含有能够穿透血脑屏障的化合物作为预防或治疗脑癌的有效成分的药物组合物
阅读说明：本技术 含有能够穿透血脑屏障的化合物作为预防或治疗脑癌的有效成分的药物组合物 (Pharmaceutical composition containing a compound capable of penetrating the blood-brain barrier as an active ingredient for preventing or treating brain cancer ) 是由 崔焕根 朴种培 高银和 孙正范 金南斗 李承勋 南都铉 于 2018-02-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物组合物,其含有能够穿透血脑屏障的化合物作为预防或治疗脑癌有效成分。根据本发明的用于预防或治疗脑癌的药物组合物有效地穿透大脑的血脑屏障从而有效地抑制LRRK2蛋白,因此可用于预防或治疗脑癌。(The present invention relates to a pharmaceutical composition containing a compound capable of penetrating the blood-brain barrier as an effective ingredient for preventing or treating brain cancer. The pharmaceutical composition for preventing or treating brain cancer according to the present invention effectively penetrates the blood-brain barrier of the brain to effectively inhibit LRRK2 protein, and thus can be used for preventing or treating brain cancer.)
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗脑癌的药物组合物，其含有能够穿透血脑屏障的化合物作为活性成分。
背景技术
蛋白激酶是一种催化三磷酸腺苷(ATP)的末端磷酸基团转移到酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的酶，酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸为蛋白质的特异性残基，该酶参与根据细胞外介质和环境变化来调节细胞活性或生长和分化的信号。
不适当的高蛋白激酶活性与由异常细胞行为引起的许多疾病直接或间接相关。例如，疾病可由参与突变、过表达或不适当的酶活性的激酶的适当调节机制的故障引起，或者由过量产生或缺乏参与细胞因子和激酶的上游或下游信号传导的因子引起。因此，选择性抑制激酶活性可成为进一步开发用于治疗疾病的新药的目标。
LRRK2(富亮氨酸重复激酶-2)蛋白属于富亮氨酸重复激酶家族，由具有高种间相似性的2527个氨基酸序列组成。LRRK2蛋白的特征在于在单个蛋白中显示GTP酶和丝氨酸-苏氨酸激酶活性。在包括脑的多种器官和组织中观察到表达的LRRK2蛋白，并且其在细胞水平上存在于细胞质或细胞膜和线粒体外膜中。
此外，LRRK2蛋白具有五个功能上重要的结构域，并且通过蛋白相互作用和酶促作用以及通过自身磷酸化的自动调节作用推断其调节细胞功能。特别地，已知伴侣机制、细胞骨架排列、蛋白翻译机制、突触小泡内吞作用、促***原活化蛋白激酶-信号级联和泛素/自噬蛋白降解途径受LRRK2蛋白调节。
据报道，LRRK2蛋白与阿尔茨海默氏病相关的轻度认知障碍进程、左旋多巴诱导的运动障碍和神经前体分化相关的中枢神经系统(CNS)疾病有关。此外，据报道，LRRK2蛋白的G2019S突变增加了非皮肤癌的发病率，例如急性髓性白血病(AML)、肾癌、乳腺癌、肺癌、***癌等。具体地，LRRK2蛋白的G2019S突变增加了LRRK2激酶结构域的催化活性。此外，据报道，LRRK2蛋白还与肌萎缩侧索硬化、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎相关(国际专利公开号WO2011/038572)。
同时，治疗脑肿瘤的方法包括手术、放射疗法、抗癌药物疗法(化学疗法)和激素疗法。其中，主要进行手术和放射疗法，但放射疗法的问题在于伴有神经毒性和痴呆等副作用。为了解决这些问题，抗癌药物疗法(化学疗法)受到关注，但治疗脑肿瘤的药物疗法是存在问题的，因为大多数药物都被称为“血脑屏障”(BBB)的特殊保护系统阻断，从而不能传递到大脑，并且由于癌症对抗癌药物的抗性而受到限制。
因此，本发明人首先通过体内实验证明，作为LRRK2蛋白抑制剂的化合物可以有效地穿透血脑屏障(BBB)，因此可用于预防和治疗脑癌，最终导致本发明。
技术问题
本发明的一个目的是提供一种药物组合物，其能够有效地穿透血脑屏障，因此可用于预防或治疗脑癌。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种用于预防或治疗脑癌的药物组合物，其含有LRRK2蛋白抑制剂作为活性成分。
此外，本发明提供一种用于预防或治疗脑癌的药物试剂盒，包括含有药学有效量的LRRK2蛋白抑制剂作为活性成分的第一组分和含有药学有效量的安维汀(Avastin)作为活性成分的第二组分。
此外，本发明提供一种治疗脑癌的方法，包括向受试者施用LRRK2蛋白抑制剂。
此外，本发明提供一种治疗脑癌的方法，包括向受试者施用LRRK2蛋白抑制剂并向受试者施用安维汀。
此外，本发明提供LRRK2蛋白抑制剂在制备用于治疗脑癌的药物组合物中的用途。
有益效果
根据本发明，用于预防或治疗脑癌的药物组合物含有LRRK2蛋白抑制剂作为活性成分，因此通过轻易穿透一般药物难以通过的血脑屏障而有效显著抑制肿瘤形成。
附图说明
图1是显示从脑肿瘤患者获得的癌组织中LRRK2蛋白表达的蛋白印迹结果的图像。
图2是显示LRRK2蛋白磷酸化与脑肿瘤恶性之间相关性的评价结果的图像。
图3是显示编码脑肿瘤细胞中表达的LRRK2蛋白的核酸序列的分析结果的图像。
图4a示意性地显示了表达LRRK2蛋白的慢病毒载体的结构。
图4b是显示用表达LRRK2蛋白的慢病毒载体感染的细胞中LRRK2蛋白过表达的图像。
图4c是显示用表达LRRK2蛋白的慢病毒载体感染的细胞中肿瘤细胞的自我更新的图像。
图5a是显示用实施例10、11、12、20和21的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图5b是显示用实施例11、12、20、21和22的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图6是显示用实施例10、11、12、20和21的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图。
图7和8是显示用各种浓度的实施例10的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图9和10是显示用各种浓度的实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图11和12是显示用浓度为100nM的实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞后蛋白印迹随时间变化结果的图像。
图13至15是显示用浓度范围为50nM至2,000nM的实施例12的化合物处理NCC01细胞后1天的蛋白印迹结果的图像。
图16是显示通过使用实施例12的化合物抑制线粒体活性而诱导的脑肿瘤细胞死亡的图像。
图17是显示使用实施例12的化合物抑制脑肿瘤干细胞中存在的线粒体活性的图像。
图18是显示通过使用实施例12的化合物抑制TRAP1表达来抑制线粒体活性的图像。
图19a是显示由暴露于缺氧条件的NCC01细胞形成的球体的生长被针对LRRK2基因的shRNA抑制的图像。
图19b是显示暴露于缺氧条件下的NCC01细胞中LRRK2蛋白表达的蛋白印迹结果的图像。
图19c是显示由暴露于缺氧条件的528NS细胞形成的球体的生长被针对LRRK2基因的shRNA抑制的图像。
图19d是显示在暴露于缺氧条件下的528NS细胞中LRRK2蛋白表达的蛋白印迹结果的图像。
图20和21是显示在用浓度为100nM的实施例11、12和21的化合物处理NCC01细胞后1天的细胞周期FACS的评价结果的图像。
图22是显示将实施例12的化合物口服给药至脑肿瘤诱导的小鼠模型后的存活天数变化的观察结果的图像。
图23是显示将实施例12的化合物口服给药至脑肿瘤诱导的小鼠模型后肿瘤大小变化的测量结果的图像。
图24是显示当实施例12的化合物与安维汀联合给药时对脑肿瘤的治疗效果增加的图像。
图25是显示用比较例的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图26是显示用实施例10、11、12、20和21的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图27是显示用各种浓度的实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图28是显示将实施例12、20和21的化合物口服给药至脑肿瘤诱导的小鼠模型后的存活天数变化的观察结果的图像。
图29是显示用比较例的化合物和实施例1、11和12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞时的蛋白印迹结果的图像。
最佳实施方式
在下文中，将给出本发明的详细描述。
本发明涉及一种用于预防或治疗脑癌的药物组合物，其含有LRRK2(富亮氨酸重复激酶-2)蛋白抑制剂作为活性成分。
在一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式1表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式1]
在化学式1中，
R1为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-10直链或支链烷基、C1-10直链或支链烷氧基、C1-5直链或支链烷基氨基、或C1-5直链或支链二烷基氨基；
R2为-H、-OH、卤素、硝基、腈、或未取代的或至少一个卤素取代的C1-10直链或支链烷基，或与R3连接形成含有至少一个N的未取代的、取代的或稠合的5-至8-元环杂环烷基，或形成含有至少一个N的未取代或取代的5-或6-元环杂芳基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基和所述取代的5-或6-元环杂芳基各自独立地为由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基和5-或6-元环杂芳基：-OH、＝O、卤素和C1-5直链或支链烷基，以及
所述稠合的5-至8-元环杂环烷基为与未取代的C6-10芳基稠合的5-至8-元杂环烷基；
R3为–H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-10直链或支链烷基、C1-10直链或支链烷氧基、C1-5直链或支链烷基氨基、C1-5直链或支链二烷基氨基、C1-5直链或支链烷基磺酰基C6-10芳基氨基、或C1-5直链或支链烷基磺酰基氨基C6-10芳基氨基，或与R2连接形成含有至少一个N的未取代的、取代的或稠合的5-至8-元环杂环烷基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基独立地为由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基：-OH、＝O、卤素和C1-5直链或支链烷基；以及
所述稠合的5-至8-元环杂环烷基为与未取代的C6-10芳基稠合的5-至8-元环杂环烷基；以及
Y为
其中R4、R5和R6独立地为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-10直链或支链烷基、C1-10直链或支链烷氧基、含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基羰基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基为由C1-5直链或支链二烷基氨基取代的5-至8-元环杂环烷基，或含有至少一个N且由至少一个C1-5直链或支链烷基取代的6-元环杂环烷基，以及
R7、R8和R9独立地为-H、-OH、卤素、硝基、腈、未取代的或至少一个羟基取代的C1-10直链或支链烷基，或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基为由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基：-OH、＝O、卤素和含O的4-或5-元环未取代的杂环烷基。
优选地，
R1为-H或-NH(CH3)；
R2为-H、卤素或-CF3，或与R3连接形成
R3为-H、-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、
Y为
其中R4、R5和R6独立地为-H、甲氧基、卤素、
R7、R8和R9独立地为-H、甲基、卤素、
更优选地，由化学式1表示的化合物选自以下化合物中的任何一种：
(1)5-氯-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)-N2-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺；
(2)N-(2-(2-(3-氯-4-甲氧基苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)甲磺酰胺；
(6)(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)甲酮；
(8)N4-乙基-N2-(1-(3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(三氟甲基))嘧啶-2,4-二胺；
(10)2-[(2-甲氧基-4-[[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基]苯基)氨基]-5,11-二甲基-5,11-二氢-6H嘧啶并[4,5-b][1,4]苯并二氮杂-6-酮；
(11)(4-(4-(乙基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-2-氟-5-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮；
(12)(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉代)甲酮；
(14)1-(5-氯-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙-2-醇；和
(16)N2-(5-氯-1-((3S,4R)-3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)-N4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式2表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式2]
在化学式2中，
L1和L2独立地为-O-、-CH2-、-NH-或-S-；
A1为未取代的或取代的C3-10环烷基，其中所述取代的C3-10环烷基为由以下至少一种取代基取代的C3-10环烷基：-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基和C1-5直链或支链烷氧基；
A2为含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的或取代的5-或6-元环杂芳基，其中所述取代的5-或6-元环杂芳基为由以下至少一种取代基取代的5-或6-元环杂芳基：-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基和C1-5直链或支链烷氧基；以及
A3、A4和A5独立地为-H、C1-5直链或支链烷基或C1-5直链或支链烷氧基。
优选地，L1和L2独立地为-CH2-、-NH-或-S-；
A1为
A2为
A3、A4和A5独立地为-H或甲基。
优选地，由化学式2表示的化合物为选自以下化合物中的任何一种：
(7)(S)-3-(环丙基硫基)-7-甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢噻吩并[3,4-c]吡啶-4(5H)-酮；和
(9)3-(环戊基硫代)-6,6-二甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢苯并[c]噻吩-4(5H)-酮。
在又一实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂为由以下化学式3表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式3]
在化学式3中，
L3不存在，或为-NH-或-O-；
L4为N或C；
E1为-H、-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；
当L4为N时，E2不存在，或者当L4为C时，E2为E5为C1-5直链或支链烷基；
E3为-H、-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、未取代的或取代的C6-10环烷基、或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，其中所述取代的C6-10环烷基和取代的5-至8-元环杂环烷基独立地为由以下至少一种取代基取代的C6-10环烷基和5-至8-元环杂环烷基：-OH、卤素、C1-3直链或支链烷基、C1-3直链或支链烷氧基；以及
E4为含有至少一个N的未取代的或取代的6-至8-元环杂环烷基羰基C1-5直链或支链烷基，或含有至少一个N的未取代的或取代的6-至8-元环杂芳基，
其中所述取代的6-至8-元环杂环烷基和取代的6-至8-元环杂芳基独立地由C6-10芳基取代，或由含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的6-元环杂环烷基取代，
所述取代的6-元环杂环烷基为由-OH、卤素或未取代的或至少一个卤素取代的C1-5直链或支链烷基取代的6-元环杂环烷基。
优选地，L3不存在，或为-NH-或-O-；
L4为N或C；
E1为-H或甲基；
当L4为N时，E2不存在，或者当L4为C时，E2为
E3为-H、
E4为
更优选地，由化学式3表示的化合物为选自以下化合物组中的任何一种：
(3)(R)-3-(4-(环己基氨基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)-1-(3-苯基哌啶-1-基)丙-1-酮；
(5)4-(4-(6-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-4-基氧基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)吡啶-2-基)吗啉；
(18)3-(6-(4-(2-氟乙基)哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)-5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑；和
(20)(2S,6R)-2,6-二甲基-4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)吗啉。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式4表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式4]
在化学式4中，
α为-CH＝或-N＝；
G1为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、或含有至少一个N的未取代的或取代的5-至8-元环杂芳基氨基，
其中所述取代的5-至8-元环杂芳基为由-OH、卤素或C1-3直链或支链烷基取代的5-至8-元环杂芳基；
G2为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、未取代的或取代的C6-10芳基、或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，
其中所述取代的C 6-10芳基和取代的5-至8-元环杂环烷基独立地为C6-10芳基和由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基：C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、和含有N和O的6-元环未取代的杂环烷基C1-3直链或支链烷基；以及
G3为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、未取代的或至少一个腈取代的C6-10芳基、或含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的或取代的5-至10-元环杂芳基，
其中所述取代的5-至10-元环杂芳基为由以下至少一种取代基取代的5-至10-元环杂芳基：卤素、C1-5直链或支链烷基和腈。
优选地，
G1为-H或
G2为
G3为腈、
更优选地，由化学式4表示的化合物为选自以下化合物中的任何一种：
(19)6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-4-(3-甲基-4-(吗啉代甲基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲腈；
(21)3-(4-吗啉代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲腈；和
(22)1-甲基-4-(4-吗啉代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-1H-吡咯-2-甲腈。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式5表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式5]
在化学式5中，
M1为未取代的或至少一个卤素取代的C6-10芳基；
M2为含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的6-至8-元环杂芳基；以及
M3为含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的6-至8-元环杂环烷基。
优选地，由化学式5表示的化合物为以下化合物：
(4)2-(4-氟苄氧基)-5-(1-(2-吗啉代乙基)-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式6表示的化合物，其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式6]
在化学式6中，
Q1为-H、氨基、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；
Q2为-H、或未取代的C6-10环烷基；
Q3为-H、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；以及
Q4为含有至少一个N的甲基取代的5-元环杂芳基。
优选地，由化学式6表示的化合物为以下化合物：
(13)(R)-4-(1-环丙基乙基氨基)-7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-噌啉-3-甲酰胺。
在又一实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式7表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式7]
在化学式7中，
T1为-H、C1-5直链或支链烷基、或未取代的C3-8环烷基羰基。
优选地，由化学式7表示的化合物为以下化合物：
(15)环丙基[10,11,14,15-四氢-1,16-乙烯-4,8-(亚甲基)吡唑[3,4-j][1,4,7,9]氧杂三氮杂环己烷-12(13H)-基]甲酮。
在又一实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂为由以下化学式8表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式8]
在化学式8中，
Z1为-H、氨基、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；
Z2为含有至少一个N并由C1-5直链或支链烷基取代的5-至8-元环杂芳基；以及
Z3为-H、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基。
优选地，由化学式8表示的化合物为以下化合物：
(17)(4-(6-氨基-5-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)吡啶-3-基)-2-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮。
根据本发明，药物组合物可用于治疗脑癌，尤其是这样的脑癌：其中表达或激活LRRK2蛋白。LRRK2蛋白活性可通过LRRK2蛋白的磷酸化来表现。
根据本发明，LRRK2蛋白抑制剂可以以其药学上可接受的盐的形式使用。这里，有用的盐可为使用药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐。
酸加成盐可获自无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸、亚磷酸等，无毒有机酸例如脂肪族单-和二羧酸酯、苯基取代的链烷酸酯、羟基链烷酸酯和链烷二酸酯、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等，或有机酸如乙酸、苯甲酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、葡萄糖酸、甲磺酸、4-甲苯磺酸、酒石酸，富马酸等。药学上无毒的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐(decanoate)、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐(caprate)、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二油酸盐、己烷-1,6-二油酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、羟苯酸盐、甲苯基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐，β-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
根据本发明的酸加成盐可以通过常规方法制备，例如，通过将LRRK2蛋白抑制剂衍生物溶解在有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷或乙腈中，并向其中加入有机酸或无机酸以获得沉淀物，然后将沉淀物过滤并干燥，或者将溶剂和过量的酸进行真空蒸馏、干燥，然后在有机溶剂存在下结晶。
另外，根据本发明的LRRK2蛋白抑制剂可使用碱以药学上可接受的金属盐的形式制备。具体地，碱金属或碱土金属盐可通过以下方法获得：例如将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤未溶解的化合物盐，并将滤液蒸发至干。这里，钠盐、钾盐或钙盐作为金属盐是药学上合适的。此外，相应的盐可通过使碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应来获得。
在根据本发明的药物组合物中，LRRK2蛋白抑制剂、其光学异构体或其药学上可接受的盐可在临床给药时以各种剂型口服或肠胃外给药。其制剂可使用常用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制备。
用于口服给药的制剂的实例包括片剂、丸剂、硬/软胶囊、液体、悬浮液、乳液、糖浆、颗粒、酏剂、锭剂等。除了活性成分外，这些制剂可含有稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)或润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。片剂可含有粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷等，并且可任选地含有崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或沸腾混合物，吸收剂，着色剂，调味剂和甜味剂。
此外，本发明涉及一种用于预防或治疗脑癌的药物试剂盒，包括含有药学有效量的LRRK2蛋白抑制剂作为活性成分的第一组分和含有药学有效量的安维汀作为活性成分的第二组分。
在根据本发明的用于预防或治疗脑癌的药物试剂盒中，第一组分和第二组分可依次或同时施用。当依次施用第一组分和第二组分时，可在施用第一组分之前或之后30分钟至180分钟、60分钟至120分钟或80分钟至100分钟施用第二组分。在本发明的一个实施方案中，可在施用第一组分后90分钟施用第二组分。
当同时施用包含在药物试剂盒中的第一组分和第二组分时，可增加针对脑癌的抗癌活性。上述施用可包括施用给哺乳动物，特别是人。
此外，本发明涉及一种治疗脑癌的方法，包括向受试者施用LRRK2蛋白抑制剂。
LRRK2蛋白可具有上述特性，省略其详细描述。受试者可为哺乳动物，尤其是人。
根据本发明的药物组合物，含有LRRK2蛋白抑制剂、其光学异构体或其药学上可接受的盐作为活性成分，可以肠胃外给药，肠胃外给药的实例包括皮下注射、静脉注射、肌内注射和胸腔内注射。
这里，为了制备用于肠胃外给药的制剂，将LRRK2蛋白抑制剂、其光学异构体或其药学上可接受的盐与水、以及稳定剂或缓冲剂混合，得到溶液或悬浮液，将溶液或悬浮液以安瓿或小瓶单位剂型制备。该组合物可被灭菌，并且可进一步含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、水合或乳化促进剂、用于控制渗透压的盐和缓冲剂，以及其他治疗上有用的物质，并且可通过常规混合、制粒或涂层配制。
此外，根据本发明的包含LRRK2蛋白抑制剂、其旋光异构体或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物的剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、剂型、健康状况和疾病严重程度而变化，并且以体重70kg的成年患者计通常为0.1至1000mg/天，优选1至500mg/天，此外，可以按照医生或药剂师的规定每天施用一次或以规定的时间间隔施用多次。
此外，本发明涉及一种治疗脑癌的方法，包括向受试者施用LRRK2蛋白抑制剂以及向受试者施用安维汀。
LRRK2蛋白可具有上述特征，省略其详细描述。
在根据本发明的治疗脑癌的方法中，可以依次或同时施用LRRK2蛋白抑制剂和安维汀。当依次施用LRRK2蛋白抑制剂和安维汀时，可以在施用LRRK2蛋白抑制剂之前或之后30分钟至180分钟、60分钟至120分钟或80分钟至100分钟施用安维汀。在本发明的一个实施方案中，可以在施用LRRK2蛋白抑制剂后90分钟施用安维汀。
当同时施用LRRK2蛋白抑制剂和安维汀时，可以增加针对脑癌的抗癌活性。上述施用可包括施用给哺乳动物，特别是人。
此外，本发明涉及LRRK2蛋白抑制剂在制备用于治疗脑癌的药物组合物中的用途。
本发明人首先证明LRRK2蛋白抑制剂通过轻易穿透一般药物难以通过的血脑屏障而有效地显著抑制肿瘤形成。其实验结果将通过以下实验例详细描述。
实施例
通过以下实施例和实验例将更好地理解本发明。
这里，实施例和实验例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明。
<实施例1>制备5-氯-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)-N2-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺
参考WO 2004080980、WO 2005016894、WO 2009102446、WO 2012019132或WO2015077602制备上述化合物。
<实施例2>制备N-(2-(2-(3-氯-4-甲氧基苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)甲磺酰胺
参考WO 2009127642制备上述化合物。
<实施例3>制备(R)-3-(4-(环己基氨基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)-1-(3-苯基哌啶-1-基)丙-1-酮
参考WO2010106333制备上述化合物。
<实施例4>制备2-(4-氟苄氧基)-5-(1-(2-吗啉代乙基)-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺
参考WO 2011038572制备上述化合物。
<实施例5>制备4-(4-(6-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-4-基氧基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)吡啶-2-基)吗啉
参考WO 2011141756制备上述化合物。
<实施例6>制备(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)甲酮
参考WO 2011151360制备上述化合物。
<实施例7>制备(S)-3-(环丙基硫基)-7-甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢噻吩并[3,4-c]吡啶-4(5H)-酮
参考WO 2012058193制备上述化合物。
<实施例8>制备N4-乙基-N2-(1-(3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(三氟甲基))嘧啶-2,4-二胺
参考WO 2012062783制备上述化合物。
<实施例9>制备3-(环戊基硫代)-6,6-二甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢苯并[c]噻吩-4(5H)-酮
参考WO2012118679制备上述化合物。
<实施例10>制备2-[(2-甲氧基-4-[[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基]苯基)氨基]-5,11-二甲基-5,11-二氢-6H嘧啶并[4,5-b][1,4]苯并二氮杂-6-酮
参考WO 2010080712或WO 2015176010制备上述化合物。
<实施例11>制备(4-(4-(乙基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-2-氟-5-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮
参考WO 2011151360制备上述化合物。
<实施例12>制备(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉代)甲酮
12-1.制备(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉 代)甲酮
参考WO 2011151360制备上述化合物。
12-2.制备(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉 代)甲酮
步骤1.将2,4-二氯-5-碘嘧啶(1.0当量)溶解在THF中，然后在0℃下加入甲胺(在EtOH中3.5wt％，1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌2小时，从中除去溶剂，得到的产物无需进一步纯化即可用于后续步骤(产率：100％)。
步骤2.用氮气吹扫双颈圆底烧瓶，并向其中放入CuI(5.0当量)和KF(5.0当量)。将所得混合物加热至150℃，然后在减压下搅拌2小时。反应后，将温度降至室温，并使用注射器添加在氮气下溶解在DMF/NMP(1：1)中的三甲基(三氟甲基)硅烷(5.0当量)。反应30分钟后，用注射器添加溶解在DMF/NMP(1：1)中的2-氯-5-碘-N-甲基嘧啶-4-胺(1.0当量)，并在50℃下反应18小时。反应后，向所得产物中加入水，形成沉淀，然后滤出沉淀。使用EtOAc(x3)从由此获得的滤液中萃取有机物质。将合并的有机层用盐水洗涤，并使用Na2SO4除去剩余的水。使用MPCL(EtOAc：Hex)纯化脱水后的混合物，从而获得黄色固体即为目标化合物(产率：70％)。
步骤3.将2-氯-N-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(1.0当量)和(4-氨基-3-甲氧基苯基)(吗代代)甲酮(1.0当量)溶于二恶烷中，并在室温下加入对甲苯磺酸(1.0当量)。将所得混合物在100℃下搅拌16小时并冷却至室温，从中除去溶剂，然后向其中加入冰水。使用EtOAc(x3)萃取有机物质。将合并的有机层用盐水洗涤，并使用Na2SO4除去剩余的水。使用MPCL(EtOAc：Hex)纯化脱水后的混合物，从而获得白色固体即为目标化合物(产率：70％)。
<实施例13>制备(R)-4-(1-环丙基乙基氨基)-7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-噌啉-3-甲酰胺
参考WO2012162254制备上述化合物。
<实施例14>制备1-(5-氯-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙-2-醇
参考WO 2012062783制备上述化合物。
<实施例15>制备环丙基[10,11,14,15-四氢-1,16-乙烯-4,8-(亚甲基)吡唑[3,4-j][1,4,7,9]氧杂三氮杂环己烷-12(13H)-基]甲酮
参考WO 2013046029制备上述化合物。
<实施例16>制备N2-(5-氯-1-((3S,4R)-3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)-N4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺
参考药物化学杂志(Journal of Medicinal Chemistry)(2014)，57(3)，921-936制备上述化合物。
<实施例17>制备(4-(6-氨基-5-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)吡啶-3-基)-2-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮
参考WO2014106612制备上述化合物。
<实施例18>制备3-(6-(4-(2-氟乙基)哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)-5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑
参考WO 2014137723制备上述化合物。
<实施例19>制备6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-4-(3-甲基-4-(吗啉代甲基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲腈
参考WO 2014170248制备上述化合物。
<实施例20>制备(2S,6R)-2,6-二甲基-4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)吗啉
参考WO 2014137723制备上述化合物。
<实施例21>制备3-(4-吗啉代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲腈
参考WO 2015092592制备上述化合物。
<实施例22>制备1-甲基-4-(4-吗啉代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-1H-吡咯-2-甲腈
参考USA20140005183A1制备上述化合物。
实施例1至22中制备的化合物的结构示于下表1中。
[表1]
<比较例>制备2-甲基-2-[3-甲基-4-[[4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基]吡唑-1-基]丙腈
参考WO 2012062783制备题述化合物。
<实验例1>评价脑肿瘤患者的癌干细胞中LRRK2蛋白表达
为了评价使用LRRK2蛋白作为用于治疗脑肿瘤的靶蛋白的可能性，使用从19个脑肿瘤患者获得的癌组织进行蛋白印迹，从而测定LRRK2蛋白表达。
具体地，从脑肿瘤患者获得癌组织，并进行蛋白印迹以测定LRRK2蛋白表达。结果如图1所示。
如图1所示，LRRK2蛋白在从脑肿瘤患者获得的癌组织中表达，并且表达水平随着脑肿瘤恶性的增加而升高。因此，证实LRRK2蛋白可用作治疗脑肿瘤的靶标。
<实验例2>评价由于LRRK2蛋白磷酸化引起的脑肿瘤患者的预后
LRRK2蛋白通过磷酸化显示其活性。因此，测量了由脑肿瘤细胞中LRRK2蛋白磷酸化引起的脑肿瘤患者预后的变化。
具体地，从约200名3期和4期脑肿瘤患者获得组织样品，并通过免疫染色测量所获得的组织样品中磷酸化LRRK2蛋白的表达。
如图2所示，LRRK2蛋白磷酸化随着脑肿瘤恶性增加而增加，即随着脑肿瘤从三期进展到四期而增加。因此，证实磷酸化的LRRK2蛋白可用作治疗高恶性脑肿瘤的靶蛋白。
<实验例3>LRRK2蛋白突变与脑肿瘤之间的相关性
根据常规研究，已经报道了多种癌可由LRRK2蛋白中发生的突变引起，还报道了已知与LRRK2蛋白相关的帕金森病也是由LRRK2蛋白突变引起的。因此，评价了在上述实验例中证实在脑肿瘤细胞中过表达的LRRK2蛋白是否是其突变体。具体地，使用从下表2中所示的引物，使用从5名患者获得的脑肿瘤细胞进行测序。
[表2]
如图3所示，除了已知的单核苷酸多态性(SNP)之外，编码脑肿瘤细胞中表达的LRRK2蛋白的核酸序列没有特异性突变，例如帕金森氏病中常见的突变。因此，证实了与帕金森病或其他类型的癌症不同，脑肿瘤是由过表达野生型LRRK2蛋白引起的，从而导致癌症。
<实验例4>评价由于LRRK2蛋白过表达引起的致肿瘤性
为了评价脑肿瘤是否是由实验例3中证实的LRRK2蛋白过表达引起的，制备了含有编码LRRK2蛋白的多核苷酸的慢病毒载体(pLenti CMV GFP DEST(736-1)，Addgene#19732)，并用其感染528NS、464T(韩国三星首尔医院)和离体细胞系以形成肿瘤。此处，用不表达LRRK2蛋白的慢病毒载体感染细胞作为对照。
如图4的结果所示，与对照相比，在用表达LRRK2蛋白的慢病毒感染的528NS、464T或离体细胞系中，GSC(神经胶质瘤干细胞)球体的大小增加。因此，证实LRRK2蛋白过表达导致肿瘤。
<实验例5>评价化合物的LRRK2蛋白磷酸化抑制活性(体外)-(1)
为了评价体外药物功效，使用脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞进行蛋白印迹实验。
更具体地，用浓度为100nM或1,000nM的实施例10、11、12、20、21和22中的每一个的化合物处理7.5×105至1.0×106NCC01细胞，1天后，收集样品并通过蛋白印迹评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组(vehicle)。结果显示在图5和6中。
如图5和6所示，与空白对照组相比，根据本发明的实施例10、11、12、20、21和22的化合物显著抑制脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞中的LRRK2蛋白磷酸化。
因此，证实了本发明的化合物抑制了在脑肿瘤患者来源的细胞系中表达的LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例6>根据化合物浓度评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)-(1)
为了具体确定表现出高效力的本发明实施例的化合物的浓度，以与实验例1中评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性相似的方式进行本实验。
更具体地，用浓度为0.5、1、5、10、50和100nM的实施例10和12中的每一个的化合物处理7.5×105至1.0×106个NCC01细胞，1天后，收集样品并通过蛋白印迹评价LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图7到10中。
如图7至10所示，当使用浓度为100nM的实施例10的化合物时，检测到磷酸化的LRRK2蛋白，但实施例12的化合物在50和100nM的浓度下主要抑制LRRK2蛋白磷酸化。
因此，证实了即使在低nM浓度下，本发明的化合物也显著抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例7>根据处理时间评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)
为了评价在用本发明实施例的化合物处理后本发明化合物的活性随时间的变化，以与实验例1中评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性相似的方式进行本实验。
更具体地，用浓度为100nM的实施例12的化合物处理7.5×105至1.0×106个NCC01细胞，并且在1天、4天和8天后，收集样品并通过蛋白印迹评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图11和12中。
如图11和12所示，在用实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞后1天，LRRK2蛋白磷酸化的程度急剧降低，并且其降低随时间持续。
因此，证实了本发明实施例的化合物长时间连续地抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例8>评价由于抑制LRRK2蛋白磷酸化引起的细胞内信号传导途径变化(体外)
进行实验以确定根据本发明实施例的化合物对癌干细胞生长的细胞内信号传导途径的影响。
更具体地，用浓度为50、100、500、1,000和2,000nM的实施例12的化合物处理1.0×106个NCC01细胞。1天后，收集样品并通过蛋白印迹测量NESTIN蛋白的表达，所述NESTIN蛋白是参与细胞内信号传导途径的癌干细胞标记物。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图13至15中。
如图13至15所示，实施例12的化合物抑制NCC01细胞中的LRRK2蛋白磷酸化，LRRK2蛋白磷酸化也以依赖于所用化合物浓度的方式降低。
因此，证实了根据本发明实施例12的化合物抑制来自脑肿瘤患者的细胞中LRRK2-蛋白介导的信号传导，从而降低参与肿瘤干细胞生长的NESTIN蛋白的表达，进而抑制细胞生长。
<实验例9>通过抑制LRRK2蛋白活性评价线粒体功能的变化
LRRK2蛋白位于线粒体的外膜中，据报道其参与线粒体的***和其膜电位的调节。因此，进行实验以确定抑制LRRK2蛋白的实施例的化合物对线粒体功能的影响。
具体地，用1μM的实施例12的化合物处理NCC01细胞，1天后，向其中加入TMRE(四甲基罗丹明乙酸酯)染料以染色活化的线粒体，以评价线粒体功能的变化。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作对照组。用显微镜观察染色结果，并示于图16中。
如图16所示，对照组的细胞中线粒体的活性保持，从而TMRE染料的颜色显得清晰。然而，在用实施例12的化合物处理的细胞中，TMRE染料的显色程度降低，此外，细胞中核发生***。因此，证实了根据本发明的实施例12的化合物抑制线粒体活性，从而影响脑肿瘤细胞的死亡。
<实验例10>评价脑肿瘤干细胞系中LRRK2蛋白磷酸化抑制活性
进行实验以评价干细胞的凋亡是否是通过抑制已知与肿瘤转移相关的肿瘤干细胞中的LRRK2蛋白磷酸化而诱导的。
具体地，用浓度为0.1或1μM的实施例12的化合物处理脑肿瘤干细胞系NCC01细胞，1天后，如实验例9中所述对线粒体进行染色以测定其功能的变化。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。用显微镜观察染色结果，并示于图17中。
如图17所示，与对照组相比，在用实施例12的化合物处理的组中，脑肿瘤干细胞中存在的线粒体的活性受到抑制。因此，证实了根据本发明的化合物抑制线粒体活性，从而诱导脑瘤干细胞的死亡，进而抑制肿瘤转移。
<实验例11>评价脑肿瘤干细胞系中LRRK2蛋白抑制剂的TRAP1表达抑制活性
进行实验以评价根据本发明的LRRK2蛋白抑制剂是否对TRAP1(TNF受体相关蛋白1)的表达变化有影响，LRRK2蛋白抑制剂如实验例10中所证实的抑制脑肿瘤干细胞系中的线粒体活性，TRAP1已知参与线粒体功能调节。
具体地，将浓度为100或1,000nM的实施例12的化合物加入脑肿瘤干细胞系NCC01细胞，1天后，通过蛋白印迹测量TRAP1表达的变化。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。
如图18所示，TRAP1的表达被实施例12的化合物抑制。因此，证实了根据本发明的化合物抑制TRAP1的表达，从而抑制线粒体活性。
<实验例12>评价缺氧条件下LRRK2蛋白表达的变化
传统研究表明，缺氧条件在GSC的功能中很重要。因此，测量了在缺氧条件下LRRK2蛋白表达的变化和在抑制LRRK2蛋白表达时GSC球体的大小的变化。
具体地，将NCC01和528NS细胞暴露于缺氧条件并用针对LRRK2基因的两种shRNA处理，之后测量球体大小的变化。此处，对照是针对荧光素酶的shRNA(shNT)。
[表3]
如图19所示，与对照相比，暴露于缺氧条件的NCC01(a和b)和528NS(c和d)细胞的球体大小增加，但是被LRRK2 shRNA-1和LRRK2 shRNA-2抑制，LRRK2 shRNA-1和LRRK2shRNA-2是两种针对LRRK2基因的shRNA。因此，证实通过抑制LRRK2蛋白表达抑制了在缺氧条件下产生的GSC的生长。
<实验例13>评价通过抑制LRRK2蛋白磷酸化的凋亡诱导活性(体外)
为了评价脑肿瘤细胞的凋亡是否通过抑制LRRK2蛋白磷酸化诱导，使用FACS(荧光激活细胞分拣术)进行实验。
更具体地，用浓度为100nM的实施例11、12和21中的每一个的化合物处理7.5×105至1.0×106个NCC01细胞，1天后，收集样品并进行FACS，从而测定凋亡诱导活性。将未用实施例的化合物处理的组用作对照组。结果显示在图20和21中。
如图20和21所示，实施例11、12和21的化合物诱导NCC01细胞的凋亡。特别地，实施例12的化合物显示出比实施例11和21的化合物的高约3倍的凋亡率，表明与其他实施例的化合物相比，根据本发明的实施例12的化合物在诱导细胞凋亡方面非常有效。
<实验例14>评价动物模型中化合物对脑肿瘤细胞的生长抑制活性-(1)
进行实验以评估根据本发明的实施例的化合物在动物模型中是否对脑肿瘤细胞显示出生长抑制活性。
更具体地，将1.0×104个NCC01细胞(脑肿瘤患者来源的细胞系)注射到Balb/c-裸鼠模型的脑中，3天后，以10mg/kg或60mg/kg的剂量口服施用实施例12的化合物。在施用化合物后，基于存活期测定小鼠的存活率，并使用MRI测量小鼠中产生的肿瘤的大小。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图22和23中。
如图22所示，在空白对照组中小鼠的平均存活期为54天，在以10mg/kg口服施用实施例12的化合物的组中小鼠的平均存活期为71天，并且在以60mg/kg口服施用实施例12的化合物的该组中所有小鼠存活多至100天(空白对照组对10mg/kg：p＝0.032，空白对照组对60mg/kg：p<0.001)。
如图23所示，在未用化合物处理的空白对照组中注射NCC01细胞的位置处形成肿瘤，但在以10mg/kg或60mg/kg口服施用实施例12的化合物的组中未观察到肿瘤。
因此，证实了根据本发明的实施例的化合物显着抑制了动物模型中源自脑肿瘤细胞的肿瘤的形成。
<实验例15>评价联合施用化合物和安维汀时对脑肿瘤的治疗效果
当将根据本发明的实施例的化合物与作为治疗脑肿瘤药物的安维汀联合施用时，进行实验以确定动物模型中的治疗效果。
更具体地，使用5周龄Balb/c裸鼠制造原位小鼠模型。使用立体定位装置将脑肿瘤细胞系U87MG细胞(ATCC，USA)注射在前囟的左侧2.2mm处和前囟后0.5mm处3.5mm深处。注射细胞3天后，将小鼠分成3组，每组5只小鼠(分别为对照组(空白对照组)、施用安维汀的组、施用实施例12的化合物和安维汀的组)，并向其施用药物。以30mg/kg的剂量口服施用实施例12的化合物，并以10mg/kg的剂量腹膜内注射安维汀。此后，当小鼠显示肿瘤形成的证据，例如其总体重减少20％或更多或异常行为时，测量存活期。使用统计程序获得的存活图显示在图24中。
如图24所示，当实施例12的化合物与安维汀联合施用时，安维汀对脑肿瘤的治疗效果进一步显著增加。
<实验例16>评价比较例的化合物的LRRK2蛋白磷酸化抑制活性(体外)
使用脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞进行蛋白印迹实验，以评价比较例的化合物(已知作为LRRK2蛋白抑制剂)的体外药效。
更具体地，用比较例的化合物以0.1或1.0μM的浓度处理7.5×105至1.0×106个细胞，1天后，收集样品并通过蛋白印迹评估LRRK2蛋白磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果如图25所示。
如图25所示，已知根据本发明的比较例的化合物抑制LRRK2蛋白表达，但不抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例17>评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)-(2)
使用脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞进行蛋白印迹实验，以评估体外药物功效。这里，除了使用448T细胞(韩国三星首尔医院)代替NCC01细胞，以及使用实施例10、11、12、20和21的化合物之外，在与实验例5相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图26所示，与空白对照组相比，根据本发明的实施例10、11、12、20和21的化合物显著抑制脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞中的LRRK2蛋白磷酸化。
因此，再次证实，根据本发明的化合物抑制在脑肿瘤患者来源的细胞系中表达的LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例18>根据化合物浓度评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)-(2)
进行实验以确定能够在448T细胞中显示出高效力的根据本发明的实施例的化合物的浓度。具体地，除了使用448T细胞代替NCC01细胞，并且使用浓度为50、100、500、1,000和2,000nM的实施例12的化合物之外，在与实验例6相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图27所示，浓度为50nM的实施例12的化合物抑制大部分LRRK2蛋白磷酸化。
因此，再次证实，即使在低nM浓度下，根据本发明的化合物也显著抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例19>评价动物模型中化合物对脑肿瘤细胞的生长抑制活性-(2)
进行实验以评估根据本发明的实施例的化合物在动物模型中是否对脑肿瘤细胞显示出生长抑制活性。具体地，除了使用448T细胞代替NCC01细胞，并且以60mg/kg的剂量口服施用实施例12、20和21中的每一个的化合物之外，在与实验例14相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图28所示，在未用化合物处理的空白对照组中注射448T细胞的位置处形成肿瘤，但在口服施用实施例12、20和21的化合物的组中未观察到肿瘤。
因此，再次证实，根据本发明的实施例的化合物显著抑制动物模型中源自脑肿瘤细胞的肿瘤的形成。
<实验例20>评价实施例和比较例的化合物的LRRK2蛋白磷酸化抑制活性(体外)
进行实验以评价比较例的化合物(已知作为LRRK2蛋白抑制剂)的体外药效。具体地，除了使用448T细胞代替NCC01细胞，并使用实施例1、11和12的化合物之外，在与实验例16相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图29所示，与根据本发明的实施例1、11和12的化合物不同，已知比较例的化合物抑制LRRK2蛋白表达，但不抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<制剂实施例1>药物制剂的制备
1-1.粉末剂的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
100mg乳糖
10mg滑石粉
通过混合上述组分并将混合物置于气密袋中来制备粉末剂。
1-2.片剂的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
100mg玉米淀粉
100mg乳糖
2mg硬脂酸镁
通过混合上述组分并按照常规的片剂制备方法将混合物压片来制备片剂。
1-3.胶囊的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
100mg玉米淀粉
100mg乳糖
2mg硬脂酸镁
通过混合上述组分并根据常规的胶囊制备方法将混合物置于明胶胶囊中来制备胶囊。
1-4.注射剂的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
适量的注射用无菌蒸馏水
适量的pH调节剂
根据常规的注射剂制造方法，使用每安瓿(2ml)的上述量的组分来制备注射剂。
1-5.液体剂的制备
100mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
10g异构化糖
5g甘露醇
适量的纯净水
按照常规的液体制备方法，通过将上述组分溶解在纯净水中，加入适量柠檬香料，混合上述组分，加入纯净水使总体积为100ml，将所得混合物置于棕色瓶中并进行灭菌来制备液体剂。
<110> 大邱庆北尖端医疗产业振兴财团(Daegu-Gyeongbuk Medical InnovationFoundation)
国立癌中心(NATIONAL CANCER CENTER)
三星生命公益财团(SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION)
<120> 含有能够穿透血脑屏障的化合物作为预防或治疗脑癌的有效成分的药物组合物
<130> 2018FPO-01-010_PCT
<150> KR 10-2017-0024812
<151> 2017-02-24
<160> 35
<170> KoPatentIn 3.0
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<223> luciferase shRNA
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具体实施方式
图1是显示从脑肿瘤患者获得的癌组织中LRRK2蛋白表达的蛋白印迹结果的图像。
图2是显示LRRK2蛋白磷酸化与脑肿瘤恶性之间相关性的评价结果的图像。
图3是显示编码脑肿瘤细胞中表达的LRRK2蛋白的核酸序列的分析结果的图像。
图4a示意性地显示了表达LRRK2蛋白的慢病毒载体的结构。
图4b是显示用表达LRRK2蛋白的慢病毒载体感染的细胞中LRRK2蛋白过表达的图像。
图4c是显示用表达LRRK2蛋白的慢病毒载体感染的细胞中肿瘤细胞的自我更新的图像。
图5a是显示用实施例10、11、12、20和21的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图5b是显示用实施例11、12、20、21和22的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图6是显示用实施例10、11、12、20和21的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图。
图7和8是显示用各种浓度的实施例10的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图9和10是显示用各种浓度的实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图11和12是显示用浓度为100nM的实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞后蛋白印迹随时间变化结果的图像。
图13至15是显示用浓度范围为50nM至2,000nM的实施例12的化合物处理NCC01细胞后1天的蛋白印迹结果的图像。
图16是显示通过使用实施例12的化合物抑制线粒体活性而诱导的脑肿瘤细胞死亡的图像。
图17是显示使用实施例12的化合物抑制脑肿瘤干细胞中存在的线粒体活性的图像。
图18是显示通过使用实施例12的化合物抑制TRAP1表达来抑制线粒体活性的图像。
图19a是显示由暴露于缺氧条件的NCC01细胞形成的球体的生长被针对LRRK2基因的shRNA抑制的图像。
图19b是显示暴露于缺氧条件下的NCC01细胞中LRRK2蛋白表达的蛋白印迹结果的图像。
图19c是显示由暴露于缺氧条件的528NS细胞形成的球体的生长被针对LRRK2基因的shRNA抑制的图像。
图19d是显示在暴露于缺氧条件下的528NS细胞中LRRK2蛋白表达的蛋白印迹结果的图像。
图20和21是显示在用浓度为100nM的实施例11、12和21的化合物处理NCC01细胞后1天的细胞周期FACS的评价结果的图像。
图22是显示将实施例12的化合物口服给药至脑肿瘤诱导的小鼠模型后的存活天数变化的观察结果的图像。
图23是显示将实施例12的化合物口服给药至脑肿瘤诱导的小鼠模型后肿瘤大小变化的测量结果的图像。
图24是显示当实施例12的化合物与安维汀联合给药时对脑肿瘤的治疗效果增加的图像。
图25是显示用比较例的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图26是显示用实施例10、11、12、20和21的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图27是显示用各种浓度的实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞时的蛋白印迹结果的图像。
图28是显示将实施例12、20和21的化合物口服给药至脑肿瘤诱导的小鼠模型后的存活天数变化的观察结果的图像。
图29是显示用比较例的化合物和实施例1、11和12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞时的蛋白印迹结果的图像。
最佳实施方式
在下文中，将给出本发明的详细描述。
本发明涉及一种用于预防或治疗脑癌的药物组合物，其含有LRRK2(富亮氨酸重复激酶-2)蛋白抑制剂作为活性成分。
在一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式1表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式1]
在化学式1中，
R1为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-10直链或支链烷基、C1-10直链或支链烷氧基、C1-5直链或支链烷基氨基、或C1-5直链或支链二烷基氨基；
R2为-H、-OH、卤素、硝基、腈、或未取代的或至少一个卤素取代的C1-10直链或支链烷基，或与R3连接形成含有至少一个N的未取代的、取代的或稠合的5-至8-元环杂环烷基，或形成含有至少一个N的未取代或取代的5-或6-元环杂芳基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基和所述取代的5-或6-元环杂芳基各自独立地为由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基和5-或6-元环杂芳基：-OH、＝O、卤素和C1-5直链或支链烷基，以及
所述稠合的5-至8-元环杂环烷基为与未取代的C6-10芳基稠合的5-至8-元杂环烷基；
R3为–H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-10直链或支链烷基、C1-10直链或支链烷氧基、C1-5直链或支链烷基氨基、C1-5直链或支链二烷基氨基、C1-5直链或支链烷基磺酰基C6-10芳基氨基、或C1-5直链或支链烷基磺酰基氨基C6-10芳基氨基，或与R2连接形成含有至少一个N的未取代的、取代的或稠合的5-至8-元环杂环烷基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基独立地为由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基：-OH、＝O、卤素和C1-5直链或支链烷基；以及
所述稠合的5-至8-元环杂环烷基为与未取代的C6-10芳基稠合的5-至8-元环杂环烷基；以及
Y为
其中R4、R5和R6独立地为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-10直链或支链烷基、C1-10直链或支链烷氧基、含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基羰基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基为由C1-5直链或支链二烷基氨基取代的5-至8-元环杂环烷基，或含有至少一个N且由至少一个C1-5直链或支链烷基取代的6-元环杂环烷基，以及
R7、R8和R9独立地为-H、-OH、卤素、硝基、腈、未取代的或至少一个羟基取代的C1-10直链或支链烷基，或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，
其中所述取代的5-至8-元环杂环烷基为由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基：-OH、＝O、卤素和含O的4-或5-元环未取代的杂环烷基。
优选地，
R1为-H或-NH(CH3)；
R2为-H、卤素或-CF3，或与R3连接形成
R3为-H、-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、
Y为
其中R4、R5和R6独立地为-H、甲氧基、卤素、
R7、R8和R9独立地为-H、甲基、卤素、
更优选地，由化学式1表示的化合物选自以下化合物中的任何一种：
(1)5-氯-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)-N2-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺；
(2)N-(2-(2-(3-氯-4-甲氧基苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)甲磺酰胺；
(6)(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)甲酮；
(8)N4-乙基-N2-(1-(3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(三氟甲基))嘧啶-2,4-二胺；
(10)2-[(2-甲氧基-4-[[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基]苯基)氨基]-5,11-二甲基-5,11-二氢-6H嘧啶并[4,5-b][1,4]苯并二氮杂-6-酮；
(11)(4-(4-(乙基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-2-氟-5-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮；
(12)(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉代)甲酮；
(14)1-(5-氯-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙-2-醇；和
(16)N2-(5-氯-1-((3S,4R)-3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)-N4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式2表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式2]
在化学式2中，
L1和L2独立地为-O-、-CH2-、-NH-或-S-；
A1为未取代的或取代的C3-10环烷基，其中所述取代的C3-10环烷基为由以下至少一种取代基取代的C3-10环烷基：-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基和C1-5直链或支链烷氧基；
A2为含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的或取代的5-或6-元环杂芳基，其中所述取代的5-或6-元环杂芳基为由以下至少一种取代基取代的5-或6-元环杂芳基：-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基和C1-5直链或支链烷氧基；以及
A3、A4和A5独立地为-H、C1-5直链或支链烷基或C1-5直链或支链烷氧基。
优选地，L1和L2独立地为-CH2-、-NH-或-S-；
A1为
A2为
A3、A4和A5独立地为-H或甲基。
优选地，由化学式2表示的化合物为选自以下化合物中的任何一种：
(7)(S)-3-(环丙基硫基)-7-甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢噻吩并[3,4-c]吡啶-4(5H)-酮；和
(9)3-(环戊基硫代)-6,6-二甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢苯并[c]噻吩-4(5H)-酮。
在又一实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂为由以下化学式3表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式3]
在化学式3中，
L3不存在，或为-NH-或-O-；
L4为N或C；
E1为-H、-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；
当L4为N时，E2不存在，或者当L4为C时，E2为E5为C1-5直链或支链烷基；
E3为-H、-OH、卤素、腈、硝基、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、未取代的或取代的C6-10环烷基、或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，其中所述取代的C6-10环烷基和取代的5-至8-元环杂环烷基独立地为由以下至少一种取代基取代的C6-10环烷基和5-至8-元环杂环烷基：-OH、卤素、C1-3直链或支链烷基、C1-3直链或支链烷氧基；以及
E4为含有至少一个N的未取代的或取代的6-至8-元环杂环烷基羰基C1-5直链或支链烷基，或含有至少一个N的未取代的或取代的6-至8-元环杂芳基，
其中所述取代的6-至8-元环杂环烷基和取代的6-至8-元环杂芳基独立地由C6-10芳基取代，或由含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的6-元环杂环烷基取代，
所述取代的6-元环杂环烷基为由-OH、卤素或未取代的或至少一个卤素取代的C1-5直链或支链烷基取代的6-元环杂环烷基。
优选地，L3不存在，或为-NH-或-O-；
L4为N或C；
E1为-H或甲基；
当L4为N时，E2不存在，或者当L4为C时，E2为
E3为-H、
E4为
更优选地，由化学式3表示的化合物为选自以下化合物组中的任何一种：
(3)(R)-3-(4-(环己基氨基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)-1-(3-苯基哌啶-1-基)丙-1-酮；
(5)4-(4-(6-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-4-基氧基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)吡啶-2-基)吗啉；
(18)3-(6-(4-(2-氟乙基)哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)-5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑；和
(20)(2S,6R)-2,6-二甲基-4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)吗啉。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式4表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式4]
在化学式4中，
α为-CH＝或-N＝；
G1为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、或含有至少一个N的未取代的或取代的5-至8-元环杂芳基氨基，
其中所述取代的5-至8-元环杂芳基为由-OH、卤素或C1-3直链或支链烷基取代的5-至8-元环杂芳基；
G2为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、未取代的或取代的C6-10芳基、或含有至少一个选自N和O的杂原子的未取代的或取代的5-至8-元环杂环烷基，
其中所述取代的C 6-10芳基和取代的5-至8-元环杂环烷基独立地为C6-10芳基和由以下至少一种取代基取代的5-至8-元环杂环烷基：C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、和含有N和O的6-元环未取代的杂环烷基C1-3直链或支链烷基；以及
G3为-H、-OH、卤素、硝基、腈、C1-5直链或支链烷基、C1-5直链或支链烷氧基、未取代的或至少一个腈取代的C6-10芳基、或含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的或取代的5-至10-元环杂芳基，
其中所述取代的5-至10-元环杂芳基为由以下至少一种取代基取代的5-至10-元环杂芳基：卤素、C1-5直链或支链烷基和腈。
优选地，
G1为-H或
G2为
G3为腈、
更优选地，由化学式4表示的化合物为选自以下化合物中的任何一种：
(19)6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-4-(3-甲基-4-(吗啉代甲基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲腈；
(21)3-(4-吗啉代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲腈；和
(22)1-甲基-4-(4-吗啉代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-1H-吡咯-2-甲腈。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式5表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式5]
在化学式5中，
M1为未取代的或至少一个卤素取代的C6-10芳基；
M2为含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的6-至8-元环杂芳基；以及
M3为含有至少一个选自N、O和S的杂原子的未取代的6-至8-元环杂环烷基。
优选地，由化学式5表示的化合物为以下化合物：
(4)2-(4-氟苄氧基)-5-(1-(2-吗啉代乙基)-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺。
在另一个实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式6表示的化合物，其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式6]
在化学式6中，
Q1为-H、氨基、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；
Q2为-H、或未取代的C6-10环烷基；
Q3为-H、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；以及
Q4为含有至少一个N的甲基取代的5-元环杂芳基。
优选地，由化学式6表示的化合物为以下化合物：
(13)(R)-4-(1-环丙基乙基氨基)-7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-噌啉-3-甲酰胺。
在又一实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂可为由以下化学式7表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式7]
在化学式7中，
T1为-H、C1-5直链或支链烷基、或未取代的C3-8环烷基羰基。
优选地，由化学式7表示的化合物为以下化合物：
(15)环丙基[10,11,14,15-四氢-1,16-乙烯-4,8-(亚甲基)吡唑[3,4-j][1,4,7,9]氧杂三氮杂环己烷-12(13H)-基]甲酮。
在又一实施方案中，LRRK2蛋白抑制剂为由以下化学式8表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[化学式8]
在化学式8中，
Z1为-H、氨基、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基；
Z2为含有至少一个N并由C1-5直链或支链烷基取代的5-至8-元环杂芳基；以及
Z3为-H、C1-5直链或支链烷基、或C1-5直链或支链烷氧基。
优选地，由化学式8表示的化合物为以下化合物：
(17)(4-(6-氨基-5-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)吡啶-3-基)-2-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮。
根据本发明，药物组合物可用于治疗脑癌，尤其是这样的脑癌：其中表达或激活LRRK2蛋白。LRRK2蛋白活性可通过LRRK2蛋白的磷酸化来表现。
根据本发明，LRRK2蛋白抑制剂可以以其药学上可接受的盐的形式使用。这里，有用的盐可为使用药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐。
酸加成盐可获自无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸、亚磷酸等，无毒有机酸例如脂肪族单-和二羧酸酯、苯基取代的链烷酸酯、羟基链烷酸酯和链烷二酸酯、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等，或有机酸如乙酸、苯甲酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、葡萄糖酸、甲磺酸、4-甲苯磺酸、酒石酸，富马酸等。药学上无毒的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐(decanoate)、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐(caprate)、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二油酸盐、己烷-1,6-二油酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、羟苯酸盐、甲苯基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐，β-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
根据本发明的酸加成盐可以通过常规方法制备，例如，通过将LRRK2蛋白抑制剂衍生物溶解在有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷或乙腈中，并向其中加入有机酸或无机酸以获得沉淀物，然后将沉淀物过滤并干燥，或者将溶剂和过量的酸进行真空蒸馏、干燥，然后在有机溶剂存在下结晶。
另外，根据本发明的LRRK2蛋白抑制剂可使用碱以药学上可接受的金属盐的形式制备。具体地，碱金属或碱土金属盐可通过以下方法获得：例如将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤未溶解的化合物盐，并将滤液蒸发至干。这里，钠盐、钾盐或钙盐作为金属盐是药学上合适的。此外，相应的盐可通过使碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应来获得。
在根据本发明的药物组合物中，LRRK2蛋白抑制剂、其光学异构体或其药学上可接受的盐可在临床给药时以各种剂型口服或肠胃外给药。其制剂可使用常用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制备。
用于口服给药的制剂的实例包括片剂、丸剂、硬/软胶囊、液体、悬浮液、乳液、糖浆、颗粒、酏剂、锭剂等。除了活性成分外，这些制剂可含有稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)或润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。片剂可含有粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷等，并且可任选地含有崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或沸腾混合物，吸收剂，着色剂，调味剂和甜味剂。
此外，本发明涉及一种用于预防或治疗脑癌的药物试剂盒，包括含有药学有效量的LRRK2蛋白抑制剂作为活性成分的第一组分和含有药学有效量的安维汀作为活性成分的第二组分。
在根据本发明的用于预防或治疗脑癌的药物试剂盒中，第一组分和第二组分可依次或同时施用。当依次施用第一组分和第二组分时，可在施用第一组分之前或之后30分钟至180分钟、60分钟至120分钟或80分钟至100分钟施用第二组分。在本发明的一个实施方案中，可在施用第一组分后90分钟施用第二组分。
当同时施用包含在药物试剂盒中的第一组分和第二组分时，可增加针对脑癌的抗癌活性。上述施用可包括施用给哺乳动物，特别是人。
此外，本发明涉及一种治疗脑癌的方法，包括向受试者施用LRRK2蛋白抑制剂。
LRRK2蛋白可具有上述特性，省略其详细描述。受试者可为哺乳动物，尤其是人。
根据本发明的药物组合物，含有LRRK2蛋白抑制剂、其光学异构体或其药学上可接受的盐作为活性成分，可以肠胃外给药，肠胃外给药的实例包括皮下注射、静脉注射、肌内注射和胸腔内注射。
这里，为了制备用于肠胃外给药的制剂，将LRRK2蛋白抑制剂、其光学异构体或其药学上可接受的盐与水、以及稳定剂或缓冲剂混合，得到溶液或悬浮液，将溶液或悬浮液以安瓿或小瓶单位剂型制备。该组合物可被灭菌，并且可进一步含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、水合或乳化促进剂、用于控制渗透压的盐和缓冲剂，以及其他治疗上有用的物质，并且可通过常规混合、制粒或涂层配制。
此外，根据本发明的包含LRRK2蛋白抑制剂、其旋光异构体或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物的剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、剂型、健康状况和疾病严重程度而变化，并且以体重70kg的成年患者计通常为0.1至1000mg/天，优选1至500mg/天，此外，可以按照医生或药剂师的规定每天施用一次或以规定的时间间隔施用多次。
此外，本发明涉及一种治疗脑癌的方法，包括向受试者施用LRRK2蛋白抑制剂以及向受试者施用安维汀。
LRRK2蛋白可具有上述特征，省略其详细描述。
在根据本发明的治疗脑癌的方法中，可以依次或同时施用LRRK2蛋白抑制剂和安维汀。当依次施用LRRK2蛋白抑制剂和安维汀时，可以在施用LRRK2蛋白抑制剂之前或之后30分钟至180分钟、60分钟至120分钟或80分钟至100分钟施用安维汀。在本发明的一个实施方案中，可以在施用LRRK2蛋白抑制剂后90分钟施用安维汀。
当同时施用LRRK2蛋白抑制剂和安维汀时，可以增加针对脑癌的抗癌活性。上述施用可包括施用给哺乳动物，特别是人。
此外，本发明涉及LRRK2蛋白抑制剂在制备用于治疗脑癌的药物组合物中的用途。
本发明人首先证明LRRK2蛋白抑制剂通过轻易穿透一般药物难以通过的血脑屏障而有效地显著抑制肿瘤形成。其实验结果将通过以下实验例详细描述。
实施例
通过以下实施例和实验例将更好地理解本发明。
这里，实施例和实验例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明。
<实施例1>制备5-氯-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)-N2-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺
参考WO 2004080980、WO 2005016894、WO 2009102446、WO 2012019132或WO2015077602制备上述化合物。
<实施例2>制备N-(2-(2-(3-氯-4-甲氧基苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)甲磺酰胺
参考WO 2009127642制备上述化合物。
<实施例3>制备(R)-3-(4-(环己基氨基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)-1-(3-苯基哌啶-1-基)丙-1-酮
参考WO2010106333制备上述化合物。
<实施例4>制备2-(4-氟苄氧基)-5-(1-(2-吗啉代乙基)-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺
参考WO 2011038572制备上述化合物。
<实施例5>制备4-(4-(6-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-4-基氧基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-基)吡啶-2-基)吗啉
参考WO 2011141756制备上述化合物。
<实施例6>制备(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)甲酮
参考WO 2011151360制备上述化合物。
<实施例7>制备(S)-3-(环丙基硫基)-7-甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢噻吩并[3,4-c]吡啶-4(5H)-酮
参考WO 2012058193制备上述化合物。
<实施例8>制备N4-乙基-N2-(1-(3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(三氟甲基))嘧啶-2,4-二胺
参考WO 2012062783制备上述化合物。
<实施例9>制备3-(环戊基硫代)-6,6-二甲基-1-(1H-吡唑-3-基)-6,7-二氢苯并[c]噻吩-4(5H)-酮
参考WO2012118679制备上述化合物。
<实施例10>制备2-[(2-甲氧基-4-[[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基]苯基)氨基]-5,11-二甲基-5,11-二氢-6H嘧啶并[4,5-b][1,4]苯并二氮杂-6-酮
参考WO 2010080712或WO 2015176010制备上述化合物。
<实施例11>制备(4-(4-(乙基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-2-氟-5-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮
参考WO 2011151360制备上述化合物。
<实施例12>制备(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉代)甲酮
12-1.制备(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉 代)甲酮
参考WO 2011151360制备上述化合物。
12-2.制备(3-甲氧基-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)苯基)(吗啉 代)甲酮
步骤1.将2,4-二氯-5-碘嘧啶(1.0当量)溶解在THF中，然后在0℃下加入甲胺(在EtOH中3.5wt％，1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌2小时，从中除去溶剂，得到的产物无需进一步纯化即可用于后续步骤(产率：100％)。
步骤2.用氮气吹扫双颈圆底烧瓶，并向其中放入CuI(5.0当量)和KF(5.0当量)。将所得混合物加热至150℃，然后在减压下搅拌2小时。反应后，将温度降至室温，并使用注射器添加在氮气下溶解在DMF/NMP(1：1)中的三甲基(三氟甲基)硅烷(5.0当量)。反应30分钟后，用注射器添加溶解在DMF/NMP(1：1)中的2-氯-5-碘-N-甲基嘧啶-4-胺(1.0当量)，并在50℃下反应18小时。反应后，向所得产物中加入水，形成沉淀，然后滤出沉淀。使用EtOAc(x3)从由此获得的滤液中萃取有机物质。将合并的有机层用盐水洗涤，并使用Na2SO4除去剩余的水。使用MPCL(EtOAc：Hex)纯化脱水后的混合物，从而获得黄色固体即为目标化合物(产率：70％)。
步骤3.将2-氯-N-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(1.0当量)和(4-氨基-3-甲氧基苯基)(吗代代)甲酮(1.0当量)溶于二恶烷中，并在室温下加入对甲苯磺酸(1.0当量)。将所得混合物在100℃下搅拌16小时并冷却至室温，从中除去溶剂，然后向其中加入冰水。使用EtOAc(x3)萃取有机物质。将合并的有机层用盐水洗涤，并使用Na2SO4除去剩余的水。使用MPCL(EtOAc：Hex)纯化脱水后的混合物，从而获得白色固体即为目标化合物(产率：70％)。
<实施例13>制备(R)-4-(1-环丙基乙基氨基)-7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-噌啉-3-甲酰胺
参考WO2012162254制备上述化合物。
<实施例14>制备1-(5-氯-4-(4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基氨基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙-2-醇
参考WO 2012062783制备上述化合物。
<实施例15>制备环丙基[10,11,14,15-四氢-1,16-乙烯-4,8-(亚甲基)吡唑[3,4-j][1,4,7,9]氧杂三氮杂环己烷-12(13H)-基]甲酮
参考WO 2013046029制备上述化合物。
<实施例16>制备N2-(5-氯-1-((3S,4R)-3-氟-1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)-N4-甲基-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺
参考药物化学杂志(Journal of Medicinal Chemistry)(2014)，57(3)，921-936制备上述化合物。
<实施例17>制备(4-(6-氨基-5-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)吡啶-3-基)-2-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮
参考WO2014106612制备上述化合物。
<实施例18>制备3-(6-(4-(2-氟乙基)哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)-5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑
参考WO 2014137723制备上述化合物。
<实施例19>制备6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-4-(3-甲基-4-(吗啉代甲基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲腈
参考WO 2014170248制备上述化合物。
<实施例20>制备(2S,6R)-2,6-二甲基-4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1H-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)吗啉
参考WO 2014137723制备上述化合物。
<实施例21>制备3-(4-吗啉代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲腈
参考WO 2015092592制备上述化合物。
<实施例22>制备1-甲基-4-(4-吗啉代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-1H-吡咯-2-甲腈
参考USA20140005183A1制备上述化合物。
实施例1至22中制备的化合物的结构示于下表1中。
[表1]
<比较例>制备2-甲基-2-[3-甲基-4-[[4-(甲胺基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基]吡唑-1-基]丙腈
参考WO 2012062783制备题述化合物。
<实验例1>评价脑肿瘤患者的癌干细胞中LRRK2蛋白表达
为了评价使用LRRK2蛋白作为用于治疗脑肿瘤的靶蛋白的可能性，使用从19个脑肿瘤患者获得的癌组织进行蛋白印迹，从而测定LRRK2蛋白表达。
具体地，从脑肿瘤患者获得癌组织，并进行蛋白印迹以测定LRRK2蛋白表达。结果如图1所示。
如图1所示，LRRK2蛋白在从脑肿瘤患者获得的癌组织中表达，并且表达水平随着脑肿瘤恶性的增加而升高。因此，证实LRRK2蛋白可用作治疗脑肿瘤的靶标。
<实验例2>评价由于LRRK2蛋白磷酸化引起的脑肿瘤患者的预后
LRRK2蛋白通过磷酸化显示其活性。因此，测量了由脑肿瘤细胞中LRRK2蛋白磷酸化引起的脑肿瘤患者预后的变化。
具体地，从约200名3期和4期脑肿瘤患者获得组织样品，并通过免疫染色测量所获得的组织样品中磷酸化LRRK2蛋白的表达。
如图2所示，LRRK2蛋白磷酸化随着脑肿瘤恶性增加而增加，即随着脑肿瘤从三期进展到四期而增加。因此，证实磷酸化的LRRK2蛋白可用作治疗高恶性脑肿瘤的靶蛋白。
<实验例3>LRRK2蛋白突变与脑肿瘤之间的相关性
根据常规研究，已经报道了多种癌可由LRRK2蛋白中发生的突变引起，还报道了已知与LRRK2蛋白相关的帕金森病也是由LRRK2蛋白突变引起的。因此，评价了在上述实验例中证实在脑肿瘤细胞中过表达的LRRK2蛋白是否是其突变体。具体地，使用从下表2中所示的引物，使用从5名患者获得的脑肿瘤细胞进行测序。
[表2]
如图3所示，除了已知的单核苷酸多态性(SNP)之外，编码脑肿瘤细胞中表达的LRRK2蛋白的核酸序列没有特异性突变，例如帕金森氏病中常见的突变。因此，证实了与帕金森病或其他类型的癌症不同，脑肿瘤是由过表达野生型LRRK2蛋白引起的，从而导致癌症。
<实验例4>评价由于LRRK2蛋白过表达引起的致肿瘤性
为了评价脑肿瘤是否是由实验例3中证实的LRRK2蛋白过表达引起的，制备了含有编码LRRK2蛋白的多核苷酸的慢病毒载体(pLenti CMV GFP DEST(736-1)，Addgene#19732)，并用其感染528NS、464T(韩国三星首尔医院)和离体细胞系以形成肿瘤。此处，用不表达LRRK2蛋白的慢病毒载体感染细胞作为对照。
如图4的结果所示，与对照相比，在用表达LRRK2蛋白的慢病毒感染的528NS、464T或离体细胞系中，GSC(神经胶质瘤干细胞)球体的大小增加。因此，证实LRRK2蛋白过表达导致肿瘤。
<实验例5>评价化合物的LRRK2蛋白磷酸化抑制活性(体外)-(1)
为了评价体外药物功效，使用脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞进行蛋白印迹实验。
更具体地，用浓度为100nM或1,000nM的实施例10、11、12、20、21和22中的每一个的化合物处理7.5×105至1.0×106NCC01细胞，1天后，收集样品并通过蛋白印迹评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组(vehicle)。结果显示在图5和6中。
如图5和6所示，与空白对照组相比，根据本发明的实施例10、11、12、20、21和22的化合物显著抑制脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞中的LRRK2蛋白磷酸化。
因此，证实了本发明的化合物抑制了在脑肿瘤患者来源的细胞系中表达的LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例6>根据化合物浓度评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)-(1)
为了具体确定表现出高效力的本发明实施例的化合物的浓度，以与实验例1中评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性相似的方式进行本实验。
更具体地，用浓度为0.5、1、5、10、50和100nM的实施例10和12中的每一个的化合物处理7.5×105至1.0×106个NCC01细胞，1天后，收集样品并通过蛋白印迹评价LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图7到10中。
如图7至10所示，当使用浓度为100nM的实施例10的化合物时，检测到磷酸化的LRRK2蛋白，但实施例12的化合物在50和100nM的浓度下主要抑制LRRK2蛋白磷酸化。
因此，证实了即使在低nM浓度下，本发明的化合物也显著抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例7>根据处理时间评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)
为了评价在用本发明实施例的化合物处理后本发明化合物的活性随时间的变化，以与实验例1中评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性相似的方式进行本实验。
更具体地，用浓度为100nM的实施例12的化合物处理7.5×105至1.0×106个NCC01细胞，并且在1天、4天和8天后，收集样品并通过蛋白印迹评价LRRK2蛋白磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图11和12中。
如图11和12所示，在用实施例12的化合物处理脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞后1天，LRRK2蛋白磷酸化的程度急剧降低，并且其降低随时间持续。
因此，证实了本发明实施例的化合物长时间连续地抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例8>评价由于抑制LRRK2蛋白磷酸化引起的细胞内信号传导途径变化(体外)
进行实验以确定根据本发明实施例的化合物对癌干细胞生长的细胞内信号传导途径的影响。
更具体地，用浓度为50、100、500、1,000和2,000nM的实施例12的化合物处理1.0×106个NCC01细胞。1天后，收集样品并通过蛋白印迹测量NESTIN蛋白的表达，所述NESTIN蛋白是参与细胞内信号传导途径的癌干细胞标记物。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图13至15中。
如图13至15所示，实施例12的化合物抑制NCC01细胞中的LRRK2蛋白磷酸化，LRRK2蛋白磷酸化也以依赖于所用化合物浓度的方式降低。
因此，证实了根据本发明实施例12的化合物抑制来自脑肿瘤患者的细胞中LRRK2-蛋白介导的信号传导，从而降低参与肿瘤干细胞生长的NESTIN蛋白的表达，进而抑制细胞生长。
<实验例9>通过抑制LRRK2蛋白活性评价线粒体功能的变化
LRRK2蛋白位于线粒体的外膜中，据报道其参与线粒体的***和其膜电位的调节。因此，进行实验以确定抑制LRRK2蛋白的实施例的化合物对线粒体功能的影响。
具体地，用1μM的实施例12的化合物处理NCC01细胞，1天后，向其中加入TMRE(四甲基罗丹明乙酸酯)染料以染色活化的线粒体，以评价线粒体功能的变化。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作对照组。用显微镜观察染色结果，并示于图16中。
如图16所示，对照组的细胞中线粒体的活性保持，从而TMRE染料的颜色显得清晰。然而，在用实施例12的化合物处理的细胞中，TMRE染料的显色程度降低，此外，细胞中核发生***。因此，证实了根据本发明的实施例12的化合物抑制线粒体活性，从而影响脑肿瘤细胞的死亡。
<实验例10>评价脑肿瘤干细胞系中LRRK2蛋白磷酸化抑制活性
进行实验以评价干细胞的凋亡是否是通过抑制已知与肿瘤转移相关的肿瘤干细胞中的LRRK2蛋白磷酸化而诱导的。
具体地，用浓度为0.1或1μM的实施例12的化合物处理脑肿瘤干细胞系NCC01细胞，1天后，如实验例9中所述对线粒体进行染色以测定其功能的变化。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。用显微镜观察染色结果，并示于图17中。
如图17所示，与对照组相比，在用实施例12的化合物处理的组中，脑肿瘤干细胞中存在的线粒体的活性受到抑制。因此，证实了根据本发明的化合物抑制线粒体活性，从而诱导脑瘤干细胞的死亡，进而抑制肿瘤转移。
<实验例11>评价脑肿瘤干细胞系中LRRK2蛋白抑制剂的TRAP1表达抑制活性
进行实验以评价根据本发明的LRRK2蛋白抑制剂是否对TRAP1(TNF受体相关蛋白1)的表达变化有影响，LRRK2蛋白抑制剂如实验例10中所证实的抑制脑肿瘤干细胞系中的线粒体活性，TRAP1已知参与线粒体功能调节。
具体地，将浓度为100或1,000nM的实施例12的化合物加入脑肿瘤干细胞系NCC01细胞，1天后，通过蛋白印迹测量TRAP1表达的变化。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。
如图18所示，TRAP1的表达被实施例12的化合物抑制。因此，证实了根据本发明的化合物抑制TRAP1的表达，从而抑制线粒体活性。
<实验例12>评价缺氧条件下LRRK2蛋白表达的变化
传统研究表明，缺氧条件在GSC的功能中很重要。因此，测量了在缺氧条件下LRRK2蛋白表达的变化和在抑制LRRK2蛋白表达时GSC球体的大小的变化。
具体地，将NCC01和528NS细胞暴露于缺氧条件并用针对LRRK2基因的两种shRNA处理，之后测量球体大小的变化。此处，对照是针对荧光素酶的shRNA(shNT)。
[表3]
如图19所示，与对照相比，暴露于缺氧条件的NCC01(a和b)和528NS(c和d)细胞的球体大小增加，但是被LRRK2 shRNA-1和LRRK2 shRNA-2抑制，LRRK2 shRNA-1和LRRK2shRNA-2是两种针对LRRK2基因的shRNA。因此，证实通过抑制LRRK2蛋白表达抑制了在缺氧条件下产生的GSC的生长。
<实验例13>评价通过抑制LRRK2蛋白磷酸化的凋亡诱导活性(体外)
为了评价脑肿瘤细胞的凋亡是否通过抑制LRRK2蛋白磷酸化诱导，使用FACS(荧光激活细胞分拣术)进行实验。
更具体地，用浓度为100nM的实施例11、12和21中的每一个的化合物处理7.5×105至1.0×106个NCC01细胞，1天后，收集样品并进行FACS，从而测定凋亡诱导活性。将未用实施例的化合物处理的组用作对照组。结果显示在图20和21中。
如图20和21所示，实施例11、12和21的化合物诱导NCC01细胞的凋亡。特别地，实施例12的化合物显示出比实施例11和21的化合物的高约3倍的凋亡率，表明与其他实施例的化合物相比，根据本发明的实施例12的化合物在诱导细胞凋亡方面非常有效。
<实验例14>评价动物模型中化合物对脑肿瘤细胞的生长抑制活性-(1)
进行实验以评估根据本发明的实施例的化合物在动物模型中是否对脑肿瘤细胞显示出生长抑制活性。
更具体地，将1.0×104个NCC01细胞(脑肿瘤患者来源的细胞系)注射到Balb/c-裸鼠模型的脑中，3天后，以10mg/kg或60mg/kg的剂量口服施用实施例12的化合物。在施用化合物后，基于存活期测定小鼠的存活率，并使用MRI测量小鼠中产生的肿瘤的大小。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果显示在图22和23中。
如图22所示，在空白对照组中小鼠的平均存活期为54天，在以10mg/kg口服施用实施例12的化合物的组中小鼠的平均存活期为71天，并且在以60mg/kg口服施用实施例12的化合物的该组中所有小鼠存活多至100天(空白对照组对10mg/kg：p＝0.032，空白对照组对60mg/kg：p<0.001)。
如图23所示，在未用化合物处理的空白对照组中注射NCC01细胞的位置处形成肿瘤，但在以10mg/kg或60mg/kg口服施用实施例12的化合物的组中未观察到肿瘤。
因此，证实了根据本发明的实施例的化合物显着抑制了动物模型中源自脑肿瘤细胞的肿瘤的形成。
<实验例15>评价联合施用化合物和安维汀时对脑肿瘤的治疗效果
当将根据本发明的实施例的化合物与作为治疗脑肿瘤药物的安维汀联合施用时，进行实验以确定动物模型中的治疗效果。
更具体地，使用5周龄Balb/c裸鼠制造原位小鼠模型。使用立体定位装置将脑肿瘤细胞系U87MG细胞(ATCC，USA)注射在前囟的左侧2.2mm处和前囟后0.5mm处3.5mm深处。注射细胞3天后，将小鼠分成3组，每组5只小鼠(分别为对照组(空白对照组)、施用安维汀的组、施用实施例12的化合物和安维汀的组)，并向其施用药物。以30mg/kg的剂量口服施用实施例12的化合物，并以10mg/kg的剂量腹膜内注射安维汀。此后，当小鼠显示肿瘤形成的证据，例如其总体重减少20％或更多或异常行为时，测量存活期。使用统计程序获得的存活图显示在图24中。
如图24所示，当实施例12的化合物与安维汀联合施用时，安维汀对脑肿瘤的治疗效果进一步显著增加。
<实验例16>评价比较例的化合物的LRRK2蛋白磷酸化抑制活性(体外)
使用脑肿瘤患者来源的细胞系NCC01细胞进行蛋白印迹实验，以评价比较例的化合物(已知作为LRRK2蛋白抑制剂)的体外药效。
更具体地，用比较例的化合物以0.1或1.0μM的浓度处理7.5×105至1.0×106个细胞，1天后，收集样品并通过蛋白印迹评估LRRK2蛋白磷酸化抑制活性。此处，将未用实施例的化合物处理的组用作空白对照组。结果如图25所示。
如图25所示，已知根据本发明的比较例的化合物抑制LRRK2蛋白表达，但不抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例17>评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)-(2)
使用脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞进行蛋白印迹实验，以评估体外药物功效。这里，除了使用448T细胞(韩国三星首尔医院)代替NCC01细胞，以及使用实施例10、11、12、20和21的化合物之外，在与实验例5相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图26所示，与空白对照组相比，根据本发明的实施例10、11、12、20和21的化合物显著抑制脑肿瘤患者来源的细胞系448T细胞中的LRRK2蛋白磷酸化。
因此，再次证实，根据本发明的化合物抑制在脑肿瘤患者来源的细胞系中表达的LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例18>根据化合物浓度评价化合物的LRRK2蛋白质磷酸化抑制活性(体外)-(2)
进行实验以确定能够在448T细胞中显示出高效力的根据本发明的实施例的化合物的浓度。具体地，除了使用448T细胞代替NCC01细胞，并且使用浓度为50、100、500、1,000和2,000nM的实施例12的化合物之外，在与实验例6相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图27所示，浓度为50nM的实施例12的化合物抑制大部分LRRK2蛋白磷酸化。
因此，再次证实，即使在低nM浓度下，根据本发明的化合物也显著抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<实验例19>评价动物模型中化合物对脑肿瘤细胞的生长抑制活性-(2)
进行实验以评估根据本发明的实施例的化合物在动物模型中是否对脑肿瘤细胞显示出生长抑制活性。具体地，除了使用448T细胞代替NCC01细胞，并且以60mg/kg的剂量口服施用实施例12、20和21中的每一个的化合物之外，在与实验例14相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图28所示，在未用化合物处理的空白对照组中注射448T细胞的位置处形成肿瘤，但在口服施用实施例12、20和21的化合物的组中未观察到肿瘤。
因此，再次证实，根据本发明的实施例的化合物显著抑制动物模型中源自脑肿瘤细胞的肿瘤的形成。
<实验例20>评价实施例和比较例的化合物的LRRK2蛋白磷酸化抑制活性(体外)
进行实验以评价比较例的化合物(已知作为LRRK2蛋白抑制剂)的体外药效。具体地，除了使用448T细胞代替NCC01细胞，并使用实施例1、11和12的化合物之外，在与实验例16相同的条件下以相同的方式进行实验。
如图29所示，与根据本发明的实施例1、11和12的化合物不同，已知比较例的化合物抑制LRRK2蛋白表达，但不抑制LRRK2蛋白磷酸化。
<制剂实施例1>药物制剂的制备
1-1.粉末剂的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
100mg乳糖
10mg滑石粉
通过混合上述组分并将混合物置于气密袋中来制备粉末剂。
1-2.片剂的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
100mg玉米淀粉
100mg乳糖
2mg硬脂酸镁
通过混合上述组分并按照常规的片剂制备方法将混合物压片来制备片剂。
1-3.胶囊的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
100mg玉米淀粉
100mg乳糖
2mg硬脂酸镁
通过混合上述组分并根据常规的胶囊制备方法将混合物置于明胶胶囊中来制备胶囊。
1-4.注射剂的制备
500mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
适量的注射用无菌蒸馏水
适量的pH调节剂
根据常规的注射剂制造方法，使用每安瓿(2ml)的上述量的组分来制备注射剂。
1-5.液体剂的制备
100mg本发明的LRRK2蛋白抑制剂
10g异构化糖
5g甘露醇
适量的纯净水
按照常规的液体制备方法，通过将上述组分溶解在纯净水中，加入适量柠檬香料，混合上述组分，加入纯净水使总体积为100ml，将所得混合物置于棕色瓶中并进行灭菌来制备液体剂。
<110> 大邱庆北尖端医疗产业振兴财团(Daegu-Gyeongbuk Medical InnovationFoundation)
国立癌中心(NATIONAL CANCER CENTER)
三星生命公益财团(SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION)
<120> 含有能够穿透血脑屏障的化合物作为预防或治疗脑癌的有效成分的药物组合物
<130> 2018FPO-01-010_PCT
<150> KR 10-2017-0024812
<151> 2017-02-24
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<170> KoPatentIn 3.0
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