一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用

文档序号：1704179 发布日期：2019-12-13 浏览：33次 >En<

阅读说明：本技术 一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用 (Fluoroacetic acid dehalogenase mutant and application thereof ) 是由瞿旭东程占冰丁少南徐艳冰黄瑶于 2018-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氟乙酸脱卤酶突变体,所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W进行突变后的序列；所述氟乙酸脱卤酶突变体具有催化溴化底物、尤其是2-溴丁酸底物的活性。本发明还提供了一种所述氟乙酸脱卤酶突变体在制备(R)-2-溴丁酸和/或(R)-2-羟基丁酸中的应用。利用本发明的氟乙酸脱卤酶突变体制备(R)-2-溴丁酸时,生产成本低,立体选择性高,利于工业化生产。(The invention discloses a mutant of a fluoroacetate dehalogenase, wherein the sequence of the mutant of the fluoroacetate dehalogenase comprises a sequence obtained by mutating 155 th amino acid residue H and/or 156 th amino acid residue W shown in SEQ ID NO. 1; the mutant fluoroacetate dehalogenase has activity in catalyzing a brominated substrate, particularly a 2-bromobutyric acid substrate. The invention also provides application of the mutant of the fluoroacetate dehalogenase in preparation of (R) -2-bromobutyric acid and/or (R) -2-hydroxybutyric acid. When the (R) -2-bromobutyric acid is prepared by using the mutant of the fluoroacetate dehalogenase, the production cost is low, the stereoselectivity is high, and the industrial production is facilitated.)

一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用。

背景技术

2-氧代-1-吡咯烷衍生物如左乙拉西坦、布瓦西坦、seletracetam，是比利时UCB公司开发的一种新型抗癫痫药。EP1806339公开了其一种制备方法，其采用(R)-2-溴丁酸与相应的2-氧代-1-吡咯烷化合物进行取代反应，再与三乙胺作用得到相应的产物。其中(R)-2-溴丁酸是其重要原料，对抗癫痫药2-氧代-1-吡咯烷衍生物的生产起着决定作用，因此寻找成本低，光学纯度高的(R)-2-溴丁酸的制备方法非常重要。

目前(R)-2-溴丁酸的制备方法有对消旋的2-溴丁酸进行拆分的方法，如Journalof Biological Chemistry,1927(75),337-365，采用番木鳖碱作为手性拆分剂，这种方法需要多步重结晶步骤，且需要昂贵的手性拆分剂，不利于工业化大生产。或是使用手性辅基拆分消旋的2-溴丁酸，如Tetrhedron Asymmetry,16(2005),3739-3745中采用(S)-N-苯基泛内酯作为手性辅基，(S)-N-苯基泛内脂先与2-溴丁酸酯化生成酯化合物，接着再水解为(R)-2-溴丁酸。此方法中酯化产率只有67％，且ee值也不是很理想，并且采用硅胶柱色谱法分离，还不能进行工业化生产。

另外还有化学合成的方法，如CN101048402采用(R)-2-氨基丁酸为原料，与亚硝酸，溴化钾反应制得(R)-2-溴丁酸。但是此方法产率很低，且原料为光学纯原料，成本较高。

脱卤酶是一种具有催化活性的水解酶，能够催化有机卤素化合物中碳-卤键裂解，使卤素原子从化合物中释放出来。已有相关报道将脱卤酶用于卤代化合物的拆分，如J.Am.Chem.Soc.,2017,Shuguang Yuan和Manfred T.Reetz报道了氟乙酸脱卤酶(FAcD)RPA1163可以通过将消旋底物2-氟-2-苯基乙酸或2-氟-3-苯基丙酸中的S型脱氟得到(R)-2-羟基-2-苯基乙酸或(R)-2-羟基-3-苯基丙酸，而保留未反应的(R)-2-氟-2-苯基乙酸或(R)-2-氟-3-苯基丙酸，从而实现动力学拆分。虽然该酶为脱卤酶，但目前相关报道只证明该酶作用于氟化底物，并未见氟乙酸脱卤酶可以用于催化氯化、溴化等其他卤代底物的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的野生型氟乙酸脱卤酶无法用于催化溴化底物，尤其是2-溴丁酸底物的缺陷，因此本发明提供一种氟乙酸脱卤酶突变体以及其在制备(R)-2-溴丁酸中的应用。利用本发明的氟乙酸脱卤酶突变体制备(R)-2-溴丁酸时，生产成本低，立体选择性高，利于工业化生产。

本发明所用的野生型氟乙酸脱卤酶来源是Rhodopseudomonas palustris，具体序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。该野生型氟乙酸脱卤酶由304个氨基酸残基组成，申请人经实验发现，该野生型氟乙酸脱卤酶无法用于催化2-溴丁酸。本发明人针对该底物对上述野生型酶的不同氨基酸位点进行了饱和突变的大量筛选，发现H155、W156、Y219位点的部分突变体可以用于催化底物2-溴丁酸。进而对这些位点进行组合突变并构建突变体文库，从中筛选出本发明所述的野生型氟乙酸脱卤酶。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种氟乙酸脱卤酶突变体，其中所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W进行突变后的序列；所述氟乙酸脱卤酶突变体具有催化溴化底物、尤其是2-溴丁酸底物的活性。

较佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W突变为天然氨基酸残基后的序列。

更佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列还包括将SEQ ID NO.1所示的第219位氨基酸残基Y突变为天然氨基酸残基后的序列。

进一步更佳地，所述第155位氨基酸残基H突变为A、C、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W，优选突变为I、N、V、F、L、Q、A、C、M、P、T或W，更优选突变为I、N或V；和/或，第156位氨基酸残基W突变为A、C、D、F、G、I、L、M、P、R、S、T、V或Y，优选突变为A、C、D、F、G、I、L、M、R、S、T或Y，更优选突变为F、M、R、S或T；和/或，第219位氨基酸残基Y突变为疏水性氨基酸残基，优选突变为F、L或M。

较佳地，所述第155位氨基酸残基H突变为V，或第156位氨基酸残基W突变为M、T、C、F、S、V、A或L。

上述大写英文单字母代表如本领域技术人员熟知的氨基酸，根据本发明，在此代表的是相应的氨基酸残基。

较佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ IDNO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ IDNO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ IDNO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127、SEQ ID NO.129所示；更佳地，编码所述氟乙酸脱卤酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ IDNO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ IDNO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128、SEQ ID NO.130所示。

本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种分离的核酸，其中所述核酸编码上述氟乙酸脱卤酶突变体；较佳地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ IDNO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ IDNO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128、SEQ ID NO.130所示。

本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种包含上述核酸或上述重组表达载体的转化体。

本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种上述氟乙酸脱卤酶突变体在制备(R)-2-溴丁酸和/或(R)-2-羟基丁酸中的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案之六是：一种(R)-2-溴丁酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在反应溶剂和上述氟乙酸脱卤酶突变体的存在下，将2-溴丁酸进行催化反应，即得(R)-2-溴丁酸。

其中，所述2-溴丁酸为2-溴丁酸消旋体、R型富集的2-溴丁酸和S型富集的2-溴丁酸中的一种或多种，所述R型富集是指R型与S型共存并且R型与S型的摩尔比例大于1:1，所述S型富集是指R型与S型共存并且S型与R型的摩尔比例大于1:1。

较佳地，所述的氟乙酸脱卤酶突变体的浓度为2-20U/ml，优选10U/ml；

和/或，所述的2-溴丁酸的浓度为0.02g/ml～0.2g/ml，优选0.1g/ml；

和/或，所述反应溶剂为水；

和/或，所述的催化反应的反应体系的pH值为6-8，优选7，pH过高时，原料会自发分解，影响收率；

和/或，所述的催化反应的反应体系的温度为20-30℃，优选30℃，温度过高时，原料会自发分解，影响收率；

和/或，所述的催化反应的反应时间为5-10小时，优选8小时；

本发明解决上述技术问题的技术方案之七是：一种(R)-2-羟基丁酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在反应溶剂和上述氟乙酸脱卤酶突变体的存在下，将2-溴丁酸进行脱卤反应，即得(R)-2-羟基丁酸。

在该脱卤反应中，脱卤酶对2-溴丁酸中的(S)-2-溴丁酸选择性高(即，优先与(S)-2-溴丁酸反应，待其全部反应后，(R)-2-溴丁酸才参与反应，生成(R)-2-羟基丁酸)，使之发生脱卤反应并发生构型翻转，得到(R)-2-羟基丁酸，而2-溴丁酸中的未反应或未反应完的(R)-2-溴丁酸即得到保留。产物中的(R)-2-溴丁酸和(R)-2-羟基丁酸理化性质相差较大，因此两者易于分离。

较佳地，所述的氟乙酸脱卤酶突变体的浓度为2～20U/ml，优选10U/ml；

和/或，所述的(S)-2-溴丁酸的浓度为0.02g/ml～0.2g/ml，优选0.1g/ml；

和/或，所述反应溶剂为水；

和/或，所述的脱卤反应的反应体系的pH值为6-8，优选7，pH过高时，原料会自发分解，影响收率；

和/或，所述的脱卤反应的反应体系的温度为20-30℃，优选30℃，温度过高时，原料会自发分解，影响收率；

和/或，所述的脱卤反应的反应时间为5-10小时，优选8小时；

以上化合物所述浓度若无特殊说明，均为反应前所述化合物占整个反应体系的浓度。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的氟乙酸脱卤酶突变体可以用于催化溴化底物，尤其是2-溴丁酸。在本发明的某一较佳实施例中，氟乙酸脱卤酶突变体所能催化的底物浓度能够达到0.1g/ml。利用本发明的氟乙酸脱卤酶突变体制备(R)-2-溴丁酸时，生产成本低，立体选择性高，利于工业化生产。

附图说明

图1为实施例3中反应原料2-溴丁酸的手性HPLC分析结果。

图2为实施例3中利用氟乙酸脱氢酶突变体3参与反应时，反应后(R)-2-溴丁酸的手性HPLC分析结果。

图3为(R)-2-溴丁酸标准品的手性HPLC分析结果。

图4为实施例3中反应原料2-溴丁酸的HPLC分析图谱。

图5为消旋体2-羟基丁酸标准品的HPLC分析图谱。

图6为实施例3中利用氟乙酸脱氢酶突变体3参与反应时，反应后反应液的HPLC分析图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明中的2-溴丁酸如无特别说明，均可以为2-溴丁酸消旋体、R型富集的2-溴丁酸和S型富集的2-溴丁酸中的一种或多种，所述R型富集是指R型与S型共存并且R型与S型的摩尔比例大于1:1，所述S型富集是指R型与S型共存并且S型与R型的摩尔比例大于1:1。

本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。

表1

氨基酸名称	三字母符号	单字母符号	氨基酸名称	三字母符号	单字母符号
						丙氨酸(alanine)	Ala	A	亮氨酸(leucine)	Leu	L
精氨酸(arginine)	Arg	R	赖氨酸(lysine)	Lys	K
						天冬酰胺(asparagine)	Asn	N	甲硫氨酸(methionine)	Met	M
天冬氨酸(aspartic acid)	Asp	D	笨丙氨酸(phenylalanine)	Phe	F
						半胱氨酸(cysteine)	Cys	C	脯氨酸(proline)	Pro	P
谷氨酰胺(glutanine)	Gln	Q	丝胺酸(serine)	Ser	S
						谷氨酸(glutamic acid)	Glu	E	苏氨酸(threonine)	Thr	T
甘氨酸(Glicine)	Gly	G	色氨酸(tryptophan)	Trp	W
						组氨酸(histidine)	His	H	酪氨酸(tyrosine)	Tyr	Y
异亮氨酸(isoleucine)	Ile	I	颉氨酸(valine)	Val	V

所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。

表2

pET28a和bugbuster protein extraction reagent购买自Novagen公司；DpnI酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；2-溴丁酸购买自盐城胜达化工有限公司。

底物2-溴丁酸与产物2-溴丁酸的手性HPLC(High Performance LiquidChromatography，高效液相色谱)分析方法如下：

色谱条件：Daicel Chiralpak IG，4.6mm*250mm，5μm；流动相：正己烷/异丙醇/TFA＝99:1:0.1；检测波长：230nm；流速：0.7ml/min；柱温：25℃。

底物2-溴丁酸与产物的HPLC分析方法为：

色谱条件：Inertsil ODS-3，4.6mm*150mm，5μm；流动相A：10mmol磷酸二氢钠水溶液(pH＝3.0)，流动相B：乙腈；梯度洗脱；检测波长：205nm；流速：0.7ml/min；柱温：35℃。

转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％(反应物：2-溴丁酸)。

实施例1氟乙酸脱卤酶突变体文库的构建

针对氟乙酸脱卤酶FAcD-RPA1163(来源为Rhodopseudomonas palustris)序列(即序列表中SEQ ID NO.1)的第155、156、219位点进行突变的突变体文库构建所设计的引物序列如表3所示：

表3

其中，N代表A、G、C、T中任何一种核苷酸，M代表A或C，K代表G或T；其根据所述位点需突变成的氨基酸的编码核苷酸来选择，如A166-正向引物中的NNK可以代表AAG(赖氨酸)、AAT(天冬氨酸)、AGG(精氨酸)或AGT(丝氨酸)等，具体氨基酸所对应的核苷酸可参见表2。

根据文献J.Am.Chem.Soc.,2017,139(32),11241-11247中公开的方法构建了质粒模板pET28a-FAcD-RPA1163，以pET28a-FAcD-RPA1163为模板，PCR扩增目的条带，扩增反应体系为：

50μL PCR扩增体系：

试剂	用量(μL)
		2XPCR buffer(含高保真酶)	25
引物F	1
		引物R	1
模板	1
		去离子水	22

扩增程序如下：

对PCR产物进行DpnI消化，37℃，2hr。反应完成转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜，得到包含突变体文库的转化子。

实施例2高通量筛选突变体文库

按照如下实验步骤进行筛选：

将实施例1得到的转化子接种96孔板培养，加IPTG 30℃过夜诱导。之后收菌，加bugbuster protein extraction reagent裂解，离心得总酶液。

称取250mg消旋的2-溴丁酸底物，溶于45mL 1mM Tris溶液中，置于冰上用稀NaOH调节pH在8.0～8.5之间，定容到50ml，配成2-溴丁酸底物的浓度为30mM的底物溶液。每个反应加入100μl底物溶液(终浓度为25mM)和20μL上述总酶液，反应一段时间溶液后，取20μl的反应液至96孔酶标板中，依次加入30μl的饱和Hg(SCN)₂乙醇溶液和150μL 60g/L FeNH₄(SO₄)₂·12H₂O(含1％的硝酸，w/v)水溶液，室温下放置10min后，在酶标仪500nm波长处检测吸光度。

以野生型为参照系(野生型酶活未检出，可见野生型氟乙酸脱卤酶FAcD-RPA1163对2-溴丁酸没有催化效果)，选择阳性克隆子，测序并检测其酶活。阳性克隆子的序列通过测序确定，测序公司为生工生物工程(上海)股份有限公司，上海市松江区香闵路698号。

选阳性克隆子，进行培养，方法如下：

将10％的上述阳性克隆子接种于150mL TB培养基，37℃生长至OD₆₀₀值达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，降温至30℃过夜诱导。培养结束后，将培养液4000rpm离心30min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。

将培养结束后收集到的菌体，用20mM pH 8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组脱卤酶的突变体粗酶液。

以下实施例中脱卤酶突变体粗酶液的制备方法均采用以上方法。

酶活检测方法：2.5g菌体用40mL pH为8.0的20mM磷酸盐缓冲液重悬，低温高压均质破碎，离心弃沉淀，留上清，得粗酶液。30℃，加底物溶液(30mM)900μL，加待测粗酶液100μL，得1mL的反应液。取反应液100μL，依次加入150μL的饱和Hg(SCN)₂乙醇溶液和750μL 60g/L的FeNH₄(SO4)₂·12H₂O(含1％的硝酸，w/v)水溶液，室温下放置10min，紫外分光光度计中检测500nm处的吸收值。根据溴离子的生产速率计算出酶活。结果如表4所示。

单位酶活的定义：在特定反应条件下(30℃)，每分钟生成1μmol溴离子所需要的酶量。

表4

其中，野生型WT未检出酶活，*代表酶活在0.1U/ml以下；**代表酶活在0.1-1U/ml之间；***代表酶活在1-5U/ml之间；****代表酶活在5-10U/ml之间；*****代表酶活在10U/mL-20U/mL之间。

实施例3氟乙酸脱卤酶突变体催化制备(R)-2-溴丁酸

反应瓶中加入50mL自来水，加入10g 2-溴丁酸底物，搅拌溶解，用30％NaOH溶液调节pH至7.0，加入20mL根据实施例2方法制得的突变体粗酶液(即称取4g实施例2中所述菌体，加入20mL的100mM pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌均匀，高压均质破碎得突变体粗酶液。以氟乙酸脱卤酶突变体3为例，其浓度为10U/ml)，自来水定容反应体系至100mL。反应过程中用2mol/L碳酸钠溶液控制pH在7.0左右，30℃水浴反应8小时后，取样检测2-溴丁酸底物的转化率。反应液用40％的硫酸水溶液调节pH至1-2之间，硅藻土过滤，滤液用等体积的甲苯萃取3次，合并甲苯，50℃浓缩得(R)-2-溴丁酸。HPLC检测(R)-2-溴丁酸的ee值。转化率和ee值结果如表5所示。水相用40％的硫酸水溶液调pH至0-1之间，用等体积的甲基叔丁基醚萃取3次，合并甲基叔丁基醚，50□浓缩得2-羟基丁酸。测定2-羟基丁酸的旋光值为[a]25D＝+4.2°(C＝3.0，H₂O)。参考文献Advanced Synthesis and Catalysis,2016,vol.358,#18,p.2923–2928中的内容可知产物为(R)-2-羟基丁酸。

反应原料中使用的2-溴丁酸的手性HPLC分析结果见图1，其中保留时间为17.272min的为(R)-2-溴丁酸，保留时间为15.972min的为(S)-2-溴丁酸；反应后的产物中(R)-2-溴丁酸与(S)-2-溴丁酸的手性HPLC分析结果见图2(附图中均以氟乙酸脱卤酶突变体3为例进行说明)，其中保留时间为17.135min的为(R)-2-溴丁酸，(S)-2-溴丁酸几乎检测不到。图3为(R)-2-溴丁酸标准品的手性HPLC图谱，(R)-2-溴丁酸标准品为本实验室自制，制备方法参考文献CN101048402，其HNMR鉴定数据为：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.209-4.173(t，1H)，δ2.130-2.004(m，2H)，δ1,081-1.044(t，3H)。该实施例所制备得到的产物的成分与标准品中(R)-2-溴丁酸的出峰时间基本一致，说明该实施例中(S)-2-溴丁酸几乎全部反应完，即(S)-2-溴丁酸全部转化为(R)-2-羟基丁酸。

反应原料中使用的2-溴丁酸的HPLC色谱图分析结果见图4，其中，6.652min为2-溴丁酸的出峰位置。消旋体2-羟基丁酸标准品(购买自上海泰坦化学有限公司)的HPLC色谱图分析结果如图5所示，其中，2-羟基丁酸标准品的保留时间为1.930min。反应后反应液的HPLC色谱图分析结果如图6所示。可见，该反应后的产物中2-溴丁酸与(R)-2-羟基丁酸的出峰时间与各自标准品的出峰时间基本一致。

表5

SEQUENCE LISTING

<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司

<120> 一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用

<130> P180113439C

<150> 201810577561.6

<151> 2018-06-05

<160> 130

<170> PatentIn version 3.5

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<213> Rhodopseudomonas palustris

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Leu Pro Gly Tyr Gly Trp Ser Asp Met Pro Glu Ser Asp Glu Gln His

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Ala Arg Val Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Asp Ser Pro Gly Arg Leu Ser

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Met Asn Arg Ala Tyr Ala Leu Lys Ile Tyr Val Met Ser Phe Leu Ala

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Gln Pro Ala Pro Leu Pro Glu Asn Leu Leu Gly Gly Asp Pro Asp Phe

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Ala Ala Thr Pro Leu Asp Val Trp Arg Lys Trp Ala Ser Asp Val Gln

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Gly Ala Pro Ile Glu Ser Gly His Phe Leu Pro Glu Glu Ala Pro Asp

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<223> 氟乙酸脱卤酶突变体2(H155V，W156M，Y219L)

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ctggactctc cgggtcgtct gtctaaactg gctgttctgg acatcctgcc gacctacgaa 420

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<211> 304

<212> PRT

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<223> 氟乙酸脱卤酶突变体3(H155V，W156R，Y219M)

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Met Pro Asp Leu Ala Asp Leu Phe Pro Gly Phe Gly Ser Glu Trp Ile

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Leu Pro Gly Tyr Gly Trp Ser Asp Met Pro Glu Ser Asp Glu Gln His

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Glu Gln Leu Gly His Val His Phe Ala Leu Ala Gly His Asp Arg Gly

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Ala Arg Val Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Asp Ser Pro Gly Arg Leu Ser

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Gln Pro Ala Pro Leu Pro Glu Asn Leu Leu Gly Gly Asp Pro Asp Phe

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Tyr Val Lys Ala Lys Leu Ala Ser Trp Thr Arg Ala Gly Asp Leu Ser

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ggtcgtatct tcgctcgtgt tggtggtgac ggtccgccgc tgctgctgct gcacggtttc 120

ccgcagaccc acgttatgtg gcaccgtgtt gctccgaaac tggctgaacg tttcaaagtt 180

atcgttgctg acctgccggg ttacggttgg tctgacatgc cggaatctga cgaacagcac 240

accccgtaca ccaaacgtgc tatggctaaa cagctgatcg aagctatgga acagctgggt 300

cacgttcact tcgctctggc tggtcacgac cgtggtgctc gtgtttctta ccgtctggct 360

ctggactctc cgggtcgtct gtctaaactg gctgttctgg acatcctgcc gacctacgaa 420

tactggcagc gtatgaaccg tgcttacgct ctgaaaatct acgttcgttc tttcctggct 480

cagccggctc cgctgccgga aaacctgctg ggtggtgacc cggacttcta cgttaaagct 540

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cactaccgta tcgctttcgc tgacccgatg cgtcgtcacg ttatgtgcga agacatgcgt 660

gctggtgctt acgctgactt cgaacacgac aaaatcgacg ttgaagctgg taacaaaatc 720

ccggttccga tgctggctct gtggggtgct tctggtatcg ctcagtctgc tgctaccccg 780

ctggacgttt ggcgtaaatg ggcttctgac gttcagggtg ctccgatcga atctggtcac 840

ttcctgccgg aagaagctcc ggaccagacc gctgaagctc tggttcgttt cttctctgct 900

gctccgggtt ct 912

<210> 13

<211> 304

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 氟乙酸脱卤酶突变体4(H155I，W156S)

<400> 13

Met Pro Asp Leu Ala Asp Leu Phe Pro Gly Phe Gly Ser Glu Trp Ile

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Asn Thr Ser Ser Gly Arg Ile Phe Ala Arg Val Gly Gly Asp Gly Pro

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Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Phe Pro Gln Thr His Val Met Trp His

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Arg Val Ala Pro Lys Leu Ala Glu Arg Phe Lys Val Ile Val Ala Asp

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Leu Pro Gly Tyr Gly Trp Ser Asp Met Pro Glu Ser Asp Glu Gln His

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Glu Gln Leu Gly His Val His Phe Ala Leu Ala Gly His Asp Arg Gly

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Lys Leu Ala Val Leu Asp Ile Leu Pro Thr Tyr Glu Tyr Trp Gln Arg

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Gln Pro Ala Pro Leu Pro Glu Asn Leu Leu Gly Gly Asp Pro Asp Phe

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Pro Val Pro Met Leu Ala Leu Trp Gly Ala Ser Gly Ile Ala Gln Ser

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Ala Ala Thr Pro Leu Asp Val Trp Arg Lys Trp Ala Ser Asp Val Gln

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Gly Ala Pro Ile Glu Ser Gly His Phe Leu Pro Glu Glu Ala Pro Asp

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