阅读说明：本技术 加波沙朵在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用以及药物组合物 (Use of gaboxadol for the treatment of alzheimer's disease and pharmaceutical compositions ) 是由 王建枝 郑杰 于 2019-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物化学领域,具体涉及加波沙朵在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用以及药物组合物。该药物组合物含有加波沙朵以及药学上可接受的辅料。按照本发明,加波沙朵可以促进AD小鼠的海马神经元新生,降低tau蛋白的过度磷酸化及异常聚集,改善认知功能。(The present invention relates to the field of medicinal chemistry, in particular to the use of gaboxadol for the preparation of a medicament for the treatment of alzheimer's disease and a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition contains gaboxadol and pharmaceutically acceptable excipients. According to the invention, gaboxadol can promote the regeneration of hippocampal neurons of AD mice, reduce hyperphosphorylation and abnormal aggregation of tau protein, and improve cognitive function.)

加波沙朵在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用以 及药物组合物

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及加波沙朵在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用以及药物组合物。

背景技术

阿尔茨海默氏病(Alzheimer disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，是最常见的痴呆类型。现已获批准并在临床上广泛使用的抗AD药物均属于对症治疗，不能改变AD进行性恶化的疾病进程，故研发新的抗AD药物具有重大科学意义和社会意义。

4,5,6,7-四氢异恶唑并-[5,4-c]吡啶-3-醇，又名加波沙朵，是第一个以大脑突触外GABA-A受体为靶点设计的抗失眠药物，它与含delta亚基的GABA A受体亲和性较高，是其特异性激动剂。加波沙朵的结构式如式Ⅰ所示，它与传统的苯二氮类药物的作用方式不同。加波沙朵通常用于止痛药、麻醉剂、抗惊厥剂和食物抑制剂的研究之中，然而现有文献中并未有关于加波沙朵应用于阿尔茨海默氏病中的报道。

发明内容

以下对本发明的

具体实施方式

进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明的目的是提供加波沙朵的一种新的医药用途，具体地，提供加波沙朵在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用以及药物组合物。

本发明第一方面提供了加波沙朵在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用。

本发明第二方面提供了一种用于治疗阿尔茨海默氏病的药物组合物，该药物组合物含有加波沙朵以及药学上可接受的辅料。

在本发明中，所述药学上可接受的辅料可以为本领域常规使用的辅料。

在本发明中，所述药物组合物的剂型可以为本领域常规使用的固体剂型和液体剂型。在具体的实施方式中，所述药物组合物的剂型可以为片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、注射剂或混悬剂。所述药物组合物的各种剂型可通过本领域已知的方法制备。

本发明的发明人在研究过程中通过动物实验发现，加波沙朵可以有效防止AD小鼠海马神经元新生的减少，并且几乎不影响正常小鼠的海马神经元新生；可以有效降低AD小鼠海马齿状回区tau蛋白的过度磷酸化及异常聚集，并且几乎不影响正常小鼠的tau蛋白磷酸化水平；可以有效改善AD小鼠的学习和记忆功能，并且不会影响正常小鼠的认知功能。

附图说明

图1表示小鼠脑切片的观测结果；

图2表示小鼠树突长度和DCX阳性细胞数检测结果；

图3表示小鼠磷酸化tau蛋白及总tau蛋白的检测结果；

图4表示小鼠tau蛋白的异常聚集和磷酸化的检测结果；

图5表示小鼠物体-位置识别试验过程的示意图；

图6表示小鼠在物体-位置识别试验过程中的探索轨迹热图；

图7表示小鼠在物体-位置识别试验过程中对于物体B的偏好分数。

具体实施方式

实施例1

本实施例用于说明加波沙朵可以有效防止AD小鼠海马神经元新生的减少，并且几乎不影响正常小鼠的海马神经元新生。

以3转AD小鼠(APP KM670/671NL(Swedish),MAPT P301L,PSEN1 M146V)和野生型小鼠为研究对象。选取4月龄的3转AD小鼠和野生型小鼠，分别在海马齿状回注射逆转录病毒ROV-GFP，标记新生神经元。同时按3mg/kg腹腔注射溶剂(生理盐水)或加波沙朵，每2天注射一次，持续两个月。6月龄时灌流取脑，切片进行免疫组化和荧光染色，观察海马神经元新生。

脑片制备包括以下步骤：

A1：向小鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠(1.5mg/20g)进行麻醉，将麻醉后的小鼠先使用生理盐水经主动脉灌流，用量约30mL/只，灌流时间5min，然后用4重量％的多聚甲醛(溶剂为0.1M的PBS溶液)灌流进行固定，灌流完成后取脑，浸泡于4重量％的多聚甲醛中，在4℃下固定12h；

A2：依次使用20重量％和30重量％的蔗糖溶液(溶剂为0.1M的PBS溶液)进行脱水处理，每次12h；然后去除蔗糖溶液，包埋并放入-80℃冰箱内冷冻20-30min后在冰冻切片机(-20℃)中进行切片，得到厚度为50μm的矢状面切片，并按照切片顺序保存所有包含海马结构的脑片；

A3：将脑片转移至12孔板中，在4℃下PBS溶液中暂存或者在-20℃下于防冻液(体积比：PBS:乙二醇:丙三醇＝5:3:2)中长期保存。

DCX DAB染色包括以下步骤：

B1：挑取脑片，并使用PBS溶液漂洗3次，每次约5min；

B2：PBSTT打孔30min，然后使用3重量％的H₂O₂在常温避光条件下孵育30min；接着使用PBS溶液漂洗3次，每次约5min；然后在封闭液中孵育1-2h；

B3：使用DCX抗体(PBSTT稀释)在4℃下孵育12-24h，然后使用PBS溶液漂洗3次，每次约5min；使用驴抗羊IgG(结合有辣根过氧化物酶HRP)稀释液常温下孵育1h，然后使用PBS溶液漂洗3次，每次约5min；

B4：在避光条件下，使用DAB显色液显色3-8min，裱片，晾干后37℃烘烤1-2天；

B5：使用PBS溶液水化10min，使用90体积％、95体积％、100体积％酒精梯度处理，每次2min；然后使用二甲苯溶液处理两次，每次2min；待二甲苯稍微挥发后用中性树胶封片，于37℃或常温晾干；

B6：使用显微镜明场模式下进行观察。

图1是表示小鼠脑切片的观测结果。图2是表示小鼠树突长度和DCX阳性细胞数检测结果。由图1和图2可以看出，相比于野生型小鼠，AD小鼠海马神经元新生明显减少，而注射加波沙朵可以有效防止AD小鼠神经元新生的减少，并且几乎不影响正常小鼠的海马神经元新生。

实施例2

本实施例用于说明加波沙朵可有效降低AD小鼠海马齿状回区tau蛋白的过度磷酸化及异常聚集，且几乎不影响正常小鼠的tau蛋白磷酸化水平。

以3转AD小鼠和野生型小鼠为研究对象。选取4月龄的野生型小鼠和3转AD小鼠，分别按3mg/kg腹腔注射溶剂(生理盐水)或加波沙朵，每2天注射一次，持续两个月。6月龄时急性处死小鼠，取脑，分离海马组织，提取蛋白进行蛋白质印迹(WB)实验，检测磷酸化tau蛋白(p-Thr205,p-Ser396,AT8)及总tau蛋白(Tau5)。

以3转AD小鼠和野生型小鼠为研究对象。选取4月龄的野生型小鼠和3转AD小鼠，分别按3mg/kg腹腔注射溶剂(生理盐水)或加波沙朵，每2天注射一次，持续两个月。6月龄时灌流取脑，切片进行免疫组化染色检测磷酸化tau蛋白，并进行硫磺素T染色检测tau蛋白的异常聚集。

蛋白质印迹预处理过程包括以下步骤：

C1：使用6重量％的水合氯醛麻醉小鼠，接着处死并在冰上取脑，然后分离海马组织；

C2：将海马组织加入RIPA裂解液(含PMSF)充分匀浆，然后在4℃下离心30min，离心速率为12000rpm；

C3：取上清溶液1-3μL，稀释10倍后测定样品蛋白浓度，并将样品与上样缓冲液(含有2重量％的SDS，100mM二硫苏糖醇，10重量％的甘油,0.25重量％的溴酚蓝)混合，沸水浴5min后上样。

蛋白质印迹过程包括以下步骤：

D1：制备电泳胶；

D2：在蛋白样品中加入现配的溴酚蓝和β-巯基乙醇混合液沸水浴10min进行处理，其中所述混合液与所述样品的体积比为1:10；

D3：上样并通过SDS-PAGE电泳将蛋白样品分开；

D4：使用硝酸纤维素膜(NC膜)将电泳分离的蛋白进行转膜；

D5：将NC膜用含5重量％脱脂奶粉的TBS封闭液进行封闭，然后依次进行一抗孵育、二抗孵育和显色。

硫磺素T染色过程包括以下步骤：

E1：使用Tris缓冲溶液漂洗脑切片3次，每次5min；

E2：将漂洗后的脑切片在室温下与0.3重量％的硫黄素T溶液(溶剂为50体积％乙醇)孵育10min；

E3：将切片在50体积％乙醇溶液中进行脱色3次，每次5min，接着用Tris缓冲溶液漂洗，然后于DAPI共同染色10min。

图3表示小鼠磷酸化tau蛋白及总tau蛋白的检测结果。由图3可知，相比于野生型小鼠，6月龄AD小鼠海马tau蛋白水平略有升高，而加波沙朵可以显著降低tau蛋白磷酸化水平，但几乎不影响正常小鼠tau蛋白的磷酸化。

图4表示小鼠tau蛋白的异常聚集和磷酸化的检测结果。由图4可知，相比于野生型小鼠，AD小鼠海马齿状回区tau蛋白的磷酸化和异常聚集蛋白明显升高，加波沙朵可以明显降低AD小鼠的tau蛋白的异常磷酸化和聚集，并且几乎不影响正常小鼠tau蛋白的磷酸化。

实施例3

本实施例用于说明加波沙朵可有效改善AD小鼠的学习和记忆功能，且不影响正常小鼠的认知功能。

以3转AD小鼠和野生型小鼠为研究对象。选取4月龄的野生型小鼠和3转AD小鼠，分别按3mg/kg腹腔注射溶剂(生理盐水)或加波沙朵，每2天注射一次，持续两个月。5月龄时开始进行行为学实验。实验开始前连续3天，对小鼠进行抓握使其适应，同时让小鼠适应试验箱环境。物体-位置识别试验分为探索和测试两个阶段，如图5所示。

探索阶段：将小鼠放置在一个箱子(50×50×50cm，箱内壁一角有一个绿色小气球作为视觉线索)中自由探索5min，其中箱子的两个不同的角落分别放置有两个相同的物体(物体A和物体B)，然后将小鼠移出箱子2min，在此期间，使用75体积％的乙醇清洁箱子和物体，并将物体B转移至一个新的角落。

测试阶段：将小鼠放置在箱子中自由探索5min，然后记录小鼠的探索轨迹并计算小鼠对于物体B的偏好分数。

图6表示小鼠在物体-位置识别试验过程中的探索轨迹热图。图7表示小鼠在物体-位置识别试验过程中对于物体B的偏好分数。由图6和图7可知，相对于野生型小鼠，AD小鼠对被移动物体的识别能力明显更低，加波沙朵可以明显提高AD小鼠对物体-位置的识别能力，并且几乎对正常小鼠的此认知功能没有影响。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。