卤酸脱卤酶超家族蛋白的变体及使用其降低样品中含氟化合物浓度的方法

文档序号：1586804 发布日期：2020-02-04 浏览：32次 >En<

阅读说明：本技术 卤酸脱卤酶超家族蛋白的变体及使用其降低样品中含氟化合物浓度的方法 (Variants of a halase superfamily protein and methods of using the same to reduce the concentration of a fluorine-containing compound in a sample ) 是由郑有景金兑勇朴珍雨朴焌盛李陈肃姜昌德卞钟元宋承勋于 2019-04-11 设计创作，主要内容包括：提供了卤代酸脱卤素酶超家族蛋白的变体和利用所述变体降低样品中的含氟化合物浓度的方法。(Variants of haloacid dehalogenase superfamily proteins and methods of using the variants to reduce the concentration of a fluorine-containing compound in a sample are provided.)

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月24日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2018-0086025号的权益，其公开内容以其整体通过引用并入本文。

以电子方式提交的材料的参考文献

本申请含有以ASCII格式以电子方式提交并且在此以引用的方式整体并入的序列表。在2019年3月28日创建的所述ASCII副本的名称是B2047-7124WO_SL.txt并且大小是288,381个字节。

背景

1.领域

本发明涉及重组微生物，其包括编码卤代酸脱卤素酶超家族变体蛋白的外源基因，包含用于去除样品中含氟化合物的变体的组合物，以及使用该变体降低样品中含氟化合物浓度的方法。

2.相关领域的描述

温室气体的排放加速了全球变暖，成为严重的环境问题，减少和防止温室气体排放的法规已经加强。在温室气体中，氟化气体，比如全氟化碳(PFC)、氢氟烃(HFC)和六氟化硫(SF₆)，显示了低的绝对排放量，但其具有长半衰期和非常高的全球变暖潜势，导致显著不利的环境影响。半导体和电子工业排放的氟化气体的量是氟化气体排放的主要原因，已经超过了温室气体排放的指定量，并且仍在持续增加。因此，温室气体分解和温室气体排放许可所需的成本每年都在增加。

热解或催化热氧化方法通常用于分解氟化气体。然而，这些方法具有分解率有限，二次污染物排放和成本高缺点。已经提出了使用微生物生物催化剂对氟化气体进行生物分解，克服现有化学分解过程的限制并且还以更经济和环保的方式处理氟化气体。

卤代酸脱卤素酶(HAD)超家族是酶的超家族，其包括磷酸酶、磷酸腺苷酶、P型ATP酶、β-磷酸葡糖苷酶、磷酸甘露糖苷酶和脱卤素酶。HAD参与从氨基酸生物合成到脱毒的多种细胞过程。

存在对于HAD超家族的变体的需求以用于F-气体的生物分解。本文提供了这些变体。

概述

本文提供卤代酸脱卤素酶(HAD)超家族蛋白的变体。在本公开内容的一个方面，变体卤代酸脱卤素酶超家族(HAD)蛋白包含对应于SEQ ID NO： 2的N206，T208或V210位的至少一个氨基酸残基的单独取代，或与对应于 SEQ ID NO：2的位置S184的氨基酸残基的取代。在另一方面，对应于SEQ ID NO：2的位置S184的氨基酸残基的取代是S184H，S184K或S184R；对应于SEQ ID NO：2的N206位的氨基酸残基的取代是N206M，N206G，N206A， N206V，N206L，N206I，N206F，N206W或N206P；对应于SEQ ID NO：2 的位置T208的氨基酸残基的取代是T208Q，T208S，T208C，T208Y或T208N；对应于SEQ ID NO：2的V210位的氨基酸残基的取代是V210D或V210E。

提供了组合物，其包含变体和包含该变体的重组微生物或编码所述变体的多核苷酸。

任选地，载体，其用于降低样品中含氟化合物浓度。

进一步提供了编码变体的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体。

还提供了降低样品中含氟化合物浓度的方法，该方法包括使包含含氟化合物的样品与本文所述的变体HAD蛋白或重组微生物接触，以降低样品中含氟化合物的浓度。

附图简述

通过结合附图对以下实施方案进行描述，这些和/或其他方面将变得显而易见并且更容易理解，其中：

图1是pET-SF0757载体的载体图谱；

图2是pTrc-BANF-SF0757载体的载体图谱；

图3是Dimroth回流冷凝器的示意图；和

图4显示了微泡过程流程图。

详述

现在将详细参考实施方案，其示例在附图中示出，其中，相同的标号始终表示相同的元素。在这方面，本发明实施方案可以具有不同的形式，并且不应该被解释为限于本文所列出的描述。因此，以下仅通过参考附图来描述实施方案以解释方面。诸如“……中的至少一个”之类的表达，当在一列元素之前时，修饰整列元素而不是修饰所列的单独的元素。

另外的方面将部分地在以下的描述中阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实践所示的实施方案来学习。

如本文所用的术语“基因”或“多核苷酸”可以指表达特定蛋白质的核酸的片段。基因可包括编码区的调节序列或包括5’-非编码序列和3’-非编码序列的非编码区的调节序列。调节序列可包括启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、polyA结合位点和终止子区等。

如本文所用的术语，核酸或多肽的“序列同一性”是指在某些比较区域中比对至最佳匹配后序列的碱基或氨基酸残基之间的同一性程度。序列同一性是通过两个序列的最佳比对来比较某个比较区域中的两个序列而测量的值，其中与参考序列相比，可以添加或缺失比较区域中序列的一些部分。例如，可以如下计算序列同一性的百分比：在整个比较区域中比较两个最佳比对的序列；在两个序列中出现相同氨基酸或核酸的位置的数量被确定为匹配位置的数量；匹配位置的数量除以比较区域中的位置总数(即，范围的大小)；并且将除法的结果乘以100以获得序列同一性的百分比。可以使用已知的序列比较程序确定序列同一性的百分比，比如，BLASTN或BLASTP(NCBI)， CLC Main Workbench(CLC bio)或MegAlign(DNASTAR Inc)。除非在说明书中另有说明，否则用于执行程序的参数的选择可以如下：E值＝0.00001 且H值＝0.001。

不同水平的序列同一性可用于鉴定具有不同物种的相同或相似功能或活性的肽或多核苷酸。例如，序列同一性可以是50％或更高，55％或更高，60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高， 90％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，99％或更高，或100％。

本公开内容的一个方面提供了卤代酸脱卤素酶超家族(HAD)蛋白的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的S184位的氨基酸残基中的氨基酸改变和对应于SEQ ID NO:2的N206、T208和V210位的至少一个氨基酸残基；或者，对应于SEQ ID NO:2的N206、T208和V210位的至少一个氨基酸残基中的氨基酸改变。

根据某些实施例，位置S184中的氨基酸改变可包括取代S184H，S184K 或S184R。N206位的氨基酸改变可包括取代N206M，N206G，N206A，N206V， N206L，N206I，N206F，N206W或N206P。位置T208的氨基酸改变可包括取代T208Q，T208S，T208C，T208Y或T208N。位置V210的氨基酸改变可包括取代V210D或V210E。

根据某些实施例，变体可以是在对应于SEQ ID NO:2的S184和N206 位的氨基酸残基中具有氨基酸改变；对应于SEQ ID NO:2的S184、N206和 T208位的氨基酸残基改变；或对应于SEQ ID NO:2的S184、N206和V210 位的氨基酸残基改变。

关于变体，氨基酸改变可包括在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的S184H 和N206M的置换；SEQ ID NO:2的氨基酸序列中S184H、N206M和T208D 的置换；或SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的S184H、N206M和V210D的置换。

关于变体，HAD超家族蛋白可为磷酸酶、膦酸酯酶、P型ATP酶、β-葡糖磷酸变位酶、磷酸甘露糖变位酶或脱卤素酶。HAD超家族蛋白可包括HAD 结构域。HAD超家族蛋白可以是属于EC 3.6.3.1的磷脂-易位ATP酶，属于 EC 3.1.3.45的3-脱氧-D-甘露糖-辛酸酯(KDO)8-磷酸磷酸酶，属于EC 3.1.3.70 的甘露糖基-3-磷酸甘油酸磷酸酶，属于EC 3.1.3.18的磷酸乙醇酸磷酸酶，或属于EC 3.8.1.2的HAD。

ATP酶可以是拟南芥(Arabidopsis)中参与耐寒性的推定的脂质翻转酶。 KDO 8-磷酸磷酸酶可以催化KDO生物合成的最后步骤，是革兰氏阴性细菌中脂多糖的组分。甘露糖基-3-磷酸甘油酸磷酸酶可水解甘露糖基-3-磷酸甘油酸酯以形成渗透物甘露糖基甘油酸酯。磷酸甘油酸磷酸酶可以催化2-磷酸甘油酸的去磷酸化。

HAD超家族蛋白或其变体相对于SEQ ID NO:2、7、9、11或13的氨基酸序列可具有85％或更高，90％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，或99％或更高的序列同一性。

在实施方式中，变体可以具有属于HAD超家族蛋白的酶的活性，并且例如，可以具有属于EC 3.8.1.2的卤酸脱卤素酶的活性。

改变可包括在指示的位置用翻译后修饰的氨基酸进行置换。改变可包括用20种天然氨基酸中的不同于相应氨基酸的19种氨基酸之一在指示的位置处进行置换。本文使用的氨基酸及其缩写如表1所示。

表1

关于变体，在SEQ ID NO:2的第184位、第206位、第208位和第210 位各个位点所置换的每个氨基酸可以相互处于“保守置换”的关系。如本文所用的术语“保守”或“保守置换”是指在氨基酸特征方面用相似的氨基酸置换氨基酸。第一个氨基酸可包括H184，K184或R184；M206，G206，A206， V206，L206，I206，F206，W206或P206；Q208，S208，C208，Y208或N208；SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的D210或E210E。例如，当特定位置的非脂肪族氨基酸残基(例如，Ser)被脂肪族氨基酸残基(例如，Leu)置换时，在相同的位置用不同的脂肪族氨基酸(例如，ILe或Val)置换称作保守突变。另外，氨基酸特征包括残基的大小、疏水性、极性、电荷、pK值和本领域已知的其他氨基酸特征。因此，保守突变可以包括置换，例如碱性置换为碱性、酸性置换为酸性、极性置换为极性等。例如，可以根据以下的表2进行保守置换，其描述了通常公认的氨基酸特征的分组。

表2

组别	氨基酸
		非极性	G A V L I M F W P
极性	S T C Y N Q
		酸性	D E
碱性	K R H

如本文所用的术语“对应”是指当利用本领域能接受的蛋白比对程序，比如BLAST配对比对或本领域熟知的Lipman-Pearson蛋白质比对程序对所关注的蛋白的氨基酸序列和参考蛋白(例如，SEQ ID NO:2)进行比对时，所关注的蛋白的氨基酸位置与参考蛋白的所述位置(例如，SEQ ID NO:2的S184 位)相一致。所关注的蛋白质可以是HAD，其属于例如EC3.8.1.2。存储参考序列的数据库(DB)可以是NCBI的参考序列(RefSeq)非冗余蛋白质数据库。用于序列比对的参数可以如下：E值0.00001和H值0.001。

根据上述比对条件获得并具有对应于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的 S184位的氨基酸残基的蛋白质可以是SF0757的氨基酸序列(SEQ ID NO:2) 的同源物。同源物可以与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有85％或更多的序列同一性。

在一个实施方案中，变体HAD蛋白包含具有一个或多个以下取代的SEQ ID NO：2：

(a)N206M，N206G，N206A，N206V，N206L，N206I，N206F，N206W 或N206P；

(b)T208Q，T208S，T208C，T208Y或T208N；和/或

(c)V210D或V210E；

并且任选地还包含选自S184H，S184K或S184R的取代。

本

的另一方面提供了编码HAD超家族变体蛋白的多核苷酸。

多核苷酸可以与编码锚定基序的多核苷酸连接，所述锚定基序引起变体多肽在细胞表面上表达。融合可以通过锚定基序的C末端和变体多肽的N末端之间的连接来完成。

锚定基序可包括跨膜部分和自跨膜部分沿远离细胞表面方向排列的接头部分。锚定基序可选自膜蛋白、脂蛋白和自转运蛋白。锚定基序可以是芽孢杆菌的BclA，大肠杆菌的OmpA、Lpp-OmpA、OmpC、OmpS、LamB、OmpC、 Lpp-OmpC、PhoE和FadL，沙门氏菌的OmpC，假单胞菌的OprF和致病性大肠杆菌的AIDA-I，或其片段。

锚定基序可以是具有SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29 的氨基酸序列的BclA。

本发明内容的另一方面提供了包含编码变体的多核苷酸的载体。为了用作载体，可以使用可用于将多核苷酸引入微生物的任何本领域已知的载体。所述载体例如，可以是质粒或病毒载体。

本公开内容的另一方面提供了重组微生物，其包含在此描述的HAD变体蛋白或编码变体的多核苷酸。

多核苷酸可以任选地是载体的一部分。多核苷酸可以染色体或染色体外存在于微生物中(例如，多核苷酸可以整合到宿主细胞染色体中或可以保留在宿主细胞中而不整合到宿主细胞染色体中)。微生物可以表达多核苷酸以产生变体蛋白。变体蛋白可以存在于细胞内，在细胞上表达，或释放到细胞外。

重组微生物可以是细菌或真菌，细菌可以是***或革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性菌可属于肠杆菌科。革兰氏阴性菌可属于埃希氏菌属、沙门氏菌属、黄色杆菌属或假单胞菌属。属于埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌。属于假单胞菌属的微生物可以是P.saitens SF1。属于黄色杆菌属的微生物可以是自养黄色杆菌(X.autotrophicus)。革兰氏阳性菌可属于棒状杆菌属或芽孢杆菌属。属于芽孢杆菌属的微生物可以是黑胸败血芽孢杆菌 (B.bombysepticus)SF3。

本公开内容的另一方面提供了用于还原样品中的含氟化合物的组合物，所述组合物包含重组微生物，所述重组微生物包括HAD超家族蛋白的变体或编码所述变体的多核苷酸。这里提到的含氟化合物可以是被至少一个氟取代的具有1至12个碳原子的烷烃化合物。含氟化合物可以由式1或式2表示：

<式1>

C(R₁)(R₂)(R₃)(R₄)

<式2>

(R₅)(R₆)(R₇)C-[C(R₁₁)(R₁₂)]n-C(R₈)(R₉)(R₁₀).

式1，R₁，R₂，R₃和R₄可以各自独立地为F、Cl、Br、I或H，

其中，选自R₁、R₂、R₃和R₄的至少一个为F，

在式2中，n可以是0至10的整数，并且当n等于或大于2时，R₁₁中的每一个彼此相同或不同，并且R₁₂中的每一个可以彼此相同或不同。另外， R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀，R₁₁和R₁₂可各自独立地为F，Cl，Br，I或H，其中至少一个选自R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀，R₁₁和R₁₂是F。在一些实施方式中，含氟化合物可以是，例如CHF3、CH2F2、CH3F或CF4。本文所用的术语“去除”是指含氟化合物浓度的任何减少。减少包括部分或完全减少，即浓度为零或接近零。

组合物可以包含HAD超家族蛋白的变体，HAD超家族蛋白具有属于EC 3.8.1.2的活性。组合物可包括重组微生物，其裂解物或裂解物的水溶性材料部分。

含氟化合物的去除可包括样品中含氟化合物浓度的任何降低，例如含氟化合物的CF键的裂解、含氟化合物转化成不同的材料，或含氟化合物在细胞中的积累。含氟化合物的转化可包括向含氟化合物中引入亲水基团如羟基，或将碳-碳双键或碳-碳三键引入含氟化合物中。

样品可以是液体样品，气体样品，或两者的组合。例如，样品可以是工业污水或废气，或两者。

本发明内容的另一方面提供了降低样品中含氟化合物浓度的方法，该方法包括：

使在此描述的HAD变体蛋白，或包含HAD变体蛋白或编码HAD变体蛋白的多核苷酸的重组微生物与包含式1或式2表示的含氟化合物的样品接触，以降低样品中含氟化合物的浓度：

<式1>

C(R₁)(R₂)(R₃)(R₄)

<式2>

(R₅)(R₆)(R₇)C-[C(R₁₁)(R₁₂)]n-C(R₈)(R₉)(R₁₀)

式1中，R₁，R₂，R₃和R₄可以各自独立地为F、Cl、Br、I或H，

其中选自R₁、R₂、R₃和R₄的至少一个为F，

重组微生物可以进一步包括编码未连接的脱卤素酶的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述重组微生物含有第一脱卤素酶，所述第一脱卤素酶是如本文所述的变体HAD蛋白，其与锚定基序连接(或含有编码其的多核苷酸)，并且含有第二脱卤素酶或编码其的多核苷酸，其不与锚定连接。基序(或编码其的多核苷酸)，其可以与第一脱卤素酶相同或不同。或者，反之亦然。作为变体HAD蛋白的第一脱卤素酶可以不含锚定部分，第二脱卤素酶可以包括锚定基序。因此，脱卤素酶可以在细胞表面和细胞内同时表达。第二脱卤素酶(或编码其的多核苷酸)可以是内源的或外源的，重组微生物可以允许脱卤素酶在细胞内本质上或通过重组表达。

重组微生物可具有降低样品中“含氟化合物”浓度的活性。含氟化合物可以是CH3F，CH2F2，CHF3，CF4，CH2FCOOH或其混合物。

含氟化合物的去除可包括样品中含氟化合物浓度的任何降低，例如含氟化合物的CF键的裂解，含氟化合物转化为不同的材料，或细胞中含氟化合物的积累。

样品可以是液体样品或气体样品，或两者的组合。例如，样品可以是工业污水或废气。例如，样品可以是污泥。如本文所用的术语“污泥”是指半固体浆料，并且可以作为来自废水处理过程的污水污泥或作为从常规饮用水处理或许多其他工业过程获得的沉降悬浮液来获得。

重组微生物与样品的接触可以以适当的方式进行进行，例如在液相或气相中。接触可包括在含氟化合物存在下培养重组微生物。接触可以在密闭容器中进行，例如，气密容器。当重组微生物的生长状态处于指数期或静止期时，可以进行接触。培养可以在需氧或厌氧条件下进行。接触可以在重组微生物可在密闭容器(例如，气密容器)中存活的条件下进行。这种重组微生物存活的条件可包括重组微生物可以增殖或可以允许处于静止状态的条件。

接触可包括被动接触和主动接触。术语“被动接触”是指没有外部驱动力下的接触，术语“主动接触”是指在外部驱动力下的接触。可以以将含氟化合物以气泡形式注入含有重组微生物的溶液和/或喷洒重组微生物的方式实现活性接触。例如，可以通过将样品吹入培养基或培养液中来实现接触。为了注射样品，可以将样品从培养基或培养液底部吹至其顶部。可以通过制备样品的液滴来实现样品的注射。接触可以分批或以连续的方式进行。接触可以重复进行，例如两次或更多次，例如，三次、五次或十次或更多次。可以继续或重复接触，直到含氟化合物降低至所需浓度。

重组微生物可以是薄膜层的形式。这种重组微生物的薄膜层可以是液体薄膜层。含氟化合物可以是气态薄膜层的形式。重组微生物的液体薄膜层和含氟化合物的气态薄膜层可以彼此接触。

对重组微生物进行循环过程，就此而言，重组微生物与含氟化合物的接触面积或接触时间可以增加。这种循环过程可以增加传质系数(KLa)值，以及含氟化合物分解的量(或速率)。

关于该方法，所述接触可以进一步包括：在废气分解装置中，所述废气分解装置包括一个或多个反应器，每个反应器包括一个或多个第一入口和一个或多个第一出口，其中将样品注入这种废气分解装置中，和

其中将重组微生物通过一个或多个第一入口注入排气分解装置中，使得重组微生物可以接触样品，并且所得混合物可以通过一个或多个出口排出。

在这方面，排气分解装置可包括第二入口和第二出口，并且样品可通过第二入口注入并通过第二出口排出。在这样的配置中，重组微生物可以在与样品移动的方向相反的方向上移动。包含重组微生物的流体薄膜可以形成在一个或多个反应器的内壁上。

关于该方法，废气分解装置还可包括第一循环管线，用于将至少一部分流体再供应到一个或多个第一入口，其中流体含有重组微生物。包含含氟化合物的样品可以保留在一个或多个反应器内。此外，废气分解装置还可包括第二入口和第二出口，其中样品可通过第二入口供应到一个或多个反应器中，通过第二出口排放到一个或多个反应器的外部。并在一个或多个反应器内沿第二方向移动。第二方向可以与例如重组微生物的流体移动的方向不同。另外，在一个或多个反应器的内底部的流体收集区和废气分解装置的一个或多个反应器的内顶部的流体反应区中的至少一个中，包括重组微生物的流体包含含氟化合物的样品可以相互接触，从而分解含氟化合物。在废气分解装置中，包含含有重组微生物的流体的流体薄膜可以接触包括所述样品的流体。

关于该方法，废气分解装置可以进一步包括一个或多个反应器内部的结构，其中该结构可以配置为增加包括重组微生物的流体与包含含氟的样品之间的接触面积。例如，该结构可以包括选自包装材料和回流管中的至少一种，但是本公开内容的实施方案不限于此。可以包括设置成增加包含重组微生物的流体和包含含氟化合物的样品之间的接触面积的任何结构。“包装材料”可以是惰性固体材料。包装材料可具有各种形状。包装材料可以是用于填充床塔的包装中的相同的材料。包装材料可以由塑料、磁性材料、钢或铝制成。包装材料可具有非常薄的厚度。包装材料可以具有环形形状，例如皮疹环，鲍尔环和berl鞍，鞍型和突出型。填充材料可以不规则地填充在填充床反应器中。包装材料可以有效地增加含氟化合物与液体中存在的微生物之间的接触。通过在填充材料的表面上以及在反应器的内表面上形成微生物薄膜，可以使含氟化合物与微生物之间接触的时间或机会最大化。另外，一个或多个第一入口可以连接到废气分解装置中的一个或多个反应器的内部顶部处的流体反应区，从而通过一个或多个第一入口供应包含重组微生物的流体。

关于该方法，可以将包含重组微生物的流体收集在废气分解装置中的一个或多个反应器的内底部的流体收集区中。通过第二入口供给到一个或多个反应器中的包括含氟化合物的样品可以以气泡的形式通过包括重组微生物的收集的流体，然后转移到一个或多个反应器的内部顶部的流体反应区，然后，可以将其通过第二出口排出到一个或多个反应器的外部。

关于该方法，废气分解装置中的一个或多个反应器的高度H与直径D的纵横比(H/D)可以是2或更大、5或更大、10或更大、15或更大、20或更大，或50或更大。

关于该方法，废气分解装置可以以这样的方式布置，使得一个或多个反应器的侧壁或其一些其他的内表面可以以小于90°或大于90°的角度倾斜或倾斜。例如，其侧壁或其它内表面可以在相对于地球表面约30°至约150° (例如，约30°至小于90°或大于90°至约150°)，约70°至约110°(例如，约70°至小于90°或大于90°至约110°)，约80°至约100°(例如，约80°至小于90°或大于90°至约100°)，或约50°至约90°(例如，约 50°至小于90°)的范围内倾斜。

关于该方法，废气分解装置中的一个或多个反应器可以旋转。包含重组微生物的流体可以是液体，包含含氟化合物的样品可以是气体。

根据任何上述实施方案的变体和编码变体的多核苷酸可用于去除样品中的含氟化合物或产生变体。

根据任何上述实施方案的重组微生物可用于去除样品中的含氟化合物。

包含根据任何上述实施方案的HAD超家族蛋白的组合物可用于去除样品中的含氟化合物。

根据任何上述实施方案的样品中的含氟化合物浓度的方法可以有效地从样品中去除含氟化合物。

实施例1：包括SF0757基因的重组微生物的制备

基因SF0757(SEQ ID NO:1)，其编码脱卤酶，从黑胸败血芽孢杆菌SF3 中扩增，所述菌株于2017年2月24日保藏于韩国典型培养物培养中心 (KCTC)，其是根据布达佩斯条约的国际保藏单位。

主要地，黑胸败血芽孢杆菌SF3在LB培养基中培养过夜，同时在30 ℃的温度和230rpm的速度下搅拌，并使用总DNA提取试剂盒(Invitrogen Biotechnology)分离其基因组DNA。使用基因组DNA作为模板和具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的核苷酸序列的一组引物进行PCR，以扩增和获得 SF0757基因。如此扩增的基因各自独立地与pET28a载体(Novagen，目录号 69864-3)连接，该载体通过使用InFusion Cloning Kit(ClontechLaboratories， Inc.)的限制酶如NcoI和XhoI切割，以便制备pET-SF0757载体。附图1是pET-SF0757载体的载体图谱。这里，SF0757蛋白质具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

然后，通过热激法将制备的pET-SF0757载体导入大肠杆菌BL21，然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板琼脂中培养。从平板中选择显示卡那霉素抗性的菌株，并将最终从其中选择的菌株命名为重组大肠杆菌 BL21/pET-SF0757。

实施例2：表达SF0757的变体基因的重组大肠杆菌的制备

制备变体以改善SF0757蛋白对去除样品中的含氟化合物的活性。SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第184位(下文称作“S184”)的丝氨酸被其他19种天然氨基酸中的一种置换。这里，每个置换用“S184X”表示(其中X表示除丝氨酸之外的19中天然氨基酸之一)。通过引入编码每种制备的多核苷酸来制备重组大肠杆菌。然后证实了这些重组大肠杆菌对样品中CF4的去除的影响。

选择S184H变体(本文称为“SM”变体)用于进一步的实验。使用SEQ ID NO：5和6的引物组产生SM变体以将S184H引入SF0757蛋白中。SM 变体具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，以及NO：8的核苷酸序列。

具有S184H和N206M置换的变体(下文称作“DM”)通过将N206M置换引入到SM变体。还在位置208和21处产生了具有取代的其他变体。特别地，具有S184H、N206M和T208Q置换的变体通过将S208Q置换引入具有 S184H和N206M的变体而制备，以及具有S184H、N206M和V210D置换的变体(下文中称作“TM2”)通过将V210D置换引入具有S184H和N206M的变体中而制备。

在变体DM、TM1和TM2的制备中，用于引入N206M、T208Q和V210D 置换的引物组如下：SEQ ID NO:17和18的引物组用于引入具有N206M置换的变体；SEQ ID NO:17和18的引物组用于引入具有N208Q置换的变体；和 SEQ ID NO:19和20的引物组用于引入具有N210D置换的变体。在本文中，变体DM的氨基酸序列和编码变体DM的核苷酸序列分别是SEQ ID NO:9和 10，变体TM1的氨基酸序列和编码变体TM1的核苷酸序列是SEQ ID NO:分别是SEQ IDNO:11和12，和变体TM2的氨基酸序列和编码变体TM2的核苷酸序列分别是SEQ ID NO:13和14。为便于参考，变体的总结如下：

在以下段落中提供了变体多肽和表达其的大肠杆菌菌株的制备的更详细描述。

(1)诱导突变

通过使用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(AgilentTechnology，USA)实现SEQ ID NO:2的S184X变体的制备。定点诱变利用试剂盒来进行，通过使用PfuUlta高保真(HF)DNA聚合酶以最高保真度对两个质粒链进行诱变引物指导的复制。基本方法利用了具有所关注的***物的超螺旋双链DNA(dsDNA)载体和两个均含有所需突变的合成的寡核苷酸引物。每个与载体的相反链互补的寡核苷酸引物在温度循环期间通过PfuUltra HF DNA聚合酶延伸，而没有引物替换。寡核苷酸引物的延伸产生含有交错切口的突变质粒。温度循环后，用DpnI处理产物。DpnI内切核酸酶(靶序列：5’-Gm6ATC-3’)对甲基化和半甲基化的DNA具有特异性，并用于消化亲本DNA模板以选择含有突变的合成的DNA。然后，将掺入所需突变的带切口的载体DNA转化到XL1-Blue超级感受态细胞中。

(2)导入SF0757变体的基因的重组大肠杆菌BL21/pET-SF0757mt

通过使用章节(1)的pET-SF0757载体作为模板，选自章节(1)的每个变体的引物组和PfuUlta HF DNA聚合酶的引物进行PCR，以获得含交错的缺口的变体载体。用DpnI处理这些载体产物以选择包括变体的合成的DNA (称为SF0757mt，其中“mt”指“突变体”)。然后，将掺入所需变体的带缺口的载体DNA转化到XL1-Blue超级感受态细胞中，从而克隆期望的pET-SF0757mt载体。

最后，以与章节(1)中相同的方式将克隆的pET-SF0757mt载体导入到大肠杆菌BL21菌株，将选自其的菌株命名为表达由SF0757mt核酸编码的特定变体蛋白的重组大肠杆菌BL21/pET-SF0757mt菌株(即，SM，DM，TM1 或TM2变体)。

(3)导入SF0757变体的基因的重组大肠杆菌 W3110/pTrc-BANF-SF0757mt

制备了在细胞表面上表达融合蛋白的重组大肠杆菌，该融合蛋白包括W3100SF0757变体的N末端和与其连接的具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的BANF。在下文中，将所得菌株称作W3110/pTrc-BANF-SF0757mt。术语“BANF”是指炭疽芽孢杆菌来源的外孢子蛋白(BclA)的N-末端结构域，例如包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的结构域。编码BANF的合成多核苷酸(由Cosmogenetech Inc.，Korea合成)具有SEQ ID NO:22的核苷酸序列。

在编码BANF多肽的合成的多核苷酸的存在下，使用具有SEQ ID NO： 23和24的寡核苷酸序列的一组引物进行PCR。因此，通过扩增获得BANF 相应的DNA片段。然后，通过使用黑胸败血芽孢杆菌SF3的基因组DNA作为模板和具有SEQ ID NO:25和26的寡核苷酸序列的一组引物进行PCR，以通过扩增获得SF0757对应的DNA片段。通过使用每个扩增的BANF和SF0757DNA片段作为模板和一组具有SEQ ID NO:23和26的寡核苷酸序列的引物再次进行PCR，以获得BANF-SF0757融合基因。使用InFusion Cloning Kit(Clontech Laboratories，Inc.)，将BANF-SF0757融合多核苷酸连接到 pTrc99A载体(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)(4.17kb，bla，trc启动子)中，用限制酶消化，NcoI和XbaI，用于创建pTrc-BANF-SF0757载体。

图2是pTrc-BANF-SF0757载体的载体图谱。

接下来，通过使用制备的pTrc-BANF-SF0757载体作为模板，选自章节 (1)的每个变体的引物组和PfuUlta HF DNA聚合酶的引物进行PCR，以获得含交错的缺口的变体载体。用DpnI处理这些载体产物以选择包括变体的合成的DNA。随后，将掺入所需变体的带缺口的载体DNA转化到XL1-Blue超级感受态细胞中，从而克隆pTrc-BANF-SF0757mt载体。

最后，以与章节(1)相同的方式将克隆的pTrc-BANF-SF0757载体导入大肠杆菌W3110中，并将最后从中选择的菌株命名为重组大肠杆菌 W3110/pTrc-BANF-SF0757mt。同样，SF0757mt表示编码所需变体的核酸(即，上述SM，DM，TM1或TM2变体)。

实施例3.包括导入SF0757变体的重组大肠杆菌对样品中CF4去除的作用

在该部分中，证实了实施例2的大肠杆菌BL21/pET-SF0757mt菌株对样品中CF4的去除的影响。

(1)通过循环过程分解含氟的化合物

如图3所示，将50ml的LB培养基和200ppm的CF4气体加入到玻璃 Dimroth盘管回流冷凝器10(反应器长度350mm，外径35mm，内部容积： 200mL)中，然后进行灭菌并且垂直定向，然后，使LB培养基通过循环泵16进行循环。图3提供玻璃Dimroth回流冷凝器10的示意图。将LB培养基供给到冷凝器10的上部的入口12，流过冷凝器10的内壁，并被排放到冷凝器10的下部的出口14。排出的LB培养基沿循环管线18再次供给到入口12。为了保持温度，内部螺旋管将冷凝器10连接到30℃的恒温区。LB培养基的循环速率保持在4mL/min。72小时后，通过气相色谱质谱(GC-MS)确认冷凝器中CF4气体的量。然后，确认CF4气体的量没有变化。

随后，将实施例2的重组微生物DM和TM1和阴性对照组分别接种在 LB培养基上并在冷凝器10中循环。引入空载体的大肠杆菌用作阴性控制组。

LB培养基的循环速度为约4mL/min，冷凝器10内的温度保持在30℃。在菌株接种和经过72小时后，通过GC-MS确认冷凝器10中的CF4气体的量。然后，根据等式1计算CF4的分解率，结果如表3所示：

<式1>

CF4的分解速率＝[(CF4的初始量-反应之后CF4的量)/CF4的初始量] ×100

使用具有空载体的大肠杆菌对照菌株未观察到CF4水平的变化。使用测试菌株的结果如表3所示：

表3

菌株	CF4的分解速率(％)
		DM(S184H N206M)	10
TM1(S184H N206M T208Q)	13

如表3中所示，与阴性对照组(0％减少)相比，在与变体菌株接触72 小时后观察到CF4浓度的显著降低。

表4显示了根据上述相同的循环过程，实施例2的菌株SM和DM的48 小时培养和144小时培养的结果，不同之处在于CF4气体的起始浓度为 1,000ppm。再次，用空载体转化的大肠杆菌用作阴性对照，未观察到CF4 的分解。

表4

如表4所示，当使用微生物进行气相循环过程时，培养48小时和144小时后的变体显示与对照组(0％降低)相比CF4浓度显著降低。此外，DM 菌株在48小时培养和114小时培养时显示CF4的分解速率分别增加了1.25 倍和1.39倍的SM菌株的分解速率。

(2)通过微泡过程分解含氟化合物

测试的大肠杆菌BL21/pET-SF0757mt的SM，DM，TM2菌株以及对照菌株(用空载体转化的大肠杆菌)在LB培养基中培养，同时以速度搅拌在 30℃的温度下转速为230转/分钟。在OD600为约0.5时，向其中加入0.2mM IPTG，然后在20℃的温度下培养，同时以230rpm的速度搅拌过夜。

使用微泡工艺将菌株暴露于含CF4的样品。图4显示了微泡过程的图表。如图4所示，将200ml的LB培养基20和20ppm的CF4气体20注入500mL 基于pyrex圆形培养基储存瓶的微泡反应器10中，在高温下灭菌该反应器10。然后，将微孔分布器40设置在微泡反应器10的底部以面向底部。在本文中，微孔分布器40具有10μm的孔径。

将培养的重组大肠杆菌菌株接种在微泡反应器10中的LB培养基30上。基于OD₆₀₀的LB培养基30中的接种菌株的初始浓度为5.0。

通过连接到微泡反应器10底部的入口的微孔分布器40，在填充在微泡反应器10的下部的LB介质30中以气泡20的形式供应CF₄气体，然后将其排出到微泡反应器10的上部的出口处。通过气泵50将循环的CF₄气体沿循环管线60再次供应到入口，并通过FT-IR气体分析仪实时确认CF₄气体的量。这里，CF₄气体的循环速度为每分钟每体积10体积(vvm，每分钟通过LB培养基单元体积循环的CF₄的体积)。微泡反应器10内的温度保持在30℃，微泡反应器10内的压力为1个大气压。

利用以下的式1计算分解速率：

<式1>

CF₄分解速率＝[(CF₄的初始浓度-反应后CF₄的量)/CF₄的初始量]×100

与对照菌株相比，SM，DM和TM2菌株的CF4减少率的增加列于表5 中。

与野生型组相比，包括变体蛋白的SM，DM和TM2菌株各自显示样品中还原CF4的活性显著增加。

表5

本文引用的所有参考文献，包括出版物，专利申请和专利均通过引用结合到本文中，其程度如同每个参考文献被单独且具体地指示通过引用并入并且在本文中完整地阐述。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个”和“一个”和“该”和“至少一个”以及类似的指示物将被解释为除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则涵盖单数和复数。使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”) 应被解释为表示从列出的项目中选择的一个项目(A或B))或所列项目(A 和B)中的两个或更多个的任何组合，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”，“具有”，“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员来说可以变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元件的所有可能变型的任何组合。

本发明中所涉及的微生物保藏信息内容如下：

黑胸败血芽孢杆菌SF3，分类命名为B.bombysepticus SF3，保藏编号为 KCTC13220BP，所述菌株于2017年2月24日保藏于韩国典型培养物培养中心(KCTC)，保藏地址为韩国全罗北道56212，井邑市，新井洞181。

<110> 三星电子株式会社

<120> 卤酸脱卤酶超家族蛋白的变体及使用其降低样品中含氟化合物浓度的方法

<130> PX056140OV

<160> 29

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 711

<212> DNA

<213> 黑胸败血芽孢杆菌 (Bacillus bombysepticus) SF3

<400> 1

atgaaataca aatttatatt attcgacgta gacgatacat tattagattt ccctgaaacg 60

gaaagacacg cattacataa tgcgtttgta cagttcggga tgcctacagg gtataatgat 120

tatcttgcaa gttataaaga gattagtaat ggattatgga gagatttaga aaataaaatg 180

attacgctaa gtgaattagc ggtagatcga tttagacaat tatttgccct tcataatata 240

aaagtagatg cgcagcaatt tagcgatgta tatcttgaaa acttagggaa agaagtacat 300

cttatagaag gtgcagtgca attatgtgag gatctacaag attgcaagtt aggtattatt 360

acgaatggat atacgaaggt gcaacaatcg agaattggaa attcgcctgt atgtaatttc 420

tttgatcata ttattatttc agaagaggtt ggtcatcaaa aaccagcacg tgagattttt 480

gattatgcgt ttgaaaagtt tgggattaca gataaatcaa gtgtattaat ggttggagat 540

tcgctttctt ctgatatgag aggcggagaa gattacggca ttgatacgtg ttggtataat 600

ccgagtttga aagaaaatag gacagatgtt aagccgtctt atgaagtgga gagtctgcta 660

caaattttag aaattgtaga agtgactaaa gaaaaagtag cttcatttta a 711

<210> 2

<211> 236

<212> PRT

<213> 黑胸败血芽孢杆菌 SF3

<400> 2

Met Lys Tyr Lys Phe Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp

1 5 10 15

Phe Pro Glu Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe

20 25 30

Gly Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile

35 40 45

Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser

50 55 60

Glu Leu Ala Val Asp Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile

65 70 75 80

Lys Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly

85 90 95

Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asp Leu

100 105 110

Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln

115 120 125

Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Val Cys Asn Phe Phe Asp His Ile

130 135 140

Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe

145 150 155 160

Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu

165 170 175

Met Val Gly Asp Ser Leu Ser Ser Asp Met Arg Gly Gly Glu Asp Tyr

180 185 190

Gly Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Arg Thr

195 200 205

Asp Val Lys Pro Ser Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu

210 215 220

Ile Val Glu Val Thr Lys Glu Lys Val Ala Ser Phe

225 230 235

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF0757 基因扩增引物

<400> 3

aagaaggaga tataccatga aatacaaatt tatatta 37

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF0757基因扩增引物

<400> 4

ggtggtggtg gtgctcgatt aaaatgaagc tactttttc 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gttggagatt cgctttctca tgatatgaga ggcggagaa 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ttctccgcct ctcatatcat gagaaagcga atctccaac 39

<210> 7

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SF0757 S184H 变体蛋白

<400> 7

Met Lys Tyr Lys Phe Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp

1 5 10 15

Phe Pro Glu Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe

20 25 30

Gly Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile

35 40 45

Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser

50 55 60

Glu Leu Ala Val Asp Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile

65 70 75 80

Lys Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly

85 90 95

Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asp Leu

100 105 110

Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln

115 120 125

Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Val Cys Asn Phe Phe Asp His Ile

130 135 140

Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe

145 150 155 160

Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu

165 170 175

Met Val Gly Asp Ser Leu Ser His Asp Met Arg Gly Gly Glu Asp Tyr

180 185 190

Gly Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Arg Thr

195 200 205

Asp Val Lys Pro Ser Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu

210 215 220

Ile Val Glu Val Thr Lys Glu Lys Val Ala Ser Phe

225 230 235

<210> 8

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF0757 S184H 变体基因

<400> 8