制剂敏感的貌似合理的情况。总之，本公开中采用的整合组学方法限定了数个亚洲人群中CCA和HCC的共有分子亚型，并且鉴定了与特异性亚型有关的潜在驱动基因和代谢过程。

应当理解，本发明可以其他特定形式体现，并且不限于上述单独的实施方式。但是，所公开的构思的修改和等效方式(比如本领域技术人员容易想到的那些)旨在包含在所附权利要求的范围内。

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