阅读说明：本技术 检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C＞T的引物和方法 (Primer and method for detecting mutation site c.1235C & gtT of No. 14 exon of FANCA gene ) 是由 刘赵玲 裘振亚 王淑一 于 2019-10-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C＞T的引物和方法。本发明公开了基于Sanger测序法检测人类FANCA基因突变的引物和应用,属于基因检测技术领域,本发明所述FANCA基因突变包含14号外显子；检测14号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示,检测14号外显子突变的测序引物如SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4所示。本发明的引物适合Sanger测序法,使用Sanger测序操作简单,价格低廉且能灵敏地检测人类FANCA基因突变。(The invention relates to a primer and a method for detecting a mutation site c.1235C & gtT of No. 14 exon of a FANCA gene. The invention discloses a primer for detecting human FANCA gene mutation based on a Sanger sequencing method and application, belonging to the technical field of gene detection, wherein the FANCA gene mutation comprises a No. 14 exon; the nucleotide sequence of the amplification primer for detecting the mutation of the No. 14 exon is shown as SEQ.ID NO.1 and SEQ.ID NO.2, and the sequencing primer for detecting the mutation of the No. 14 exon is shown as SEQ.ID NO.3 and SEQ.ID NO. 4. The primer is suitable for a Sanger sequencing method, and the Sanger sequencing method is simple in operation, low in price and capable of sensitively detecting the human FANCA gene mutation.)

检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C＞T的引物和 方法

技术领域

本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测FANCA基因第14号外显子 突变位点c.1235C>T的引物和检测方法。

背景技术

范可尼贫血(FA)是一种罕见的常染色体或x染色体连锁的隐性遗传病，临床 表现为进行性加重的造血功能衰竭、先天性畸形及高风险进展为急性髓系白血 病，约50％的患者呈原发***。具不完全资料统计，本病在亚洲及世界一般人 群中的发病率为1/160 000。但由于奠基者效应及近亲婚配的原因在某些人群中 高发，比如在南非、西班牙、德系犹太人人群当中可高达1/20000或更高。在正 常人群中范可尼贫血的突变基因携带者频率为1/300。然而在本病高发人群与地 区其突变基因携带者频率可高达1/90。

FA的发生源于FA基因突变。FA基因是一组在DNA交联损伤中起同源重 组修复(HRR)作用的基因，其常见的突变类型包括FANCA、FANCC和FANCG。 其中FANCA基因亚型最为常见，它的基因被定位在染色体的第16号的长臂 (q24.3)，有43个外显子。蛋白由1445个氨基酸组成，分子量为163kDa。FANCA 约有200个不同的等位基因，包括几乎所有的已知的突变类型，大片段的缺失是 主要的突变类型。目前认为，FA是由于DNA内切酶异常阻碍了受损DNA自然 修复过程，进而引起染色体畸变，最终导致造血干细胞缺陷及多发性畸形。常规诊断FA主要依据全血细胞减少家族史、骨髓再生障碍、特征性先天畸形及染色 体断裂等。

有文献报道了FANCA基因外显子14c.1303C>T(P.R435C)突变位点和外显 子31c.3031C>T(P.R1011C)突变位点，导致该基因的第435位和1011位氨基酸 均由精氨酸变成半胱氨酸，通过蛋白功能预测分析，该突变对蛋白功能影响均为 有害。另有文献报道FANCA基因在韩国人群中的突变存在c.2546delC、 c.2778+1G>C、c.3520_3522delTGG、c.3627-1G>A、c.3720_3724delAAACA突变， 这些突变具有病理性作用。还有文献报道FANCA基因外显子14 c.1235C>T(P.A412V)，导致该基因的第412位氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，该突 变在范可尼贫血症中功能影响未知，可能为良性。

FA的治疗首选异基因造血干细胞移植，可修复受损细胞及改善FA造血微环 境，是提高患者长期无病生存率的惟一方法。在一个家族中鉴定FA基因的突变， 有助于进行产前诊断和围着床期的遗传学诊断及FA携带者的诊断。FA亚型和 FA基因突变的确证也是作基因治疗的必要前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测FANCA基因第14号外显子突变位点 1235C>T的试剂盒和检测方法，采用PCR技术，可用于快速检测患者体内FANCA 基因第14号外显子c.1235C>T位点的突变情况。所述检测FANCA基因第14号 外显子c.1235C>T位点突变情况的扩增引物和测序引物如权利要求1所述。

进一步地，引物SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2是扩增FANCA基因第14号外显 子的上下游扩增引物。

进一步地，引物SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4是检测扩增FANCA基因扩增产物 的上下游测序引物。

本发明还提供了一种检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C>T 突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提血液中的DNA；

2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

3.采用PCR扩增产物进行测序反应；

4.测序反应产物经纯化、变性后，上测序仪测序；

5.对测序结果用软件进行分析，确定c.1235C>T位点是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

扩增FANCA基因第14号外显子的核苷酸序列为：

SEQ.ID NO.1：TGTAAAACGACGGCCAGTACTTGGTGTTTGGGTGTG

SEQ.ID NO.2：AACAGCTATGACCATGCAAGGTTGCTCACTCACA

进一步地，测序引物碱基序列为：

检测FANCA基因扩增产物的测序引物核苷酸序列为：

SEQ.ID NO.3：TGTAAAACGACGGCCAGT

SEQ.ID NO.4：AACAGCTATGACCATG。

本发明还提供了一种检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C>T 突变情况的试剂盒，包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

该试剂盒包括扩增FANCA基因第14号外显子的核苷酸序列为：

SEQ.ID NO.1：TGTAAAACGACGGCCAGTACTTGGTGTTTGGGTGTG

SEQ.ID NO.2：AACAGCTATGACCATGCAAGGTTGCTCACTCACA

和测序引物碱基序列为：

检测FANCA基因扩增产物的测序引物核苷酸序列为：

SEQ.ID NO.3：TGTAAAACGACGGCCAGT

SEQ.ID NO.4：AACAGCTATGACCATG。

有益效果：本发明设计了扩增FANCA基因第14号外显子的引物。采用PCR 技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使 扩增效率达到最佳。本发明利用Sanger测序技术检测FANCA基因第14号外显 子c.1235C>T位点突变的方法，可以准确得将FANCA基因第14号外显子 c.1235C>T的突变检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。 荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为FANCA基因第14号外显子扩增引物的电泳图，M为Marker DL 2000， 如图1所示，扩增引物扩增有效，且条带单一。

图2为样本1、2FANCA基因第14号外显子c.1235C>T位点突变型和野生 型测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中 未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥 斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所 建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测FANCA基因第14号外显子c.1235C>T位点突变的引物，该引物 的设计是针对FANCA基因第14号外显子c.1235C>T位点设计的上下游扩增引 物，包括SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2核苷酸序列。

一种检测FANCA基因第14号外显子c.1235C>T位点突变的试剂盒，包括

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；扩增FANCA基因第14号外显子的扩增引物，引物浓度均为 10μM。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、 无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测FANCA基 因第14号外显子和第33号外显子序列的测序引物分别为SEQ.ID NO.5(3.2μm)、 SEQ.ID NO.6(3.2μm),以及BigdyeTerminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液， 颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸 去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl 蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分 钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇， 充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管 中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸 附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12， 000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中 加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离 心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管 中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12， 000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl 分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水 或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。

如图1所示，即血液样本以SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2为引物扩增后所得产 物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度外显子14为280bp，通过电泳图的分析表 明本发明所述引物SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2扩增有效，且条带单一。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl 无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙 醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加 入10μl Hi-Di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与FANCA标准序列(Genbank： NG_011706.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取2例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增 和测序。每份检测体系PCR反应液中加入样本1μl。电泳结果如图1所示，表明本 发明所述引物SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本1、2的检测结果如图2所示：

图2为样本1、2FANCA基因第14号外显子c.1235C>T位点突变型和野生 型测序截图，说明样本1发生c.1235C>CT部分突变，样本2未发生突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物能够扩展出FANCA基因第14号外 显子c.1235C>T位点序列，并且测序结果完全准确，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110> 南京艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C>T的引物和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtac ttggtgtttg ggtgtg 36

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacagctatg accatgcaag gttgctcact caca 34

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacagctatg accatg 16