癌症治疗和转移抑制
阅读说明：本技术 癌症治疗和转移抑制 (Cancer treatment and metastasis inhibition ) 是由 C.法尔顿 L.H.扬森 M.德扬格兹 于 2018-02-12 设计创作，主要内容包括：公开了通过至少减少电压门控钠通道电流的持续部分而不消除瞬态部分的作用来减少或预防表达VGSC的癌症中的转移行为的化合物和方法。(Compounds and methods are disclosed for reducing or preventing metastatic behavior in VGSC-expressing cancers by reducing at least the persistence portion of the voltage-gated sodium channel current without abrogating the effects of the transient portion.)
发明领域
本发明涉及癌症的治疗，并且特别涉及发现表达电压门控钠通道(VGSC)的所有癌症，比如(但不限于)转移性癌症(比如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或***癌)的治疗。
发明背景
转移性疾病占所有癌症相关死亡的90%以上。转移性癌症(比如乳腺癌、结肠癌和***癌)的发展通常认为包括如下5个阶段：
1. 发生，即正常细胞初始转化为癌细胞；
2. 增殖，即增加癌细胞数量以形成递增大小的原发性肿瘤；
3. 在发生或增殖阶段期间，从其中癌细胞不具有转移行为的潜力的状态转变为其中癌细胞具有转移行为的潜力的状态；
4. 癌细胞脱离原发性肿瘤，随后这些脱离的细胞朝向循环系统移动到同一器官内的周围组织区域；
5. 转移，即脱离的细胞通过循环(血液或淋巴)移动到其他器官以在那些其他器官中产生继发性肿瘤。
在细胞中发生并导致以上阶段3的状态转变的显著变化为功能性电压门控钠通道(VGSC)的表达。在人类，有9种不同的VGSCα亚单位或“NaV”蛋白(Nav1.1至Nav1.9)，并且已发现所有均在不同类型的癌细胞上表达(Brackenbury, 2012; Roger et al., 2015)。在乳腺癌和结肠癌中通常为Nav1.5通道表达，和在***癌的情况下通常为Nav1.7通道。VGSC可以新生儿和/或成人形式表达。在乳腺癌和结肠癌的情况下，新生儿形式的Nav1.5通道(nNav1.5)表达。在***癌的情况下，也是Nav1.7的新生儿剪接变体表达(Diss et al., 2001)。在不存在这种通道的情况下，肿瘤细胞不具有侵袭的潜力，并因此不具有转移行为的潜力。
在一些情况下，发生阶段涉及癌细胞的生长，所述癌细胞从一开始就具有转移潜力。进一步地，血液癌症比如白血病具有固有的转移特征，并可侵袭并积聚在其他器官(像肝脏或脾)中(Trendowski, 2015)。
已建议尝试通过阻止功能性VGSC的表达、完全阻断已表达的功能性VGSC的活性或杀死细胞中的一项或多项来寻找预防转移的疗法。本发明涉及不同的方法。
电流间歇地流过VGSC，也就是说电流以脉冲形式流动。众所周知，每个脉冲包括瞬态(或峰值)部分，随后是低水平DC部分，称为晚电流或持续电流。后者由低氧促进，众所周知在生长的肿瘤中发生低氧。VGSC活性通过促进质子流出和酸化细胞周围空间来增加侵袭性。VGSC还控制疼痛感。
以下式Ia的eleclazine，4-(嘧啶-2-基甲基)-7-(4-(三氟甲氧基)苯基)-3,4-二氢苯并[f][1,4]氧氮杂-5(2H)-酮：
和以下式Ib的4-(嘧啶-2-基甲基)-7-(4-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢苯并[f][1,4]氧氮杂
两者已知用于治疗心脏病。进一步已知它们中的每一个差别地影响VGSC电流的瞬态和持续部分的幅度，该作用为剂量依赖性模式。高剂量的这些药物完全阻滞VGSC电流。具有完全阻滞心脏组织中的VGSC电流的作用的这些或任何其他药物的剂量，对患者来说是致命的，因为心脏需要这些电流来发挥其功能。进一步已知式Ia和Ib的化合物为心脏晚钠电流(lNaL) (也称为持续钠电流(INaP))的有效和选择性抑制剂，并且有效治疗人类长QT综合征，特别是长QT综合征3型(LQT3)，参见US 2015/0038489 A1。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现：
(i) 分别在乳腺癌和结肠癌中以及在***癌中抑制Nav1.5和Nav1.7电流的持续部分，抑制转移行为；
(ii) 没有必要抑制这些电流的瞬态部分以抑制转移行为；
(iii) 适当剂量的如下定义的式I化合物将抑制转移行为而不会阻止增殖或破坏肿瘤细胞；和
(iv) 在先前暴露于低氧的细胞中，式I化合物对电流的持续部分的抑制作用更大，低氧为在生长的肿瘤中发生并且对转移过程产生关键的积极贡献的状态。
因此，在第一方面，本发明涉及以下式I的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1为三氟甲氧基或三氟甲基，用于在患有癌症的患者中减少或预防转移行为和/或疼痛感的方法。在一个实施方案中，癌症为表达电压门控钠通道(VGSC)的癌症。在另一个实施方案中，癌症不为表达VGSC的癌症。例如，患者可能患有与VGSC表达和/或转移行为的风险相关的癌症，但尚未确定VGSC表达和/或转移行为。
在本发明的一个实施方案中，式I化合物中的R1为三氟甲氧基，即式I化合物为以下式Ia的eleclazine，4-(嘧啶-2-基甲基)-7-(4-(三氟甲氧基)苯基)-3,4-二氢苯并[f][1,4]氧氮杂
在本发明的另一个实施方案中，式I化合物中的R1为三氟甲基，即式I化合物为以下式Ib的4-(嘧啶-2-基甲基)-7-(4-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢苯并[f][1,4]氧氮杂
在本发明的一个实施方案中，癌症为非实体肿瘤癌症。在一个特定实施方案中，癌症为白血病。在另一个特定实施方案中，癌症为淋巴瘤。
在本发明的一个实施方案中，癌症为实体肿瘤癌症，比如癌、间皮瘤、肉瘤、黑素瘤或神经母细胞瘤。在一个特定实施方案中，癌症为乳腺癌。在另一个特定实施方案中，癌症为结肠癌。在另一个特定实施方案中，癌症为***癌。在另一个特定实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个特定实施方案中，癌症为***。在另一个特定实施方案中，癌症为胃癌。在另一个特定实施方案中，癌症为神经母细胞瘤。
根据本发明的一个实施方案，癌症处于3、4或5期。根据本发明的另一个实施方案，癌症处于1或2期。
根据本发明的一个实施方案，通过在患有表达电压门控钠通道(VGSC)的癌症的患者中以适当的剂量给予式I (即Ia或Ib)的化合物，抑制或减少癌症中的转移行为。
根据本发明的另一个实施方案，通过以适当的剂量给予式I化合物以抑制或减少VGSC电流的持续部分而不阻滞或至少不完全阻滞瞬态部分，抑制或减少癌症中的转移行为。因此，可以这种方式抑制或减少癌症中的转移，而不必给予致命的药物剂量。
根据本发明的另一个实施方案，其将在以下更全面地解释，式I化合物以抑制VGSC电流的持续部分而不阻滞或不完全阻滞瞬态部分并且不直接导致细胞死亡的剂量水平给予。因此，可抑制肿瘤或转移而不引起癌细胞的死亡。
可在不引起细胞死亡的情况下抑制或减少转移行为的事实可能是一个显著的优点，因为最近的工作已经表明，通过杀死细胞来治疗癌症至少在一些情况下可能起反作用，在某种意义上说尽管存在短期利益，但癌症将仍会复发和增殖。因此，本发明提供抑制或预防转移行为而没有实际杀死癌细胞可能产生的潜在问题的可能性。
根据本发明的一个实施方案，通过以下方式减少或预防转移行为：
(a) 降低癌细胞的侵袭性；
(b) 任选地在低氧但非常氧条件下，降低癌细胞的运动性；
(c) 任选地在常氧和低氧两种条件下，降低至少一种VGSC的癌细胞表达；
(d) 增加癌细胞的粘附性；
(e) 降低癌细胞的迁移能力；或
(f) (a)和(b)、(b)和(c)、(a)和(c)、(a)-(c)或(a)-(e)的组合。
化合物一般地以治疗有效剂量给予。以下更详细地描述与具体剂量方案相关的实施方案。在一个特定实施方案中，化合物以根据以上(a)-(f)中任何一项提供减少或预防转移行为的剂量或剂量方案给予。
根据本发明的另一个实施方案，式I化合物以相当于1 μmol-10 μmol范围的剂量水平使用。
以下参考附图和实施例中列出的实验数据进一步描述本发明的这些和其他方面和实施方案。
具体实施方式
图1为癌症从原发性肿瘤发生发展到继发性肿瘤(转移)形成的时间线的示意图。
图2为在癌症起始和发展到转移期间发生的细胞过程的示意图。
图3(a)为说明通过VGSC的电流的草图，显示电流的瞬态和持续部分两者，并且还显示在常氧和低氧两种条件下的电流。
图4为用于单个测量细胞粘附的细胞粘附测量装置的示意图。
图5为用于测量细胞侧向运动性的装置的示意图。视图(a)为含有半汇合细胞层的细胞培养皿的俯视平面图；视图(b)为铺展细胞的示意性侧剖视图；视图(c)为在时间t = 0时(此时已通过细胞层产生斑痕)的铺展细胞的平面图，和视图(d)为细胞已移动并且创口已部分闭合之后的晚些时间(t = 24小时)的铺展细胞的平面图。
图6为用于测量细胞横向迁移的装置的示意性侧剖视图。
图7为用于测量细胞侵袭性的装置的示意性侧剖视图。
图8为显示化学诱导的低氧对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞的单细胞粘附的浓度依赖性影响的图。在低氧下粘附增加(“脱离负压”- DNP -降低)。
图9为显示台盼蓝细胞排除(即细胞活力)测定结果的图。MDA-MB-231细胞用20 μMeleclazine或0.2% DMSO (阴性溶剂对照)处理48小时。对于处理组和对照组两者，细胞活力几乎为100%，表明eleclazine为非毒性的。
图10显示MTT (增殖)测定的结果。A. 标准曲线。总细胞数(每孔)随吸光度读数(570 nm)线性增加。从所有数据集中减去0.04 (空孔)的背景读数。B. 标准化数据显示在低氧和常氧条件下MDA-MB-231细胞经48小时的增殖。eleclazine和雷诺嗪以10 μM的浓度给予。DMSO (0.2 %)、TTX (10 μM)和培养基为阴性对照。2 mM TEA (K+通道阻滞剂)用作阳性对照。
图11显示创口愈合测定的结果。用0.2% DMSO或10 μM eleclazine处理48小时的低氧细胞的运动指数。在所有时间点，eleclazine具有降低的侧向运动性。
图12显示在体外0.5 μM eleclazine和20 μM河豚毒素(TTX)对低氧(1% O2)下MDAMB-231细胞的侵袭的影响。盒形图表明与对照相比较，经用eleclazine或TTX处理后16小时侵袭的MDA MB-231细胞的标准化数目。在测定开始之前，将细胞用相应的处理条件预温育24小时。对每种条件评估来自4个单独***件的12个视野，***表示P<0.001。0.5 μM的eleclazine不影响侵袭性，和20 μM TTX降低(阳性对照)。
图13显示在体外1 μM eleclazine和1 μM雷诺嗪对低氧(1% O2)下MDA MB-231细胞的侵袭的影响。盒形图表明与对照相比较，经用eleclazine或雷诺嗪处理后16小时侵袭的MDA MB-231细胞的数目。在测定开始之前，将细胞用相应的处理条件预温育24小时。中值和四分位距如下：对照：175.0 (113 & 255)；1 μM eleclazine 131.5 (100 & 175)和1 μM雷诺嗪106.3 (181 & 161)。对于每种条件，来自8个单独***件的12个视野，***表示P<0.001，X表示P>0.05。eleclazine和雷诺嗪(两者均为1 μM)显著但类似地抑制侵袭性。
图14显示在体外5 μM eleclazine和5 μM雷诺嗪对低氧(1% O2)下MDA MB-231细胞的侵袭的影响。盒形图表明与对照相比较，经用eleclazine或雷诺嗪处理后16小时侵袭的MDA MB-231细胞的数目。在测定开始之前，将细胞用相应的处理条件预温育24小时。对于每种条件，来自8个单独***件的12个视野，***表示P<0.001，X表示P>0.05。eleclazine和雷诺嗪(两者均为5 μM)显著抑制侵袭性，但eleclazine的作用明显更大。
图15显示eleclazine (10 μM)对针对nNav1.5蛋白表达染色的MDA-MB-231细胞的校正的总细胞荧光的影响。eleclazine处理降低表达。
图16显示在常氧和低氧(1% O2)下，eleclazine、雷诺嗪(两者均为5 μM)和TTX(0.1和10 μM)对人白血病FLG 29.1细胞系的侵袭性的影响。所有试剂(TTX用作阳性对照)显著抑制侵袭性。
发明的详细公开
转移行为包括以下几个阶段，即：
(a) 细胞从肿瘤中脱离；
(b) 脱离的细胞移动到周围组织中；
(c) 通过周围组织朝向循环系统移动；和
(d) 移动进入循环系统(细胞可最终从中离去以形成继发性肿瘤)。
因此，抑制或降低这些阶段中任何一个或多个阶段的细胞活性将有助于至少减少转移。如以下更全面地解释的，通过以下许多实验，可确定药物对这些子阶段的每一个的影响，即：
(a) 测试药物对细胞粘附性的影响；
(b) 测试药物对细胞侧向运动性的影响；
(c) 测试药物对细胞横向迁移的影响；和
(d) 测试药物对细胞侵袭性，即细胞移动通过细胞所消耗的培养基的能力的影响。
以各种剂量水平给予式I化合物可增加细胞的粘附性和/或降低细胞的侧向运动性、横向迁移和侵袭性中的一种或多种。
因此，根据本发明的另一个方面，提供化合物、组合物或其他物质，其以适当的剂量用于或意图用于抑制或减少转移性癌细胞中VGSC电流的持续部分，同时使瞬态部分不受影响或仅部分减少，以抑制或减少转移，优选地不直接引起细胞死亡。
至少在某些方面或形式中，从本发明产生的优点包括以下内容：
根据本发明，可遏制乳腺癌、结肠癌和***癌(和如本文所述其中表达或可变得表达VGSC的其他癌症)，使得患者可以能够忍受这种癌症而没有严重损害。结果，可避免患者需要进行侵略性治疗以破坏癌细胞，比如通过化学疗法或放射疗法。如果患者怀疑患有乳腺癌、结肠癌或***癌或其他转移性癌症，可给予适当剂量的式I化合物的立即治疗以抑制或预防转移，同时等待决定性的检测结果。达到仅此目的所需的剂量必须足够高以抑制VGSC电流的持续部分。式I化合物的治疗上可接受的剂量将实现对这些电流的持续部分所需的抑制，同时使瞬态部分基本上不受影响。
参考图1，时间线101表示肿瘤发展中的3个连续阶段，即癌细胞发展之前的阶段102、阶段102后的阶段103 (在期间发生癌细胞发生)和阶段103后的阶段104 (在期间癌细胞增殖以形成生长的肿瘤)。增殖阶段104可在发生阶段103开始之后不久开始。
已经确定许多人癌细胞(比如乳腺癌、结肠癌和***癌细胞)可能最初不包括任何功能性VGSC，并且除非在肿瘤中表达这种通道，否则肿瘤细胞将不是侵袭性的。然而，在许多这种肿瘤中，尽管最初没有VGSC，但在某个点将表达功能性VGSC。这触发改变为肿瘤可能扩散的状态。图1表示一种情况，其中最初细胞不含有任何功能性VGSC，但在某个时间点105开始功能性VGSC的表达。这可在发生阶段103开始之后的任何时间发生。
图1中的时间线106说明在癌症变为转移性的时间105后出现的阶段。在时间105后的第一阶段107中，转移性细胞自身从肿瘤中脱离。之后，在阶段108中，它们侵袭并穿过同一器官中的周围组织朝向循环系统，特别是血管和/或淋巴系统移动。在阶段109中，转移性细胞进入循环系统，然后循环系统可将它们携带到体内的其他器官，在那里它们可能导致形成继发性肿瘤。
以上阶段在图2中以图示方式表示，其中参考编号200表示器官(比如***或***)的一部分。***或***的健康细胞201显示为支撑在基底膜202上并围绕癌性肿瘤203，其假定已经历发生阶段103并进入增殖阶段104。
癌性肿瘤202的某些细胞204显示为从肿瘤203脱离并穿过基底膜202的降解区域202a进入包含肿瘤203的器官的邻近区域205，所述区域可主要包含胶原纤维。已经变为从肿瘤脱离并已穿过基底膜202的癌细胞206显示朝向血管207穿过区域205。癌细胞208显示通过血管壁207迁移到血流209中。
已经进入血流的细胞210显示为在血流内携带到区域211，其中细胞212显示为已通过血管壁207朝向另一器官213 (比如淋巴腺或肝脏)向外迁移，其中它们可能形成继发性肿瘤(未显示)。
参考编号214表示静止的癌细胞，其简单地停留在血管壁207中或其附近。
如以下更全面地解释的，本发明提供用于预防或减少癌细胞的一种或多种发生在各个所述阶段的转移行为的疗法或手段。特别是，本发明提供用于以下的疗法或手段：
(a) 增加肿瘤中细胞的粘附性，使得它们不太可能脱离；和/或
(b) 降低已经变为脱离的细胞的运动性，因此它们不太可能移动并穿过基底膜进入周围组织；和/或
(c) 通过降低已进入周围组织的细胞穿过该组织朝向循环系统移动的能力来降低其侵袭性；和/或
(d) 降低细胞经循环系统的壁从该组织迁移到循环系统中的能力。
以上已经解释过，其中没有表达功能性VGSC的癌细胞没有侵袭行为。进一步地，已知电流以脉冲方式通过VGSC，每个脉冲包括瞬态或峰值部分，随后为水平低得多的持续或晚部分。根据本发明的一个方面，通过抑制或减少电流的持续部分同时不消除峰值部分来抑制或减少一种或多种以上转移行为，因此使得可使用优先减少电流的持续部分的药物。
已知一些这种药物用于治疗心脏病比如心律失常或心绞痛。在治疗心脏的情况下，确保不消除电流的峰值部分是至关重要的，因为这对于维持心脏功能及其节律是必需的。因此，根据本发明的一个方面，使用先前描述用于抑制或减少VGSC电流的持续部分而不消除峰值部分的已知药物(比如式I化合物)，以抑制或减少癌症(尤其是乳腺癌、结肠癌或***癌)中的转移行为。
VGSC电流的性质将参考图3(a)进一步描述。
参照图3(a)，曲线301，以实线显示，表示在常氧条件下流过功能性VGSC的电流脉冲，横轴为时间和纵轴为电流的幅度或强度。可以看出，该电流脉冲包括峰值或瞬态部分302以及持续或晚部分303。实际上，持续部分303持续的时间段远远大于瞬态部分302的时间段，但是由于图3(a)为示意性草图而不是从实验数据实际获得的曲线，这未在图中显示。
曲线304，以点划线绘制，显示在低氧条件下的VGSC电流脉冲。可以看出，在低氧条件下的电流的峰值部分305小于在常氧条件下的峰值部分301，但是在低氧条件下的持续部分306大于在常氧条件下的持续部分303。在低氧和常氧条件下这些曲线之间的差异是相关的，因为癌性肿瘤中的许多细胞由于其被其他癌细胞与血液循环系统部分隔离而低氧。
定义
“电压门控钠通道”或“VGSC”为已知的一类整合膜蛋白，其形成离子通道，通过细胞的质膜传导钠离子(Na+)。在人类，有9种基因(SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A和SCN11A)编码9种不同的VGSCα亚单位或“NaV”蛋白(分别为Nav1.1-Nav1.9)。除非上下文相矛盾，否则本文使用的该术语可指任何和所有已知的VGSC，包括(但不限于) Nav1.5 (SCN5A)(新生儿或成人形式)、Nav1.6 (SCN8A)和Nav1.7 (SCN9A)(Fraser et al., 2005; Djamgoz et al., 2011)。或者，Nav1.5在本文可称为NAV-1.5。
本文使用的癌症的“治疗”包括(但不限于)减少癌症的转移行为、预防癌症的转移行为、减少疼痛感或其任何组合。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”意指式I化合物的量或剂量，当给予患有癌症的患者时对患者的治疗产生积极的治疗反应，比如减少癌症的转移行为、预防癌症的转移行为、减少疼痛等。
“减少癌症的转移行为”旨在减少与脱离的癌细胞通过循环(血液或淋巴)移动以在其他器官中累积和/或产生继发性肿瘤或局部侵袭周围组织相关的任何行为。一般地，患者处于3、4或5期，比如4或5期。减少转移行为可例如包括以下的一种或多种：与对照相比较，(i) 降低癌细胞运动性(例如降低侧向运动性)，(ii) 减少癌细胞迁移(例如横向迁移)，(iii) 降低癌细胞粘附性，(iv) 降低癌细胞侵袭性，(v) 减少VGSC电流的持续部分而不消除瞬态部分，和(vi) 减少癌细胞上至少一种VGSC的表达。例如，VGSC可为Nav1.5 (成人和/或新生儿形式)、Nav1.6和Nav1.7中的一种或多种。如本文其他地方解释的，“运动性”反映肿瘤细胞最初移动至并穿过基底膜进入周围组织的能力；细胞的“侵袭性”反映已进入周围组织的肿瘤细胞穿过该组织朝向循环系统移动的能力；和“迁移”反映肿瘤细胞经循环系统壁从该组织迁移到循环系统中的能力。
“预防癌症的转移行为”旨在提及对处于患有转移性疾病的风险下但尚未诊断患有转移性疾病的癌症患者的预防性治疗，以便预防或降低如上所述的癌症转移行为的风险。一般地，患者处于1、2或3期。预防转移行为可例如包括预防或减少至少一种VGSC，比如Nav1.5 (成人和/或新生儿形式)、Nav1.6和Nav1.7中的一种或多种的表达。
血液癌症不像实体肿瘤癌症那样的方式形成转移，但通过转移行为来表征，因为血液癌细胞可侵袭并积聚在其他器官中。因此，在本公开中，关于“预防转移行为”或“减少转移行为”的任何实施方案，特别是在血液癌症的情况下，可备选地表示为“预防侵袭行为”和“预防侵袭行为”。
发明的具体实施方案
如本实施例2所示，基于乳腺癌细胞测试的式I化合物(eleclazine)对细胞活力没有影响(20 μM)，对细胞的增殖活性没有影响(10 μM)，在低氧但非常氧条件下降低侧向运动性，在临床相关浓度(<10 μM，浓度依赖性)下显著抑制Matrigel侵袭性，至少在一些浓度下似乎比参考化合物更加有效(5 μM)，和在常氧和低氧条件两种下降低新生儿Nav1.5蛋白的表达(10 μM)。进一步地，如实施例3所示，式I化合物(Eleclazine)具有eleclazine和雷诺嗪对人白血病细胞系的抗侵袭作用。
化合物
本发明涉及式I化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为三氟甲基或三氟甲氧基，其用于特别通过减少癌症的转移行为、预防癌症的转移行为和减少癌症中的疼痛感，在患有癌症的患者中治疗癌症的方法。
在一些实施方案中，R1为三氟甲基和化合物为4-(嘧啶-2-基甲基)-7-(4-(三氟甲氧基)苯基)-3,4-二氢苯并[f][1,4]氧氮杂
在单独和具体的实施方案中，优选地在治疗有效浓度，即化合物减少癌细胞的一种或多种转移行为的浓度下，化合物对癌细胞没有细胞毒性、基本上不影响癌细胞的增殖和/或具有至少减少电压门控钠通道电流的持续部分而不消除瞬态部分的作用。也就是说，除了通过经VGSC机制引起的组织降解抑制其生长和扩展到周围组织以外，癌细胞本身不受影响。增殖本身基本上不受影响。
式I (比如Ia和Ib)化合物的合适的盐描述于US 2017/007617 A1中。特别是，这种盐包括对给予患者是安全的并且保持化合物的生物有效性和性质的药学上可接受的盐。药学上可接受的碱加成盐可由无机和有机碱制备。仅举例来说，衍生自无机碱的盐包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括(但不限于)伯、仲和叔胺的盐。仅举例来说，合适的胺的具体实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。
药学上可接受的酸加成盐可由无机和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
根据本发明的一个实施方案，式I化合物对一种或多种VGSC具有选择性，比如对NAV-1.1至1.9的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部具有选择性。在一些实施方案中，式I化合物对至少NAV-1.5、NAV-1.6和NAV-1.7具有选择性。在本发明的一个实施方案中，式I化合物对nNAV-1.5的选择性高于成人NAV-1.5。
治疗应用
合适的患者包括患有癌症的哺乳动物患者，比如人、猴、兔、狗、猫、牛、马、猪、小鼠和大鼠。优选地，患者为人类患者，比如成年人类患者。一般地，这种成年人类患者可具有约50-约150 kg范围，比如约60-约100 kg，比如约70 kg的体重。
一般地，选择用于本发明的治疗的癌症为表达VGSC的癌症或与已知的VGSC表达风险相关并从而与转移行为相关的癌症。
在一些实施方案中，癌症为血液癌症，比如白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症为实体肿瘤癌症，比如癌、间皮瘤、肉瘤或黑素瘤。在特定实施方案中，实体肿瘤癌症为乳腺癌、结肠癌、***癌、肺癌(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、胸膜癌(例如间皮瘤)、***、卵巢癌、胃癌或神经母细胞瘤。在一个具体实施方案中，癌症为白血病。在另一具体实施方案中，癌症为乳腺癌。
以下表1显示在一些特定癌症形式与其VGSC表达之间发现的联系。
表1
癌
VGSC亚型
乳腺癌
Nav1.5
结肠癌
Nav1.5
***癌
Nav1.7和/或Nav1.6
NSCLC
Nav1.7
***
Nav1.6
胃癌
Nav1.7
卵巢癌
Nav1.5
神经母细胞瘤
Nav1.5
星形细胞瘤
Nav1.5
白血病
Nav (亚型未确定)
黑素瘤
Nav (亚型未确定)
在一些实施方案中，患者患有表达VGSC的癌症。表达VGSC的癌症可例如，使用对一种或多种VGSC特异性的可检测的单克隆或多克隆抗体以检测癌细胞上VGSC的表达，通过从患者获得的含有癌细胞的样品(比如肿瘤活组织检查或血液样品)的免疫组织化学或分析来鉴定。
表达VGSC的癌症可以成人或新生儿形式表达Nav1.1-Nav1.9中的任何一种或多种。在一个实施方案中，癌症以成人和/或新生儿形式表达Nav1.5、Nav1.6和Nav1.7中的至少一种。在一个具体实施方案中，癌症以成人和/或新生儿形式表达Nav1.5，比如新生儿Nav1.5。在另一个具体实施方案中，癌症以成人或新生儿形式(比如新生儿形式)表达Nav1.6。在另一个实施方案中，癌症以成人或新生儿形式(比如新生儿形式)表达Nav1.7。
如上所述，表达VGSC的癌症处于3、4或5期。
在一个实施方案中，患者处于3、4或5期，比如处于4或5期。在一个实施方案中，癌症处于1、2或3期，比如处于1或2期。
在一个实施方案中，癌症处于3期。患有3期癌症的患者一般地未被诊断患有转移性疾病，但是处于癌症转移行为的风险下，即发展至4或5期。因此，可根据本发明治疗患有3期癌症的患者以预防癌症的转移行为。
在一个实施方案中，癌症处于4期。患有4期癌症的患者可能尚未诊断患有转移性疾病，但癌症已经朝向转移行为发展。因此，可根据本发明治疗患有4期癌症的患者以减少癌症的转移行为。
在一个实施方案中，癌症处于5期。患有5期癌症的患者可能已被诊断患有转移性疾病，并且癌症的特征为转移行为。因此，可根据本发明治疗患有5期癌症的患者以减少癌症的转移行为。
在一些实施方案中，患者可能患有与VGSC表达和/或转移行为的风险相关的癌症，但尚未确定VGSC表达和/或转移行为。易于发生转移行为的癌症包括例如白血病、乳腺癌、结肠癌、***癌、肺癌(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、胸膜癌(例如间皮瘤)、***和卵巢癌(Roger et al., 2015)。例如，含有癌细胞的样品(比如从患者获得的肿瘤活组织检查或血液样品)的免疫组织化学分析可能表明样品中的肿瘤细胞不表达测试的一种或多种VGSC。因此，癌症可能处于1期或(更可能)处于2期。
在一个实施方案中，癌症处于2期。患有2期癌症的患者一般地未被诊断患有转移性疾病，但是处于癌症的VGSC表达和转移行为的风险下，即发展至3、4或更高期。因此，可根据本发明治疗患有2期癌症的患者以预防癌症的VGSC表达或转移行为。
患有1-5期的任何一个，优选地2-5期的任何一个的癌症的患者也可能患有由癌症(例如由原发性肿瘤)引起的疼痛，并且因此可根据本发明进行治疗以减少疼痛感。
在一个实施方案中，当用于本发明的方法中时，化合物减少或预防表达VGSC的癌症中的转移行为而不杀死癌细胞。
在一个实施方案中，当用于本发明的方法中时，化合物减少或预防表达VGSC的癌症中的转移行为而基本上不影响癌细胞的增殖。
在一个实施方案中，当用于本发明的方法中时，化合物通过至少减少VGSC电流的持续部分而不消除瞬态部分的作用来减少或预防表达VGSC的癌症中的转移行为。用于评估化合物对VGSC电流的影响的合适测定为本领域已知的(参见例如Rajamani et al.,2016)。
在其他单独和具体的实施方案中，化合物通过以下减少或预防转移行为：
(a) 降低癌细胞的侵袭性；
(b) 任选地在低氧但非常氧条件下，降低癌细胞的运动性；
(c) 任选地在常氧和低氧两种条件下，降低至少一种VGSC的癌细胞表达；
(d) 增加癌细胞的粘附性；
(e) 降低癌细胞的迁移能力；或
(f) (a)和(b)、(b)和(c)、(a)和(c)、(a)-(c)或(a)-(e)的组合。
在一个实施法案中，至少一种VGSC包含Nav1.5、Nav1.6和Nav1.7中的一种、两种或全部。在一个实施方案中，至少一种VGSC包含新生儿Nav1.5或由其组成。
在一个实施方案中，用化合物处理癌细胞导致至少一种VGSC的癌细胞表达显著低于对照(比如预定的对照值)、未暴露于化合物的癌细胞或暴露于参考化合物的癌细胞。在一个实施方案中，用化合物处理癌细胞导致用化合物处理的癌细胞的侵袭性、运动性和/或迁移能力显著低于对照(比如预定的对照值)、未暴露于化合物的癌细胞或暴露于所选参考化合物的癌细胞。
用于评估(a)-(d)的测定为本领域已知的并且在下文和实施例中得以描述。
给予方式
化合物可通过任何合适的途径给予患者，包括(但不限于)口服、含服、唇下、舌下、直肠、静脉内、皮下、皮内、肌内、透皮和鼻内给予和/或直接给予肿瘤，比如原发性肿瘤。优选地，化合物口服给予，例如作为片剂或胶囊剂。在一些情况下，可配制或包覆片剂或胶囊剂，使得化合物直至其到达期望的目的地(例如胃)才释放。
也可使用持续释放系统，特别是为了经延长的时间段释放化合物。
根据本领域熟知的方法，化合物一般地与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起配制。例如，US 2017/0007617 A1描述了用于静脉内给予的式I化合物的合适制剂。
剂量方案
为了预期目的，将化合物以治疗有效量并且用由受过训练的医师确定的频率和时间段给予患者。
在一个实施方案中，治疗有效剂量为导致化合物的血浆浓度(优选地稳态)为约0.01 μM-约10 μM的剂量。因此，在一些实施方案中，给予化合物以实现约0.01 μM-约10 μM(比如约1 μM或5 μM)的稳态血浆浓度。
在一个实施方案中，化合物以约1 mg-约30 mg，比如1-约15 mg，比如约1-10 mg，比如约1 mg-约5 mg，比如约2 mg-约4 mg的剂量给予患者，比如成年人类患者。在另一个实施方案中，化合物以约5-约15 mg，比如约10 mg-约15 mg，比如约12-约14 mg的剂量给予患者，比如成年人类患者。在另一个实施方案中，化合物以约8 mg-约13 mg的剂量给予患者，比如成年人类患者。
在一个实施方案中，化合物以约1 mg、3 mg、约6 mg、约9 mg、约12 mg、约15 mg、约18 mg、约21 mg、约24 mg、约27 mg或约30 mg的剂量给予患者，比如成年人类患者。
在一个实施方案中，化合物每天一次、每两天一次、每三天一次、每五天一次、每周一次、每两周一次或每月一次，比如每天一次给予。优选地，化合物每天一次，优选地口服(经口(p.o))给予，用于维持治疗。
在一个实施方案中，化合物作为维持治疗给予至少4周，比如至少8周，比如至少12周，比如至少24周，比如至少48周或者更长时间段。
在一个实施方案中，在维持治疗开始之前，例如之前一或两天，给予患者(比如成年人类患者)约10 mg-约100 mg，比如约20 mg-约80 mg，比如约30 mg-约70 mg，比如约40mg-约60 mg，比如约30 mg、约50 mg、约80 mg、约90 mg或约95 mg的一次性初始加强剂量的化合物。
不受理论的限制，根据目前对于eleclazine药代动力学的了解，在约95 mg的初始加强剂量后并且在成年人类患者(假定体重约70 kg和分布体积约42升)中提供约5 μM的期望浓度的根据本发明使用例如式Ia化合物(eleclazine, 451,83 g/mol; PubChem CID:71183216)的维持治疗的每日剂量可估计如下：
eleclazine半衰期(天)
2.5
5
10
15
保持浓度的每日剂量(mg)
19
9.5
4.7
3.2
因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约10 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约1 mg-约20 mg，比如约1-约15 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约20-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约3 mg-约20 mg，比如约3 mg、约4 mg、约5 mg、约6 mg、约7 mg、约8 mg、约9 mg、约10 mg、约12 mg、约15 mg、约19 mg或约20 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80 mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约20-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约3 mg-约10 mg，比如约3 mg、约5 mg、约6 mg、约9 mg或约10 m的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80 mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约3 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约5 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约6 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约9 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约10 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80 mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约19 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80 mg和约95 mg。
在一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg-约100 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约20 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。在单独和具体的实施方案中，初始负荷剂量为约30 mg、约50 mg、约80 mg和约95 mg。
在另一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约30 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约3 mg或约6 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。
在另一个特定实施方案中，根据本发明使用的化合物首先作为约48 mg的一次性初始加强(或负荷)剂量口服(p.o.)给予，随后口服给予约3 mg或约6 mg的剂量，每天一次，持续至少4周的时间段。
在一个实施方案中，根据本发明使用的化合物以相当于1 μmol-10 μmol范围的剂量水平给予，其相当于约0.45 mg-约4.5 mg的式Ia化合物。
测定
以下为用于评估本发明的化合物对癌细胞的转移行为或其他性质的影响的测定的非限制性实例。
单细胞粘附测定
图4为Palmer et al. (2008)在论文中首次描述的单细胞粘附测量装置(SCAMA)的示意图。
将来自MDA-MB-231细胞系的人乳腺癌细胞以2.5 x 104个细胞/ml的密度铺展，并在测量之前于细胞培养皿401中静置48小时。去除培养基，并加入2 ml所研究的药物10分钟。使用经塑料管连接到真空泵403的玻璃微量移液管402测量粘附。将微量移液管的尖端拉至约20 μm (范围，17-24 μm)的尖端直径。使用真空泵在贮存器405内产生负压，使得通过将拇指按压到可密封的T型管406的开口端，可将负压施加到微量移液管的尖端。在灯408的照射下使用20x显微镜物镜407观察细胞。使用经RS232电缆411连接到计算机410的数字压力计测量压力。
使用显微操纵器412，将微量移液管402定位在单个细胞的周围。在关闭T型管406时，将负压施加到所研究的细胞上，并且在观察到细胞从培养皿401脱离的确切时刻，通过打开T型管406释放压力。脱离细胞所需的负压作为压力尖峰记录在计算机上。尖峰的峰值(“脱离负压”(DNP))用作细胞粘附性的量度。使用这种技术，可在数分钟内从单个培养皿制作几个记录。
为了模拟细胞的低氧条件，在测试之前最后24小时通过加入过氧化氢(1-500 μM)化学诱导低氧。
为了测试给定作用的可逆性，洗去药物，加入新鲜培养基并将板再温育10分钟，之后重新测量。每个处理在至少两个培养皿的细胞上进行，每个培养皿测量至少100个细胞，并且实验重复3次(使用相应的对照)。
侧向运动性测定
该测定用于表示局部扩散期间癌细胞的“自由”运动性。图5(a)为在其表面上具有半汇合细胞层502的细胞培养皿501的俯视平面图，细胞处于水性培养基503中。
为了确定侧向运动性，进行“创口愈合(“刮痕”)”测试，其中通过细胞层制备-0.5mm的刮痕504，如图5(b)所示，这是细胞培养皿的侧剖视图。在刮痕形成后的24小时期间，细胞移动到间隙中。
图5(c)和5(d)分别为当刮痕504的宽度为w0时的时间t = 0时和当刮痕504的宽度为w24时的时间t = 24小时时细胞培养皿501的示意性平面图。
横向迁移测定
该测定用于表示细胞在其内/外渗透时迁移的能力。图6显示具有Transwell®***件602的迁移室601的示意性侧剖视图，***件将室分成两个部分，为方便起见，将其称为室的上部603和下部604。***件602在其底部具有迁移滤膜605，后者具有穿过其延伸的8 μm孔606。
将细胞607以2 x 104/ml的密度铺展在滤膜605上，并置于含有1%胎牛血清(FBS)的生长培养基608下。通过将含有10% FBS的生长培养基609置于室的下部604中，跨滤膜605产生趋化梯度。
使细胞经24小时的时间段跨滤膜605迁移，细胞迁移并粘附在滤膜605的下侧。在每次测定结束时，用两个不同的拭子从***件602的上表面去除未迁移的细胞。
使用结晶紫染色测定迁移到***件602下侧的细胞数目。用冰冷的甲醇将迁移的细胞固定15分钟。然后加入0.5%结晶紫(在25%甲醇中) 15分钟。再次擦拭***件，并然后在水中洗涤并使得干燥。然后使用每个***件12个单独的视野计数细胞(x200放大倍数)。
侵袭测定
该测定为上述横向迁移测定的延伸。为了“侵袭”，细胞需要以下两者：(i) 如在横向迁移测定中那样移动，和(ii) 分泌蛋白水解酶来消化其周围环境。因此，通过使用跨Transwell®***件的多孔膜散布的一层Matrigel™ (BD Biosciences)评价细胞通过酶分泌侵袭邻近组织的能力。Matrigel™由层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白/enactin和蛋白聚糖组成 - 一种与基底膜蛋白相当的组成。
图7为侵袭室701的示意性侧剖视图，侵袭室701具有将室分隔成上部703和下部704的Transwell®***件702。***件702在其底部具有迁移滤膜705，后者具有穿过其延伸的8 μm孔706。显示Matrigel™层707包被滤膜705。
根据制造商的说明，将细胞708以2 x 104/ml的密度铺展到24孔板(Becton-Dickinson)中的Matrigel™层707上。将50 μl Matrigel™以1:7稀释度(10 mg/ml储备液)接种到***件上并放置过夜。在用细胞接种之前，使用不添加的培养基将Matrigel™再水合。在接种细胞之前去除该培养基。
将细胞在1-5% FBS趋化梯度中铺展过夜(12小时)。室的上部703中的培养基709中的营养物浓度小于下部704中的培养基710中的营养物浓度，以诱导细胞通过Matrigel™层707和通过孔706移动到滤膜705的下侧。在每次测定结束时，用两个不同的拭子从***件702的上表面去除未侵袭/未迁移的细胞。
使用结晶紫染色测定侵袭***件702下侧的细胞数目。用冰冷的甲醇将侵袭的细胞固定15分钟。然后加入0.5%结晶紫(在25%甲醇中) 15分钟。再次擦拭***件，并然后在水中洗涤并使得干燥。然后使用每个***件12个单独的视野计数细胞(x200放大倍数)。如果侵袭两个对照***件的平均细胞数的差异超过40%，则放弃实验。
细胞活力测定
将细胞以5 x 104个细胞/ml的密度接种在35 mm Falcon组织培养皿中。在用给定药物处理之后，去除培养基并用800 μl生长培养基和200 μl 0.4%台盼蓝(Sigma, Dorset, UK)更换，且在温育箱中温育10分钟。去除台盼蓝，并用3 ml生长培养基洗涤细胞一次。对于每次处理，在100 x放大倍数下计数来自30个随机视野的细胞。在每个视野中计数染成蓝色的死细胞数目。数据表示为给定视野中的总细胞数中活细胞的百分比。将百分比平均，并且从至少3次独立实验比较对照和处理之间的差异。
细胞生长(增殖)测定
将细胞以2 x 104个细胞/ml铺展在24孔板(Becton-Dickinson)中并使得静置过夜。然后将细胞处理所需的温育时间(24小时+)，每24小时更换培养基。在处理结束时，去除培养基，并随后进行比色3- [4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测定(Grimes et al., 1995)。简而言之，在每孔中加入0.1 ml MTT (在生长培养基中制备5mg/ml)和0.4 ml生长培养基，并将板在37℃下温育3-4小时。然后将培养基从室中去除并用0.5 ml二甲基亚砜(DMSO)和0.063 ml甘氨酸缓冲液(0.1 M甘氨酸和0.1 M NaCl，pH 10.5)更换。在加入甘氨酸缓冲液之后15分钟测定570 nm处的吸光度。结果计算为来自单个侵袭孔的每个处理相对于对照分光光度计读数的9次重复的平均值。
组织培养
对以下4种强转移性细胞系进行实验：
(i) 人转移性乳腺癌MDA-MB-231，
(ii) 人转移性结肠癌SW620细胞，
(iii) 人白血病FLG29.1细胞，和
(iv) 大鼠强转移性***癌Mat-LyLu。
使用已知方法培养细胞(例如Grimes et al., 1995; Fraser et al., 2005)。
常氧和低氧条件
除了单细胞粘附测试(在以下段落中讨论)之外，实验在以下任一条件下进行：
(i) 正常常氧条件(95%氧气，5%二氧化碳)，或
(ii) 24小时后，在测定期间继续进行低氧预处理(2% O2，5% CO2，93% N2)。
在单细胞粘附实验中，通过加入过氧化氢(1-500 μM) 24小时化学诱导低氧。
实施例
实施例1 - 化学低氧对MDA-MB-231细胞的单细胞粘附的影响
通过用不同浓度的过氧化氢处理细胞24小时诱导化学低氧。使用上述并如图4所示的技术测量单细胞粘附。脱离负压的变化(ADNP)表示为相对于对照未处理细胞群的百分比。低氧减少细胞粘附，和增加过氧化氢浓度，即增加低氧程度，导致细胞粘附减少更多，如图8所示。在该图中，纵轴表示脱离负压的变化(ADNP)，其向下增加，使得较高的负值表示细胞的较少粘附，并因此表示其脱离倾向。横轴为过氧化氢浓度的对数标度，从左到右增加。
将来自MDA-MB-231细胞系的人乳腺癌细胞以2.5 x 104个细胞/ml的密度铺展在细胞培养皿中，并在测量之前静置48小时。使细胞经受1 μM、10 μM和100 μM的过氧化氢浓度，并测量从细胞培养皿的底部脱离细胞所需的负压。在每种浓度的过氧化氢下，对至少两个培养皿的细胞进行测量，每个培养皿至少100个细胞。实验重复3次，并且脱离负压的测量在图8中显示为平均值±SEM。
在图8中，显示暴露于浓度为1 μM的过氧化氢的细胞具有约-9%的平均脱离负压，暴露于浓度为10 μM的过氧化氢的细胞具有约- 14%的平均脱离负压，和暴露于浓度为100μM的过氧化氢的细胞具有约-20%的平均脱离负压。因此，增加过氧化氢的浓度降低了细胞的粘附并使它们更易于脱离。换句话说，增加低氧条件的严重性导致细胞的可脱离性增加。
实施例2 - eleclazine对高转移性乳腺癌细胞系的影响
该实施例描述使用高侵袭性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，eleclazine对细胞活力、增殖、运动性、侵袭性、nNAV-1.5表达以及瞬态和持续钠电流的影响。
材料与方法
组织培养与处理：
使用含有4 mmol/L L-谷氨酰胺和5%胎牛血清的杜贝克最低必需培养基(Dulbecco’sMinimum Essential Medium)(DMEM) (从现在开始称为培养基)，将MDA-MB-231人乳腺癌细胞接种于100 x 20 mm培养皿(Thermo Fisher Scientific)中。
MDA-MB-231细胞由于其源自人乳腺癌而天然附着于组织培养皿。给予3 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA (Sigma Aldrich) 15分钟以溶解贴壁细胞，随后以1700 rpm离心2分钟。将沉淀重悬于培养基中，并使用血细胞计数器测定细胞数目。每2-3天更新培养基并将储备细胞保持在37℃的常氧条件下。
将eleclazine溶解于DMSO中，并在-20℃下以10 mM的浓度储存。为了处理MDA-MB-231细胞，将药物在乳腺培养基中稀释以达到10或20 μM的浓度。通过向培养基中加入相同体积的99.9% DMSO来制备标准阴性对照。
细胞活力测定：
使用台盼蓝测定确定细胞活力并因此确定药物毒性。程序遵循以下原则：由完整双膜包围的活细胞不能吸收台盼蓝染料，而死亡和碎片化细胞则可以。最初含有3 x 104个细胞的35x10 mm培养皿用20 μM eleclazine或0.4% DMSO预处理48小时。
随后用0.2 ml 0.4%台盼蓝(Sigma-Aldrich)和0.8 ml培养基更换溶液。10分钟之后，吸出台盼蓝混合物并用培养基更换。通过计数每个培养皿上30个视野中的活细胞和死细胞的比例来确定细胞活力(Zeiss Axiovert 25相差显微镜，x40放大倍数)。
增殖测定：
使用MTT (3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓)间接测量增殖。原则上，MTT被代谢活性细胞摄取和处理，其产生作为副产物的甲臜。甲臜为一种紫色染料，可在分光光度计上量化，提供吸光度读数(570 nm)和细胞数目之间的联系。
将细胞以每孔2 x 104个细胞的密度铺展于24孔板中，并在低氧和常氧下用1 ml相应的药物溶液(参见图5)预处理48小时。给予每孔在0.4 ml培养基中稀释的0.1 ml MTT(1 mg/ml)，随后在黑暗、常氧条件下温育4小时(MTT对光敏感)。随后吸出溶液并加入0.5ml 99.9% DMSO与75 μL甘氨酸缓冲液的组合。染料能够在15分钟期间溶解于DMSO中-在振荡平台上以150转/分钟进行温育。使用ELX800 Universal Microplate Reader (BioTekInstruments)读取吸光度，背景测量为0.04。将3个技术重复(每个具有4个生物学重复)的数据标准化，并使用SPSS进行统计学分析。
侧向运动性测定：
将106个细胞铺展于每个35x10 mm培养皿中并保持在常氧条件下静置过夜。每个培养皿用15条平行纵线和3条非重叠横线标记。更新培养基并使用1 ml Gilson移液管尖端沿着标记的纵线制作3个创口。通过3次连续培养基洗涤去除漂浮的细胞，并用1 ml相应的药物溶液(10 μM eleclazine/DMSO)处理贴壁细胞。使用相差显微镜(x10放大倍数)上的网格在45个固定点(其中纵线穿过创口)测量初始创口宽度(W0)。然后将细胞在常氧和低氧两种条件下温育，每24小时更换药物溶液。每12小时测量创口宽度，并使用“运动指数”(MI = 1-(Wt/W0))分析该乳腺癌细胞系的运动性。运动指数1说明完全创口闭合，而MI = 0表示零细胞移动。对于4种条件(常氧和低氧中的eleclazine和DMSO)中的每一种，进行5个技术重复(每个包括3次生物学重复)。使用SPSS Statistics完成数据分析。
Matrigel侵袭测定：
细胞在低氧条件下用10 μM eleclazine或0.2% DMSO预处理24小时。将具有8 μm孔的Transwell滤器***24孔板中，并用在50 μL无FBS培养基中稀释的62.6 μg Matrigel包被。Matrigel在37℃常氧下固化过夜，并使用0.5 ml无FBS培养基在37℃常氧下水合3小时。将含有5% FBS的300 μL培养基给予下室，并将含有1% FBS的相同量的培养基加入到上室(transwell滤器)。将2 x 104个细胞加入到1%溶液中，使其沿着趋化梯度通过Matrigel侵袭。使细胞静置并在低氧条件下侵袭过夜。
第二天，吸出两个室中的培养基，并用棉拭子去除未侵袭的细胞。给予下室100%冰冷的甲醇以固定侵袭的细胞，随后用300 μL结晶紫(0.5 g/ml，在25%甲醇中稀释)染色15分钟。将transwell滤器在蒸馏水中洗涤并在室温下干燥数小时。
免疫细胞化学：
细胞在常氧和低氧两种条件下用10 μM eleclazine或DMSO预处理24小时。第二天，将圆形13 mm盖玻片置于24孔板中并与0.5 ml聚-L-赖氨酸一起温育20分钟。吸出溶液并在每个盖玻片上加入2x104个预处理的细胞。用相应的药物溶液将孔填充至0.5 ml，并使细胞在常氧和低氧条件下静置到盖玻片上过夜。
用PBS洗涤细胞，并通过使盖玻片与0.5 ml 4% PFA (在PBS中)一起温育15分钟来固定。然后将盖玻片在PBS中进行3次5分钟洗涤。将一半样品在0.1%皂苷/PBS中透化(4分钟)，随后在PBS中洗涤3次5分钟。用0.5 ml 5% BSA/PBS (pH 7.4)将细胞封闭1小时。将盖玻片与70 μL NESOpAb (对新生儿Nav1.5特异性的一抗，1:100稀释)一起在潮湿室(室温)中温育1小时。3次5分钟PBS洗涤冲洗掉残留的NESOpAb，并且在黑暗中给予二抗(山羊抗兔IgG Alexa Fluor 568，1:100稀释) 1小时。使用含有0.1% BSA的PBS进行3次5分钟洗涤，并使用Dako荧光封固剂固定盖玻片。
在Zeiss axiovert 200倒置显微镜上进行成像。相差图像以jpeg格式拍摄，荧光图像以原始格式保存。使用ImageJ量化校正的总细胞荧光。
结果
• 20 μM的eleclazine对MDA-MB-231细胞活力没有影响。
• 在MTT测定期间，10 μM eleclazine和10 μM雷诺嗪不影响细胞增殖。
• 10 μM eleclazine降低高转移性乳腺癌细胞在低氧但非常氧条件下的侧向运动性。该作用从12小时之后减少5%发展至48小时之后减少30%。
• 5 μM eleclazine使侵袭性降低约50%，并且比雷诺嗪更加有效。
• 免疫细胞化学表明，10 μM eleclazine在常氧和低氧两种条件下均降低nNaV1.5的表达。与低氧相比较，nNaV1.5在常氧下似乎表达更高。
eleclazine对MDA-MB-231细胞为非毒性：
对每种处理条件270个视野的分析表明，与0.2% DMSO相比较，20 μM eleclazine对细胞活力没有显著影响(图9)。DMSO和eleclazine两者的每个视野的活细胞的平均比例为99.96%。活细胞的最小比例为93%。考虑到这些结果和膜片钳数据(未显示)，选择10 μM作为进行的浓度(知道结果不会因细胞死亡而混淆，并且持续电流被有效阻滞)。
无论是eleclazine还是雷诺嗪都不会影响增殖：
由于增殖为癌细胞的基本特征，确定作为潜在抗癌药物的eleclazine是否影响这一过程是有意义的。图10A所示的校准曲线显示，在每孔中铺展的细胞数目与在570 nm处测量的吸光度线性相关。
来自MTT测定的数据为非参数的，并因此使用Mann-Whitney U检验(95%置信区间)进行分析。如图10B所示，10 μM eleclazine与任一阴性对照(0.2% DMSO，10 μM MTX，培养基)之间没有统计学显著差异。类似地，与阴性对照和eleclazine相比较，10 μM雷诺嗪没有显著影响。2 mM TEA (阳性对照)使细胞增殖减少约50%。对于所有处理，低氧对细胞增殖具有小的抑制作用。总之，eleclazine不影响三阴性乳腺癌细胞的增殖。
eleclazine对侧向运动性的影响：
运动指数(MI)用于描述MDA-MB-231细胞体外移动的速率。与常氧相比较，这种速率在低氧时更高。所有时间点的这两个实验条件之间的差异具有统计学意义(95%置信区间)，但低氧对运动性的影响并未随着时间的推移而增加。
eleclazine仅降低在低氧而非常氧条件期间的侧向运动速率(图11)。这种对细胞运动性的影响随着时间的推移而增加。从12小时之后MI升高5%开始，在用10 μM elalazine温育48小时之后，细胞运动减少30%。
总之，10 μM eleclazine有效地降低了MDA-MB-231细胞在低氧条件下的运动性。
eleclazine对侵袭性的影响：
侵袭性被量化为通过matrigel迁移的每个视野的细胞数目。初步分析表明，10 μMeleclazine显著降低了MDA-MB-231细胞在低氧条件下的侵袭性。因此，以下实验检查了较低浓度的影响。有关0.5 μM eleclazine和20 μM河豚毒素(TTX)对MDA MB-231细胞在低氧下的侵袭的结果参见图12。在低至1 μM的浓度下，eleclazine和雷诺嗪两者均降低侵袭性，但两种VGSC阻滞剂之间没有统计学显著差异(图13)。如图14所示，5 μM elalazine使MDA-MB-231细胞的侵袭性降低约50%，并且比5 μM雷诺嗪显著更加有效。
eleclazine降低nNav1.5蛋白表达：
使用以下免疫细胞化学参数量化eleclazine对MDA-MB-231细胞中新生儿NaV1.5蛋白表达的影响：校正的总细胞荧光(CTCF)。如图15所示，用10 μM elalazine处理24小时引起统计学显著的降低。这表明eleclazine阻断nNav1.5的活性和表达两者。
实施例3 - elalazine对人白血病细胞系的侵袭性的影响
该实施例描述elaclazine和雷诺嗪对人白血病细胞系(FLG29.1)的抗侵袭作用。将FLG29.1细胞在补充有10%胎牛血清的RPMI培养基中进行培养，并在37℃和5% CO2下进行温育。对于低氧，使细胞预暴露于1%氧气24小时。在侵袭测定中，将细胞铺展在Matrigel (1:7稀释)上，并用elaclazine、雷诺嗪(每种5 μM)或TTX (0.1或10 μM)处理(无预处理)。使细胞通过具有8 μm孔的transwell滤器侵袭18小时。第二天，吸出两个室中的培养基，并用棉拭子去除未侵袭的细胞。给予下室100%冰冷的甲醇以固定侵袭的细胞，随后用300 μL结晶紫(0.5 g/ml，在25%甲醇中稀释)染色15分钟。将transwell滤器在蒸馏水中洗涤并在室温下干燥数小时。在随机选择的视野中，在显微镜下计数侵袭的细胞。数据表示为侵袭细胞的百分比。
所有试剂(TTX用作阳性对照)显著抑制侵袭性，如图16所示。
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