阅读说明：本技术 一种水痘疫苗可溶性微针贴及其制备方法 (Varicella vaccine soluble microneedle patch and preparation method thereof ) 是由 张庶民 马凤森 周荔葆 廖辉 陈中秋 刘苗苗 吴铮 辛小韵 于 2018-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种水痘疫苗可溶性微针贴,包括针体和背衬,针体由水痘疫苗、基质材料、疫苗稳定剂组成,疫苗稳定剂为海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的混合。本发明通过选择一定比例的海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的混合作为疫苗稳定剂,既能保护疫苗制品的活性,又能有效保证疫苗制品的稳定性,还能有效刺入皮肤,大大提高了用药的安全性。(The invention provides a varicella vaccine soluble microneedle patch which comprises a needle body and a back lining, wherein the needle body consists of a varicella vaccine, a matrix material and a vaccine stabilizer, and the vaccine stabilizer is a mixture of trehalose, mannitol and sodium glutamate. According to the invention, the mixture of trehalose, mannitol and sodium glutamate in a certain proportion is selected as the vaccine stabilizer, so that the activity of the vaccine product can be protected, the stability of the vaccine product can be effectively ensured, the vaccine product can be effectively penetrated into the skin, and the safety of medication is greatly improved.)

一种水痘疫苗可溶性微针贴及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗的微针给药技术领域，提供了一种水痘疫苗可溶性微针贴及其制备方法。

背景技术

水痘(chickenpox)是由水痘-带状疱疹病毒初次感染引起的急性传染病。主要发生在婴幼儿和学龄前儿童，成人发病症状比儿童更严重。对于在年幼时未接触过水痘及免疫缺陷的个体感染水痘，病情会比较严重或产生严重并发症，成人感染水痘后因并发症死亡是儿童的 30～40倍。水痘临床特征表现为全身皮肤粘膜成批出疹，斑丘疹、丘疹、疱疹和结痂同时存在，96％的病例有明显的临床症状，隐性感染仅占4％，在北半球的温带地区，易感者家庭密切接触的继发感染率接近90％。冬春两季多发，其传染力强，水痘患者是惟一的传染源，自发病前1～2天直至皮疹干燥结痂期均有传染性，接触或飞沫吸入均可传染，易感儿发病率可达95％以上。水痘的危害还表现在常伴有严重的并发症，最常见的并发症是继发皮肤感染，其次是脑炎、肺炎和心肌炎。

水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)是指在儿童初次感染引起水痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹。VZV只有一个血清型，人是该病毒的唯一自然宿主。水痘对儿童及社会的危害不容忽视，但对VZV感染目前还没有特效的药物治疗，水痘-带状疱疹免疫球蛋白和抗疱疹病毒药物十分昂贵，所以使用水痘减毒活疫苗进行普遍的儿童免疫接种已成为世界各国降低乃至切断水痘流行的重要手段及趋势。

现在的水痘疫苗无论是儿童还是成人，均采用的是上臂皮下注射，该方法剂量准确，但需要专业的医务人员进行操作，技术要求高。同时，注射时会有痛感，儿童、婴幼儿群体依从性相对较差，并且，皮下注射偶尔会引起不良反应，如临床上常有因注射后，护理不当出现注射残痕化脓性感染、引起***炎等。而另一方面，无菌针头的安全性是否有保障、是否有重复交叉感染的隐患、针头及塑料管材料成本高，生产制造时对环境污染严重，使用后，后续处理困难等因素也成为使用皮内注射进行给药的缺陷，种种不良因素影响下，寻找一个安全有效，依从性高的疫苗给药方法是当下最关键的问题。

微针阵列(microneedles array)作为一种新型的经皮免疫方法，从提出到不断发展经历了几十年的时间，其特点就是实用方便，不需要专业医务人员，普通人群就可以操作。微针不触及皮肤神经，无痛、特殊人群顺应性良好，在能充分穿透皮肤角质层条件下，载药的针尖恰好到达免疫细胞最多的皮层部位，所以临床效果更好。

按照文献《可溶性微针加载小分子化合物的研究进展及特点》(马凤森，占浩慧，黄颖聪，章捷，精细化工，2018,35(4)：541-548)所提及，不同的形态功能特点，微针可以分为固体实心微针、中空微针、涂层微针及可溶性微针。可溶性微针刺入皮肤后可形成自我修复的微孔道，安全性好，且可在皮内自行溶解，使得大分子和水溶性药物的经皮传递效率大大提高，效果超越了传统皮肤制剂。相比于可溶性微针，其他微针制备相对简单，也存在各自缺陷：如，涂层微针载药量小，仅适用于治疗剂量较小的药物，涂覆剂量难以精确控制；固体实心微针预处理后微孔道容易迅速关闭，导致给药效果差，且与中空微针一样具有针头断裂后残留有害物质的风险。

目前，还没有发现关于水痘疫苗可溶性微针的相关文献报道，也没有相关专利，所以本专利将提供一种水痘疫苗可溶性微针贴的制备方法。

目前水痘疫苗还存在一些急需解决的问题，国内上市的水痘疫苗最初都含有明胶和人血白蛋白，保护剂中的人血白蛋白，由于其是大分子蛋白质，在少部分人群中会产生同种异体排斥，并且其作为血液制品，在生物安全性等方面还存在着诸多的隐患；另外大多数对水痘疫苗的接种过敏反应是由疫苗中作为保护剂的明胶所致，保护剂中的明胶成分也是疫苗内毒素的主要来源，可导致接种者产生发热反应，所以从保护剂中去除明胶已经成为业界共识。

基于上述问题，如何开发出处方适宜、能有效穿刺皮肤并在皮内溶解快的水痘疫苗微针贴，同时改变水痘疫苗的稳定剂，让水痘疫苗更加稳定，更加安全的微针贴，已成为本领域技术人员需要解决的技术难题。

发明内容

本发明目的在于提供了一种水痘疫苗可溶性微针贴及其制备方法，解决了上述现有技术存在的瓶颈。

本发明的目的在于增强水痘疫苗的稳定性。因为目前市面上的水痘疫苗的保护剂中多数含有明胶和人血白蛋白，本发明主要通过筛选稳定剂的配方，找到水痘疫苗水溶性微针的最佳处方。

本发明采用的技术方案具体如下：

本发明提供了一种水痘疫苗可溶性微针贴，包括针体和背衬，针体由水痘疫苗、基质材料、疫苗稳定剂组成，疫苗稳定剂为海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的混合。

优选的，基质材料为支链淀粉与羧甲基纤维素的混合，比例为支链淀粉：羧甲基纤维素＝1：3。

优选的，稳定剂中各组分的含量比为：海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠＝(5:2:1)～(5:2:3)。

更优选的，稳定剂中各组分的含量比为：海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠＝5:2:2。

优选的，稳定剂与水痘疫苗的含量比为(4:1)～(1:2)。

更优选的，稳定剂与水痘疫苗的含量比为1:1。

优选的，水痘疫苗的含量占比为25％～35％。

更优选的，水痘疫苗的含量占比为35％。

本发明还提供了一种水痘疫苗可溶性微针贴的制备方法，包括如下步骤：

①阴模的制备：预先准备一个微针针体的阳模模具，将PDMS与固化剂(10:1)覆盖于阳模模具上，然后抽真空干燥，脱模即可得到阴模；

②微针贴的制备：按处方比例加入水痘疫苗、的支链淀粉、羧甲基纤维素(CMC)，混合均匀，再加入一定配比的稳定剂，混合均匀，倒入阴模模具中，将阴模模具置于滚筒模具之下，用转子不停来回转动，然后干燥，加入背衬，脱模即可得。

本发明提供的水痘疫苗可溶性微针贴，与现有技术相比，有益效果如下：

本发明通过选择一定比例的海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的混合作为疫苗稳定剂，既能保护疫苗制品的活性，又能有效保证疫苗制品的稳定性，还能有效刺入皮肤，大大提高了用药的安全性。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入到了本发明的保护范围。

实施例1可溶性水痘疫苗微针贴的阴模制备

本发明采用阳模具倒模的方法来制备水痘疫苗可溶性微针贴的阴模，步骤如下：

准备一个表面有100个(10×10行)高约750μm，底端直径约300μm的微针针体的阳模模具，取预聚合的聚二甲基硅氧烷10克和固化剂1克的混合物(质量比为10:1)并覆盖在阳模模具上，把容器放入真空干燥箱进行抽真空干燥，于0.08MPa下抽真空30分钟，直至去除掉溶液中的气泡。得到表面具有与前述的阳模模具上微针针体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的阴模模具；阴模模具的表面含有100个(10×10行)深度高约750μm，底端直径约300μm的正方形的针孔。

实施例2可溶性水痘疫苗微针贴的制备

本发明为均匀复合微针贴片，它具有很多优势，一方面可以增加药物利用度，另一方面可以精确控制给药剂量。制备均匀复合型可溶性水痘疫苗微针贴片的步骤如下：

取处方量的水痘疫苗，按顺序向其中加入处方量的物质，顺序如下：支链淀粉(amylop ectin)、羟甲基纤维素(CMC)、稳定剂、去离子水，再将这些物质混合均匀。将针体基质溶液于室温下放置30min，然后将基质溶液倒入阴模模具中，将带有基质混合溶液的阴模模具上放在滚筒模具下面。将转子转到底端，然后再转回来，如此反复，依次灌注成针体和背衬。室温下干燥过夜，脱模，形成高约750μm，底端直径约300μm的可溶性水痘疫苗贴片。

实施例3考察疫苗稳定剂对微针机械性能、制品生物活性的影响实验

目前国内的水痘疫苗保护剂都含有明胶和人血白蛋白。保护剂中的明胶成分是疫苗内毒素的主要来源，可导致接种者产生发热反应。保护剂中的人血白蛋白，在少部分人群中会引起同种异体排斥反应。

故，本发明的目的在于提供一种配方合理，不含有明胶和人血白蛋白的疫苗稳定剂来制备可溶性水痘疫苗微针贴。而且，水痘疫苗的稳定剂不仅要起到保护制品生物活性的作用，还要保证所制备的微针有足够的机械强度。

根据文献资料的查找，本实施例中稳定剂的配方选用无抗原性和毒素的小分子物质，例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、谷氨酸钠中的一种或几种，等量混合，再加入去离子水作为溶剂。试验方案如表1所示。

表1九种疫苗稳定剂配方

No.	海藻糖	蔗糖	甘露醇	谷氨酸钠
					配方A	√
配方B		√
					配方C			√
配方D	√	√
					配方E	√		√
配方F		√	√
					配方G	√	√		√
配方H	√		√	√
					配方I		√	√	√

本实施例中基质材料质量分数为30％(w.t)，稳定剂质量分数为50％(w.t)，基质材料选用支链淀粉：羧甲基纤维素(CMC)＝1:3的混合溶液，考察表1的九种疫苗稳定剂配方对微针性能的影响。

本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。

按如下方法检测微针的机械强度：置于物性分析仪下进行压变性能测试，从压变曲线中计算出微针的断裂力，断裂力越大则机械强度越大，来判断微针的成型性。测定结果如表2 所示。

表2不同配方的疫苗稳定剂对微针性能的影响

No.	机械性能
		配方A	+++
配方B	+++
		配方C	+
配方D	++++
		配方E	+++
配方F	++
		配方G	+++
配方H	+++
		配方I	+++

从表2中可知，除配方C以外，其余组配方稳定剂的加入使微针在机械强度方面均符合要求。

此外，本实施例还通过比较下述配方对疫苗活性的保护作用来筛选出最佳配方。发明人在温度25℃，湿度为75％的实验环境对照表1的配方进行疫苗的病毒滴度检测。病毒滴度采用蚀斑法进行。结果如表3所示。

表3不同配方的疫苗稳定剂对病毒滴度的影响

No.	病毒滴度/(lg PFU/0.5ml)
		无稳定剂(空白对照)	2.7
配方A	4.0
		配方B	3.2
配方C	3.0
		配方D	4.3
配方E	4.0
		配方F	3.8
配方G	4.5
		配方H	4.6
配方I	4.3

从表3中可知，无稳定剂组、配方B组、配方C组的水痘疫苗病毒滴度较低，病毒滴度均低于3.3lg PFU/0.5ml，不符合规定要求；其余组配方的病毒滴度均符合规定要求。

综合表2、表3可知，配方B、配方C中稳定剂不符合制备水痘疫苗微针贴的要求；其余各配方组均符合要求。

实施例4考察疫苗稳定剂对微针制剂稳定性的影响实验

在实施例3的基础上，本实施例进一步考察配方A、配方D、配方E、配方F、配方G、配方H、配方I对微针制剂稳定性的影响实验，拟通过不同存放时间在病毒滴度的变化和下降率的指标来筛选出适合的稳定剂配方。

本实施例微针处方中，基质材料质量分数为30％(w.t)，稳定剂质量分数为50％(w.t)，基质材料选用支链淀粉：羧甲基纤维素(CMC)＝1:3的混合溶液，选用实施例3中筛选的7 种稳定剂配置水痘疫苗，将疫苗放置在温度2～8℃，湿度为75％的实验环境下6个月。然后，于第0、1、2、3、4、6个月取样进行病毒滴度检测。病毒滴度的测定采用蚀斑法进行，测定结果如表4所示。

本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。

本实施例中，当测定指标之病毒滴度≥3.3lgPFU/0.5ml，下降幅度≤0.71lgPFU/0.5ml 时，制备的水痘疫苗可溶性微针符合要求。

表4不同存放时间内疫苗稳定剂对病毒滴度的影响(lgPFU/0.5ml)

No.	0个月	1个月	2个月	3个月	4个月	6个月	下降率
								配方A	4.0	3.8	3.3	3.0	2.8	2.5	37.5％
配方D	4.3	4.1	4.0	3.8	3.4	3.0	30.2％
								配方E	4.0	3.9	3.8	3.6	3.4	3.0	25％
配方F	3.8	3.7	3.5	3.3	3.1	2.7	28.9％
								配方G	4.5	4.4	4.2	4.0	3.8	3.6	20％
配方H	4.6	4.6	4.5	4.4	4.3	4.2	8.7％
								配方I	4.3	4.0	3.8	3.7	3.6	3.4	20.9％

从表4中可知，

1)配方A在第3个月时，病毒滴度为3.0lg PFU/0.5ml，不符合要求；且经6个月的存放后，下降率最大，表明稳定性最差。

2)配方D、配方E、配方F在第6个月时，病毒滴度分别为3.0lg PFU/0.5ml、3.0lgPFU/0.5ml、2.7lg PFU/0.5ml，不符合要求。

3)配方G、配方I虽然在第6个月时的病毒滴度仍符合要求，但病毒滴度的下降幅度均超过了0.71lg PFU/0.5ml，故也不符合要求。

4)配方H在第6个月时，病毒滴度为4.2lg PFU/0.5ml，符合要求；且从第1个月至第6个月，病毒滴度的下降率才8.7％，下降幅度低于0.71lg PFU/0.5ml，表明所制备的微针稳定性好，故选择配方H作为本发明的优选处方，即疫苗稳定性由海藻糖、甘露醇、谷氨酸的混合组成。

实施例5疫苗稳定剂中各组分含量比的筛选及评价

基于实施例3和4，选择配方H为优选处方，但由于前述实施例3和4中疫苗稳定剂各组分的比例是按1:1:1进行的实验评价，并未考察各组分含量占比的变化对微针性能或效果的影响，故本实施例拟通过相关实验筛选出海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的优选比例。

本实施例中基质材料质量分数为30％(w.t)，稳定剂质量分数为50％(w.t)，基质材料选用支链淀粉：羧甲基纤维素(CMC)＝1:3的混合溶液，依实施例4的方法检测病毒滴度，并依实施例3的方法检测微针的机械强度。测定结果如表5和表6所示。

本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。

表5稳定剂各组分的不同比例对微针的影响

海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠	病毒滴度(lg PFU/0.5ml)	机械强度
			5:1:1	4.3	+++
5:2:1	4.6	+++
			5:3:1	4.5	+++
5:4:1	4.4	+++
			5:5:1	4.2	++++
1:2:1	4.0	++++
			1:3:1	3.7	++++
1:4:1	3.5	++++
			1:5:1	3.3	++++

从表5中可知，每一种组分比例均符合微针机械性能的要求。

首先，以谷氨酸钠的含量为定值“1”计算，改变海藻糖与甘露醇的比例，得出：当海藻糖与甘露醇的比例为(5:1)～(1:5)时，疫苗的病毒滴度均符合要求。其中，当海藻糖：甘露醇＝5:2时，测定的病毒滴度最大，为4.6lgPFU/0.5ml，表明此时疫苗微针的稳定性最好。

进一步的，以海藻糖：甘露醇＝5:2为定值计算，改变谷氨酸钠的含量比，考察对疫苗微针的机械强度与病毒滴度影响，结果见表6。

表6稳定剂各组分的不同比例对微针的影响

从表6中可知，海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠＝(5:2:1)～(5:2:3)时，疫苗的病毒滴度和机械强度均符合要求，随着谷氨酸钠含量的继续增多，微针的机械强度会降低，不符合要求。其中，当海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠＝5:2:2时，病毒滴度最高为4.8lg PFU/0.5ml，且机械强度符合要求，故，该比例为最优处方。

实施例6疫苗稳定剂含量的筛选及评价

本实施例中拟通过考察疫苗稳定剂与水痘疫苗的比例变化，来筛选出稳定剂与疫苗的最佳比例。

基于选择实施例5，选择疫苗稳定剂为海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的混合，且海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠的最优含量比＝5:2:2，基质材料选择支链淀粉：羧甲基纤维素(CMC)＝1: 3的混合溶液。本实施例中基质材料质量分数为30％(w.t)，将疫苗微针贴放置在湿度为75％，温度为25℃的实验环境下进行病毒滴度的检测，测试方法同实施例4，测定结果如表7所示。

本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。

表7稳定剂与水痘疫苗的不同比例对微针的影响

No.	稳定剂：水痘疫苗	病毒滴度(lg PFU/0.5ml)
			1	5:1	3.0
2	4:1	3.4
			3	3:1	3.8
4	2:1	4.6
			5	1:1	4.8
6	1:2	3.6
			7	1:3	3.2
8	1:4	3.1
			9	1:5	2.7

从表6中可知，当稳定剂：水痘疫苗＝(4:1)～(1:2)时，测定的病毒滴度符合要求，故作为优选处方；其中，当稳定剂：水痘疫苗＝1：1时，测定的病毒滴度最大，为最优处方。

实施例7疫苗含量的筛选及评价

本实施例中拟通过考察水痘疫苗的含量变化，来筛选出水痘疫苗的最佳含量。

基于选择实施例5，选择疫苗稳定剂为海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠的混合，且海藻糖：甘露醇：谷氨酸钠的最优含量比＝5:2:2；基于实施例6，选择疫苗稳定剂：水痘疫苗＝1:1；基质材料为支链淀粉：羧甲基纤维素(CMC)＝1:3的混合溶液。本实施例中基质材料质量分数为30％(w.t)，将疫苗微针贴放置在湿度为75％，温度为25℃的实验环境下，依实施例4的方法检测病毒滴度，并依实施例3的方法检测微针的机械强度。测定结果如表8所示。

本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。

表8水痘疫苗的含量变化对微针的影响

水痘疫苗	病毒滴度(lg PFU/0.5ml)	机械强度
			15％	3.2	++++
25％	3.8	+++
			35％	4.8	+++
45％	2.7	++

从表8中可知，当水痘疫苗的含量占比为25％～35％时，疫苗微针的病毒滴度和机械强度都符合规定要求。其中，最优处方为水痘疫苗的含量占比35％。