具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例一

ZjAC2基因的扩增

提取冬枣果实RNA，后反转录为cDNA作PCR扩增模板，进行PCR扩增；其中，正向引物：5’-ATGGAGGTCGAAGTCAAGCT-3’，反向引物：5’-CTAAGGCAGCTTTCCGGATC-3’。

PCR扩增程序：94℃，4min；(94℃，40s；56℃，45s；72℃，50s)35个循环；72℃，10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，并对候选目的条带进行琼脂糖凝胶回收，回收产物连接入pMDTM19-T克隆载体进行测序，得到ZjAC2序列，作为候选枣腺苷酸环化酶基因，进行功能验证。

实施例二

大肠杆菌缺陷型互补试验

培养大肠杆菌cyaA缺陷型菌株SP850，SP850菌株缺少腺苷酸环化酶(AC)基因，将带有ZjAC2基因的pET-15b重组质粒分别热激转化入SP850后，涂布与氨苄和卡纳抗生素培养皿，挑单克隆培养至OD600为0.5，后诱导表达培养4h，于麦康凯培养基划线培养，观察。

结果发现，如图1，带有重组质粒的SP850缺陷型菌株和野生型大肠杆菌菌株的菌落颜色均为红色，而SP850缺陷型菌株在麦康凯培养基中显色为白色，说明ZjAC2基因弥补了SP850菌株中缺少的cyaA基因，发挥了腺苷酸环化酶基因的功能。

实施例三

蛋白质体外催化试验

将带有ZjAC2基因的pET-15b重组载体转入大肠杆菌BL21菌株，37℃，200rpm培养，IPTG诱导蛋白表达后，后进行蛋白提取纯化，所得蛋白用于酶催化活性检测，结果如图2-4。结果发现，Mn²⁺和Ca²⁺作为辅酶离子时，催化体系中产生了cAMP，说明ZjAC2蛋白能够催化ATP形成cAMP，发挥了AC的功能；此外，在Mg²⁺作辅酶离子时，反应产物中还存在大量Pi，而加入焦磷酸水解酶后，Pi含量没有增多，说明ZjAC2蛋白将ATP水解为ADP和PPi，而Mn²⁺和Ca²⁺作为辅酶离子时，反应产物中Pi含量较少，而在加入焦磷酸酶后，Pi含量激增，说明了在这两种离子环境下，ZjAC2蛋白将ATP水解为了AMP和PPi。

AC酶活性检测方法：

催化体系：50mM TRIS-HCl(pH 7.5)，0.5mM ATP和20mM辅酶金属离子，催化条件为30℃，20min。催化完成后使用高效液相色谱(HPLC)，检测催化体系中cAMP含量，从而确定酶催化活性及效率。

检测参数如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm,5μm)，柱温30℃，流动相为甲醇：20mmoL磷酸二氢钾体积比10：90，检测波长254nm，进样体积20μm，流速0.8mL/min。

磷酸水解酶活性检测方法：

使用Sigma公司单磷检测试剂盒(Malachite Green Phosphate Assay Kit(POMG-25H))进行第一次单磷含量检测，之后在反应体系中加入焦磷酸酶继续反应20min，后再次检测反应体系中单磷含量，以此来确定水解酶活性的产物为ADP或AMP。

实施例四

枣树在体瞬时表达试验

将ZjAC2基因克隆到pCG3301植物过表达载体，并通过热激转化法转入农杆菌GV3101中并涂布于含利福平(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基中，后挑单克隆菌落于含同样抗生素的LB液体培养基中28℃200rpm培养至菌液OD600＝0.6。

收集菌体，重悬于10mM MES、10mM MgCl₂和200mM乙酰丁香酮，pH6.0的注射侵染液中，取2mL注射于白熟期的冬枣果实中，注射后24h和72h取冬枣果实，检测ZjAC2基因的表达量及cAMP的含量，结果如图5所示，试验组(即注射重组后pCG3301)相较于空载组(pCG3301)及空白对照组，ZjAC2的表达量显著提升，同时cAMP的含量也显著提升。

因此，本发明采用上述一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列，除腺苷酸环化酶活性外，还具备NTP水解酶活性、三聚磷酸酶活性以及较弱的焦磷酸酶活性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种具有三磷酸腺苷隧道金属酶活性的ZjAC2编码基因序列

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 597

<212> DNA

<213> 三磷酸腺苷隧道金属酶基因(TTMs)(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

atggaggtcg aagtcaagct tcggctccca gacgccgccg cccatcgccg cgtcaacgac 60

ctcctgtctc ccttccgcgt cgccactttc cggcaagaga atctcttctt tgacggggcc 120

gccgctgagc tctcgtcgcg ccgagccgtc ctccgcctga ggttctacga cgacgacacc 180

cgttgcgtcg tgtcgctcaa ggccagggcg gttctcgtcg acggcatcag ccgggtcgag 240

gaggacgagg aggagctgga gccggcggtg gggcgtgcct gcgttgccga gccggagaag 300

cttctggcgg cggagtgtag gatcttgaag agggtgaagg atgaatttgg ggtttcgggg 360

tttgttgggc ttggagggtt tgggaatgtg agggatgtgt atgagtggaa aggattgaaa 420

ttggaggtcg atgagactcg gtatgggttc gggacttgct atgagattga atgcgagagt 480

gctgaccctg aaggagtcaa gaaggtgctc gaggagtttt tgaaggagaa tgggattgaa 540

tattcttact cagaggcctc caagtttgcg gtttttcgat ccggaaagct gccttag 597