阅读说明：本技术 一种测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法 (Method for measuring content of cantharis yellow colorant in feed ) 是由 章厉劼 孙真峥 王庆红 赵贵 周艺林 郭萍 周泽晓 钱莘莘 孙播东 廖欢 罗永成 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法,包括：(1)预处理,称取待测饲料样品,加入水、饱和氯化钠、0.05％乙酸溶液、混合提取液涡旋混合后离心,吸取上层萃取液,加入无水乙醇,混匀；在氮气下吹干；用甲基叔丁基醚+乙腈溶液溶解残渣,过滤得供试样品溶液；(2)液相色谱仪分析,测定斑蝥黄着色剂的峰面积；(3)根据前述待测饲料样品的斑蝥黄峰面积,利用斑蝥黄线性回归方程计算待测饲料中斑蝥黄着色剂的质量浓度,再计算待测饲料中斑蝥黄着色剂的含量。本发明方法具有简单、快速、准确、灵敏的特点,适用于饲料中斑蝥着色剂含量的检测分析。(The invention discloses a method for measuring the content of canthaxanthin colorant in feed, which comprises the following steps: (1) pretreating, weighing a feed sample to be detected, adding water, saturated sodium chloride, 0.05% acetic acid solution and mixed extracting solution, carrying out vortex mixing, centrifuging, sucking upper layer extracting solution, adding absolute ethyl alcohol, and mixing uniformly; drying under nitrogen; dissolving the residue with a methyl tert-butyl ether and acetonitrile solution, and filtering to obtain a sample solution; (2) analyzing by a liquid chromatograph, and determining the peak area of the cantharis yellow colorant; (3) and calculating the mass concentration of the canthaxanthin colorant in the feed to be detected by utilizing a canthaxanthin linear regression equation according to the canthaxanthin peak area of the feed sample to be detected, and then calculating the content of the canthaxanthin colorant in the feed to be detected. The method has the characteristics of simplicity, rapidness, accuracy and sensitivity, and is suitable for detecting and analyzing the content of the cantharis colorant in the feed.)

一种测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法

技术领域

本发明涉及一种测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法，属于斑蝥黄着色剂含量检测技术领域。

背景技术

我国《中华人民共和国农业部公告》第2625号中明确规定配合饲料中β-阿朴-8＇-β,β-胡萝卜素-4,4-二酮(斑蝥黄)的最高限量为25mg/kg。目前，我国对饲料中β-阿朴-8＇-β,β-胡萝卜素-4,4-二酮(斑蝥黄)检测的行业标准采用正向色谱法，该方法普适性差，造成饲料中着色剂的检测空白，增加了饲料产品质量安全问题和监管的不利。特别是在肉禽、蛋禽养殖过程中，养殖户和企业为了迎合消费者心理，追求外观色泽漂亮，肉鸡膘黄、脚黑，鸡蛋心红、亮，添加着色剂来改变色泽充当土鸡、土鸡蛋来追求高回报已为常态。着色剂在禽肉、饲料中大量蓄积、残留，增加了消费者的健康危害风险。

β-阿朴-8＇-β,β-胡萝卜素-4,4-二酮(斑蝥黄)又叫角黄素，是一种带橙红色的类胡萝卜素色素。多作为动物饲料添加剂，使蛋黄和禽肉的颜色更加鲜明。用于食品添加时主要作为橙色着色剂，但极少使用。目前在对饲料斑蝥黄着色剂的检测中，由于样品中脂类和蛋白对结果的干扰，以及斑蝥黄着色剂本身不稳定的因素，使得饲料中斑蝥黄着色剂检测存在准确性差、灵敏度低、分析速度慢等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种灵敏度高、准确性好、分析速度快的测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法，通过合理的样品提取和净化条件，以解决现有技术存在的样品中脂类和蛋白对检测结果的干扰，以及待测物斑蝥黄不稳定的问题。

本发明的技术方案是：一种测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法，包括：

(1)预处理

称取待测饲料样品，加入水、饱和氯化钠、0.05％乙酸溶液、混合提取液涡旋混合后离心，吸取上层萃取液；

用混合提取液重复萃取取上层萃取液，所述混合提取液为甲醇：乙酸乙酯：正己烷的混合溶液；

合并萃取液，加入无水乙醇，混匀；在氮气下吹干；

用甲基叔丁基醚：乙腈溶液溶解残渣，过滤得供试样品溶液；

(2)液相色谱仪分析

将所述供试样品溶液上液相色谱仪进行分析，测定斑蝥黄着色剂的峰面积；

(3)计算饲料中斑蝥黄着色剂的含量

利用多组已知质量浓度的斑蝥黄溶液测定斑蝥黄峰面积，以斑蝥黄质量浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标进行线性回归，建立斑蝥黄线性回归方程；

根据前述待测饲料样品的斑蝥黄峰面积，利用斑蝥黄线性回归方程计算待测饲料中斑蝥黄着色剂的质量浓度，再计算待测饲料中斑蝥黄着色剂的含量。

优选的，所述斑蝥黄线性回归方程为：

y＝40401.4x-1776.1

式中：y为斑蝥黄峰面积，x为待测饲料中斑蝥黄着色剂的质量浓度。

优选的，饲料中斑蝥黄着色剂含量的计算公式为：

式中，W为待测饲料中斑蝥黄着色剂的含量，x为待测饲料中斑蝥黄着色剂的质量浓度，V为溶解残余物的甲基叔丁基醚+乙腈溶液的体积，m为待测饲料的质量。

优选的，所述混合提取液中甲醇：乙酸乙酯：正己烷的体积比例为1：1：1。

优选的，所述甲基叔丁基醚：乙腈溶液中甲基叔丁基醚：乙腈的体积比例为1：9。

优选的，饲料中斑蝥黄含量的检测范围为0.20～25mg/kg。

本发明的有益效果是：本发明方法以《饲料添加剂安全使用规范》中着色剂项下的着色剂斑蝥黄为研究对象，待测饲料样品在水、饱和氯化钠、0.05％乙酸溶液混合下，溶解包裹在斑蝥黄表面的淀粉，再用甲醇+乙酸乙酯+正己烷混合提取液液液萃取，上层溶液浓缩复溶后，超高效液相色谱法测定，结果表明方法具有简单、快速、准确、灵敏的特点，适用于饲料中斑蝥黄着色剂含量检测分析。

本发明有利于饲料中斑蝥黄着色剂含量检测标准的建立提供大量的基础数据，逐步完善对饲料质量安全风险监测依据，对斑蝥黄使用进行质量安全性进行评价，掌握斑蝥黄在饲料生产的损耗，指导饲料企业、养殖场科学合理的使用着色剂，即确保不发生重大家禽畜产品质量安全事件，又在满足消费者色泽需求的情况下，降低生产成本。

附图说明

图1为斑蝥黄标准样品液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1：饲料中斑蝥黄着色剂含量的测定方法，

测定饲料中斑蝥黄着色剂含量的方法包括以下内容：

1、预处理

称取预混合饲料0.5g，浓缩饲料1.0g，配合试样2.0g(精确到到0.01g)于50mL离心管中，分别加入水4.0mL，饱和氯化钠溶液2.0mL，0.05％乙酸溶液4.0ml，摇匀，加入甲醇+乙酸乙酯+正己烷(体积比例1：1：1)混合提取液10.0mL，涡旋2min，5000r/min离心5分钟，用滴管吸取上层溶液于另一个离心管。

再次加入10.0mL甲醇+乙酸乙酯+正己烷(体积比例1：1：1)混合提取液重复提取2次；

合并3次上层溶液于同一离心管中，加入2.0mL无水乙醇，混匀。

于40℃氮气下吹干，用甲基叔丁基醚+乙腈(体积比例1：9)溶液5.0mL溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜，得供试样品溶液备用。

2、液相色谱仪分析

将供试样品溶液上液相色谱仪进行分析，测定得到斑蝥黄峰面积。

3、计算饲料中斑蝥黄着色剂的含量

利用多组已知质量浓度的斑蝥黄溶液测定斑蝥黄峰面积，以斑蝥黄质量浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标进行线性回归，建立斑蝥黄线性回归方程。

斑蝥黄线性回归方程的具体建立方法为：

(1)制备标准溶液

将斑蝥黄置于棕色容量瓶中，加入0.1g焦性没食子酸增加稳定性，用三氯甲烷溶解定容，摇匀，配置成浓度为500μg/mL的储备液，置于-20℃冰箱中保存。有效期为3个月。

(2)制备各种质量浓度的测试溶液

取适量斑蝥黄储备液，用用甲基叔丁基醚+乙腈(体积比例1：9)溶液稀释成浓度0.625、1.25、2.5、5.0、10.0μg/mL的斑蝥黄测试溶液。

(3)进样分析

用超高效液相色谱仪对前述已知质量浓度的斑蝥黄测试溶液进行测试，检测结果如图1所示，计算相应的斑蝥黄峰面积(见表1)。

表1不同质量浓度的斑蝥黄对应的峰面积

线性考察以组分质量浓度(C)为横坐标,相应峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。斑蝥黄回归方程y＝40401.4x-1776.1，R²＝0.99985，，可知斑蝥黄质量浓度在0.625～10.0μg/mL范围内线性关系良好。

根据前述待测饲料样品的斑蝥黄峰面积以及斑蝥黄线性回归方程，计算待测饲料中斑蝥黄着色剂的质量浓度，再计算待测饲料中斑蝥黄着色剂的含量(结果见表2)。

饲料中斑蝥黄着色剂含量的计算公式为：

式中，W为待测饲料中斑蝥黄着色剂的含量，x为待测饲料中斑蝥黄着色剂的质量浓度，V为溶解残余物的甲基叔丁基醚+乙腈(体积比例1：9)溶液的体积，m为待测饲料的质量。

表2饲料样品测定结果

注：“/”表示低于检出限，未检出。

实施例2：重复性、准确度、灵敏度验证

(1)重复性验证

取一供试样品溶液，重复进样6次，测定斑蝥黄的峰面积，计算得出斑蝥黄峰面积的RSD为0.4％。可知采用本发明方法的重复性很好。

(2)准确度验证

在饲料空白样品中添加斑蝥黄，制成斑蝥黄添加量为2.5μg/kg、1.25μg/kg、2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg的阳性添加样，每个添加量平行制备3份，按实施例1中预处理方法制备供试品溶液，上机测定，每个样品测定1次。测定结果见表3。

表3斑蝥黄回收率测定结果

由表3可知，斑蝥黄回收率为72.8％～82.8％，由低到高添加量的平均回收率依次为75.9％、76.3％、72.8％、77.4％、82.8％，由低到高添加量的RSD(相对标准偏差)依次为0.1％、0.2％、0.1％、0.05％、0.03％。根据前述数据，可以得出采用本发明方法的回收率(准确度)较好，方法达到了严格的定量准确性和重复性。

(3)灵敏度验证

在饲料空白样品中添加斑蝥黄，测定检测限，依据色谱峰信噪比S/N>3为方法检测限。该方法饲料中斑蝥黄的检测限为0.20mg/kg，可知本发明方法的灵敏度较好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。