具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

汉黄芩素对组蛋白巴豆酰化的抑制作用

染色质的核小体共由8个可被表观遗传修饰的核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4各两个单体)组成，对核小体的表观遗传修饰可实现对HIV-1转录的调控。其中核心组蛋白的乙酰化修饰使染色质变松，使其更容易被相互作用的蛋白质所利用，从而促进HIV-1转录激活。而HIV-1长末端重复序列(LTR)结合部位组蛋白酰化修饰则对潜伏库的建立至关重要。

近年来的研究发现，组蛋白巴豆酰化和乙酰化一样使组蛋白与HIV-1的LTR区结合疏松，促进潜伏HIV-1的转录再激活，而且巴豆酰化促进HIV-1转录的效率更高。伏立诺司他(SAHA)是一种已知的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，可以通过抑制HDAC，促进组蛋白巴豆酰化，从而激活潜伏HIV-1的表达。

为了探究汉黄芩素是否影响潜伏HIV-1的LTR区组蛋白的巴豆酰化，本实施例使用12 孔细胞培养板，选用培养体系为3mL的J-Lat 10.6细胞(J-Lat 10.6是Jurkat细胞感染了包装逆转录病毒构建的HIV-R7/E-/GFP，这是一个由非功能性的Env基因移码突变和GFP(绿色荧光蛋白)替代Nef基因的全长HIV-1基因组，用于研究HIV潜伏和复活)，根据如下分组应用不同的药物处理细胞：设DMSO组为阴性对照组、设SAHA组(1μM)为阳性对照组，单用汉黄芩素(50μM)和汉黄芩素(50μM)+SAHA组(1μM)为实验组。处理24小时后，提取蛋白，最后免疫印迹法检测组蛋白H3/H4的巴豆酰化，重复三次实验(见图1中A所示实验流程示意图)。图1中B为组蛋白H3及组蛋白H3/H4巴豆酰化的蛋白免疫印迹图像。图1中C-D是以核心组蛋白H3为参照，分别统计H3/H4巴豆酰化与组蛋白H3条带灰度值的比值。结果以均值±标准差表示。“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“ns”表示无统计学差异(p＞0.05)。Wogonin：汉黄芩素，Cr：巴豆酰化，DMSO：二甲基亚砜，SAHA：伏立诺司他，WB：蛋白免疫印迹法。

图1中结果显示，相对于阴性对照DMSO组，汉黄芩素组的H3/H4巴豆酰化发生显著下调；而相对于阳性对照SAHA组，汉黄芩素+SAHA组的H3/H4巴豆酰化也被显著抑制。以上结果表明，汉黄芩素可以抑制J-Lat 10.6细胞H3/H4组蛋白的巴豆酰化。

实施例2

汉黄芩素对组蛋白乙酰转移酶的抑制作用

组蛋白的巴豆酰化修饰受到组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和组蛋白乙酰转移酶P300 的双重调节，其中P300可促进组蛋白的乙酰化和巴豆酰化修饰，而HDAC1作用与之相反。

为了研究汉黄芩素下调组蛋白巴豆酰化的上游通路，本发明进一步探究了汉黄芩素对 HDAC1和P300表达的影响。使用12孔细胞培养板，选用培养体系为3mL的J-Lat 10.6细胞，根据如下分组应用不同的药物处理细胞：设DMSO组为阴性对照组，设汉黄芩素(50μM、100μM、150μM)为实验组。处理24小时，提取蛋白后使用免疫印迹法检测HDAC1和P300 的表达，重复三次实验(见图2中A中实验流程示意图)；图2中B为HDAC1和P300表达的免疫印迹图像。图2中C是以GAPDH作为参照，计算HDAC1和P300条带与GAPDH 条带灰度值的比值并进行展示。结果以均值±标准差表示。“*”表示p＜0.05，“**”表示 p＜0.01，“ns”表示无统计学差异(p＞0.05)。Wogonin：汉黄芩素，P300：一种组蛋白乙酰转移酶，HDAC1：组蛋白去乙酰化酶1，DMSO：二甲基亚砜，WB：蛋白免疫印迹法。

图2中结果显示，与阴性对照DMSO组相比，汉黄芩素能够显著抑制组蛋白乙酰转移酶 P300的表达，且随着汉黄芩素浓度的增加，抑制随之增强；而汉黄芩素对HDAC1的表达无显著影响。以上结果表明，汉黄芩素特异性的抑制P300的表达而对HDAC1影响较小。

实施例3

汉黄芩素对巴豆酰化及潜伏HIV-1的影响可被CTPB逆转

CTPB是一种P300的特异性小分子激活剂。为了研究CTPB对P300的激活是否可逆转汉黄芩素对组蛋白巴豆酰化的抑制，本实施例应用免疫印迹法检测J-Lat 10.6细胞中H3/H4 巴豆酰化的变化。使用12孔细胞培养板，选用培养体系为3mL的J-Lat 10.6细胞，根据以下分组处理细胞：设DMSO组为阴性对照组，设单用汉黄芩素(50μM、100μM、150μM)和汉黄芩素(50μM、100μM、150μM)+CTPB(100M)为实验组，处理24小时后，提取蛋白，使用免疫印迹法检测H3/H4组蛋白巴豆酰化(见图3中A中实验流程示意图)；图3中B为组蛋白H3及H3/H4巴豆酰化表达的免疫印迹图像；设DMSO为阴性对照组，设CTPB(100M) 为阳性对照组，设单用汉黄芩素(50μM)和汉黄芩素(50μM)+CTPB(100M)为实验组，处理24小时后，流式细胞术检测GFP的表达；图3中C所示为与阴性对照DMSO组相比， J-Lat 10.6细胞中GFP阳性细胞百分率统计，结果以均值±标准差表示，“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“ns”表示无统计学差异(p＞0.05)。Wogonin：汉黄芩素，Cr：巴豆酰化，DMSO：二甲基亚砜，CTPB：一种P300的选择性小分子激活剂，WB：蛋白免疫印迹法。

图3中结果显示，与单用汉黄芩素相比，同时应用CTPB处理细胞可以使被汉黄芩素抑制的H3/H4巴豆酰化重新增强。通过选用流式细胞术检测J-Lat 10.6细胞中GFP(绿色荧光蛋白)表达情况，发现与阴性对照DMSO组相比，汉黄芩素组GFP表达下降，阳性对照CTPB组GFP表达升高，而汉黄芩素+CTPB组与DMSO组GFP表达则无统计学差异。以上结果表明，P300激动剂CTPB同时逆转了汉黄芩素对组蛋白巴豆酰化和潜伏HIV-1再激活的抑制。

实施例4

汉黄芩素呈浓度依赖性地抑制J-Lat A2细胞中潜伏HIV-1的再激活

J-Lat A2细胞模型是美国Verdin实验室构建的一株用于模拟HIV-1潜伏状态的细胞株。它是在JurkatT细胞的染色体上整合了HIV-1长末端重复序列(LTR)和Tat基因以及绿色荧光蛋白GFP基因。当药物作用于J-Lat A2细胞，若有激活作用产生时，HIV-1-LTR将会启动基因转录，从而刺激GFP的表达。使用流式细胞仪检测表达GFP的阳性细胞在所有检测细胞中的比例，从而判断该药物的激活活性。

使用48孔细胞培养板，J-Lat A2细胞培养体系为1mL，根据如下分组应用不同药物处理细胞：DMSO组为阴性对照组，PMA组(10ng/mL)为阳性对照组，实验组为汉黄芩素(1μM、10μM、20μM、30μM、40μM)合用PMA(10ng/mL)。以上各组培养24h后，进行检测(见图4中A中实验流程示意图)。图4中B为不同处理浓度的汉黄芩素对J-Lat A2细胞中HIV-1 再激活的抑制作用，柱形图表示GFP阳性细胞百分率，点状图表示存活细胞百分率，计数以均值±标准差表示。与阳性对照PMA组GFP阳性细胞百分率相比，“***”表示p＜0.001，“****”表示p＜0.0001。Wogonin：汉黄芩素，DMSO：二甲基亚砜，PMA：佛波醇-12-肉豆蔻酸-13- 乙酸酯，GFP：绿色荧光蛋白。

图4中的结果显示，与阳性对照PMA组(一种PKC(蛋白激酶C)活化剂)相比，各个处理浓度汉黄芩素+PMA组的GFP表达均显著下调，且汉黄芩素浓度越高，被PMA激活的GFP阳性细胞比例越低，即汉黄芩素在J-Lat A2细胞中抑制潜伏HIV-1再激活的功能表现出明显的浓度依赖性。所选浓度区间40μM的汉黄芩素抑制作用最强，且这个浓度能保证细胞的良好的存活率。

实施例5

汉黄芩素可抑制J-Lat A2细胞中潜伏HIV-1再激活的“后续效应”

旨在消除HIV-1潜伏储存库危害的“阻断并封锁”策略，其目标是通过加深前病毒的潜伏，持续“阻断”前病毒的表达直至宿主细胞自然死亡，实现对HIV-1潜伏储存库的“封锁”，从而允许安全地撤下CART治疗(抗原受体T细胞免疫疗法)，这里所说的“安全撤药”不单纯指撤掉CART治疗，如果撤药后需要另一种药物维持病毒不反弹，“阻断”将失去意义。汉黄芩素处理细胞使潜伏HIV-1前病毒不易被激活，证明其对潜伏库再激活有“阻断”功能。如果洗脱药物后，预处理过的细胞中前病毒仍不易被激活，才可能具有潜在“封锁”作用。

为了验证汉黄芩素的“封锁”功能，我们用汉黄芩素处理细胞不同时间后洗脱药物，再检测GFP的表达。由于不同培养时间细胞状态不同，造成对照组的GFP阳性细胞百分率基线不统一，为了便于比较，我们将DMSO组激活率设为100％，从而将实验组的抑制效果归一化。本实施例使用48孔细胞培养板，J-Lat A2细胞培养体系为1mL，根据如下分组应用不同的药物处理细胞：设DMSO组对照组，汉黄芩素(40μM)为实验组；分别培养48h、96h、 144h后，洗脱药物(见图5中A实验流程示意图)；再用PMA(10ng/mL)处理细胞(如图 5中B所示)或不用任何药物处理(如图5中C中所示)，再培养24h后检测GFP阳性细胞比例，其中汉黄芩素组的GFP阳性率以DMSO组作为100％标准化后展示。Wogonin：汉黄芩素，DMSO：二甲基亚砜，PMA：佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，GFP：绿色荧光蛋白。计数以均值±标准差表示。

图5中结果显示，尽管药物后续被洗脱，但汉黄芩素预处理时间越长，J-Lat A2细胞中潜伏GFP越不易被PMA激活；即预处理时间越长，潜伏GFP的本底表达也越低。尽管洗脱只能除掉培养基和细胞表面的药物，但是洗脱后继续24小时培养可使细胞内的药物被进一步代谢，且汉黄芩素预处理时间越长，洗脱后潜伏HIV-1越不易被激活，这些结果均表明汉黄芩素对潜伏储存库可能具有“封锁”的潜力。

实施例6

汉黄芩素可抑制HIV-1感染者外周血病毒储存库再激活

通过检测J-Lat细胞GFP虽然可评估病毒的表达水平，但由于J-Lat细胞中过高的“潜伏细胞”比例，并非完全处于静息的状态，因此无法完全模拟患者体内潜伏储存库的真实状态。为了获得汉黄芩素对HIV-1感染者体内潜伏前病毒表达的实际作用，本实施例使用CART长期治疗无病毒血症HIV-1感染者的外周血，进一步验证汉黄芩素抑制潜伏储存库再激活的功能。

在HIV-1感染者外周血中纯化出CD4+T细胞，使用12孔细胞培养板，选用培养体系为 3ml的CD4+T细胞，根据如下分组应用不同的药物处理细胞：设DMSO组为阴性对照组，Anti-CD3/CD28(2μg/mL)为阳性对照组，汉黄芩素(40μM)+Anti-CD3/CD28(2μg/mL) 组及单用汉黄芩素(40μM)组分别为实验组1-2。药物处理3天后，一部分进行P24胞内染色，随后流式细胞术检测P24阳性细胞。另一部分细胞提取RNA并反转录为cDNA，VQA-PCR 检测HIV-1转录本的表达(见图6中A实验流程示意图)。图6中B为一例样本P24检测流式细胞图，图中数值表示P24阳性细胞百分率。图6中C为流式细胞术检测P24阳性细胞百分率统计图(5例样本)。图6中D和E分别是实验组1(9例样本)和实验组2(6例样本) 用VQA方法检测HIV-1转录本表达量的统计结果，阳性组和实验组以DMSO组的倍数表示，计数以均值±标准差表示。“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01“****”表示p＜0.0001。Viral quality assurance(VQA)：病毒质量保证，Wogonin(即WO)：汉黄芩素，DMSO：二甲基亚砜，P24：HIV-1核衣壳蛋白，Anti-CD3/CD28：抗人CD3/CD28单克隆抗体。

图6中的结果显示，相对于阳性对照Anti-CD3/CD28组，实验组(Anti-CD3/CD28+汉黄芩素)P24阳性细胞比例显著降低，与阴性对照DMSO组相比则无统计学差异，三组间细胞存活率比较无统计学差异。绝对荧光定量PCR(VQA-PCR)检测显示，相对于阳性对照 Anti-CD3/CD28组，实验组1(Anti-CD3/CD28+汉黄芩素)HIV-1转录本表达显著下调(见图6中D)，与阴性对照DMSO组相比，实验组2(单用汉黄芩素)HIV-1转录本表达也显著下调(见图6中E)。由此可见，汉黄芩素可以显著抑制患者外周血离体细胞中潜伏HIV-1 的再激活。

实施例7

汉黄芩素联用雷公藤甲素的功效评价

雷公藤甲素在病毒转录水平上能抑制HIV-1的体外复制，被报道是一种抑制HIV-1储存库再激活的中药提取物。

本实施例选用J-Lat 10.6细胞对汉黄芩素联用雷公藤甲素功效进行了评价。使用48孔细胞培养板，选用培养体系为1mL的J-Lat 10.6细胞，根据如下分组应用不同的药物处理细胞：设DMSO组为阴性对照组、PMA(10ng/mL)组为阳性对照组，实验组为汉黄芩素(40μM)+PMA(10ng/mL)，雷公藤甲素(2nM)+PMA(10ng/mL)组，汉黄芩素(40μM)+雷公藤甲素(2nM)+PMA(10ng/mL)组。培养24小时后，流式细胞术检测GFP阳性细胞(见图7中A实验流程示意图)。图7中B中柱形图表示GFP阳性细胞百分率，点状图表示存活细胞百分率，计数以均值±标准差表示。“****”表示p＜0.0001。Wogonin：汉黄芩素， Triptolide：雷公藤甲素，DMSO：二甲基亚砜，PMA：佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，GFP：绿色荧光蛋白。

图7中结果显示，单一汉黄芩素或雷公藤甲素都能降低GFP阳性细胞比例，且两者合用抑制作用显著增强(单一汉黄芩素可使GFP阳性细胞比例下降约63％，单一雷公藤甲素可使 GFP阳性细胞比例下降约16.2％，而两者合用时可使GFP阳性细胞比例下降约76.1％)。提示两种药物产生协同增敏作用，抑制潜伏HIV-1再激活，雷公藤甲素通过抑制Tat功能阻碍 HIV-1前病毒转录的延长，汉黄芩素可能具有不同的抑制病毒机制。在中医药临床实践中，常用多种中药组成的复方治疗疾病，本实施例研究不同化合物合用的抑制功效可为临床组方提供一些参考。

实施例8

汉黄芩素抑制潜伏HIV-1再激活功能的特异性

黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素都是源于黄芩的黄酮类化合物，本实施例通过实验验证上述黄酮类化合物中是否只有汉黄芩素才具有抑制潜伏HIV-1再激活的功能。

使用48孔细胞培养板，选用培养体系为1mL的J-Lat A2细胞，根据如下分组应用不同的药物处理细胞：设DMSO组为阴性对照组、PMA(10ng/mL)组为阳性对照组，实验组为汉黄芩素(40μM)+PMA(10ng/mL)、黄芩素(40μM)+PMA(10ng/mL)、黄芩苷(1μM) +PMA(10ng/mL)组以及三种化合物与PMA按上述浓度合用组。培养24小时后，使用流式细胞术检测GFP阳性细胞(见图8中A实验流程示意图)。图8中B所示柱形图表示GFP 阳性细胞百分率，点状图表示存活细胞百分率，计数以均值±标准差表示。ns表示无统计学差异(p＞0.05)。Wogonin：汉黄芩素，Baicalein：黄芩素，Baicalin：黄芩苷，DMSO：二甲基亚砜，PMA：佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，GFP：绿色荧光蛋白。

图8中结果显示，只有汉黄芩素可以降低GFP表达，三者合用不能增强抑制再激活的功能(见图8中B)。黄芩苷和黄芩素均被报道具有抗HIV-1活性，但黄芩苷是在病毒进入前抑制HIV-1感染，黄芩素则被认为是一类HIV-1整合酶抑制剂。以上结果表明，只有汉黄芩素才能抑制潜伏HIV-1再激活，上述三种黄酮类化合物可能具有不同的抗HIV-1机制。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。