阅读说明：本技术 一种水痘-带状疱疹病毒亚单位纳米疫苗的制备方法和应用 (Preparation method and application of varicella-zoster virus subunit nano vaccine ) 是由 刘利新 陈浩林 陈永明 刘鸿 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种水痘-带状疱疹病毒亚单位纳米疫苗的制备方法和应用。具体公开了一种纳米颗粒,包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE重组蛋白、免疫佐剂、阳离子脂质和辅助脂质。本发明制备得到的纳米颗粒尺寸均匀,形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好,无明显粘连、破损、坍塌等现象；纳米颗粒中VZV gE重组蛋白具有较高的包封率；所述纳米颗粒施用于动物后,能产生较强的体液免疫,使细胞免疫明显增强,具有较大的应用前景。(The invention discloses a preparation method and application of a varicella-zoster virus subunit nano vaccine. Specifically disclosed is a nanoparticle comprising a varicella-zoster virus (VZV) gE recombinant protein, an immunoadjuvant, a cationic lipid, and a helper lipid. The nano particles prepared by the method have the advantages of uniform size, regular shape, round and smooth appearance, smooth surface, good dispersibility, no obvious adhesion, damage, collapse and other phenomena; the VZV gE recombinant protein in the nano-particles has higher encapsulation efficiency; after the nano-particles are applied to animals, stronger humoral immunity can be generated, the cellular immunity is obviously enhanced, and the application prospect is larger.)

一种水痘-带状疱疹病毒亚单位纳米疫苗的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域。更具体地，涉及一种水痘-带状疱疹病毒亚单位纳米疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是一种双链DNA病毒，人类疱疹病3型(human herpes virus 3，HHV-3)，人是唯一的自然宿主。VZV引起的原发感染表现为水痘(varicella)，并在宿主的感觉神经节内潜伏，再激活时可引起带状疱疹(Herpes zoster，HZ)多见于成年人和老年人。VZV病毒只有一个血清型，一般动物和鸡胚对VZV不敏感，在人或猴纤维母细胞中增殖，并缓慢产生细胞病变，形成多核巨细胞，受感染细胞核内，可见嗜酸性包涵体。

带状疱疹是潜伏在体内的VZV复发感染。由于儿童时期患过水痘愈合，病毒潜伏在脊髓后根神经节或脑感染神经节中，当机体受到某些刺激，如发热、受冷、机械压迫，使用免疫抑制剂、X光照射，白血病及肿瘤等细胞免疫功能损害或低下时，导致潜伏病毒激活，病毒沿感觉神经轴索下行到达该神经所支配的皮肤细胞内增殖，进而在皮肤上沿着感觉神经的通路发生串联的水疱疹，形似带状，故名带状疱疹。带状疱疹发生时患者通常会出现发烧、乏力等症状，在局部皮肤开始发红并伴随有灼热感和神经疼痛感，1～4周内局部痛觉非常敏感，有剧痛。患水痘后机体产生特异性体液免疫和细胞免疫，终身不再感染。但对长期潜伏于神经节中病毒不能被清除，故不能阻止病毒激活而发生带状疱疹。

由于目前还没有针对水痘和带状疱疹的特效治疗性药物，临床大多使用阿昔洛韦等广谱的抗病毒药物进行治疗，也有使用一些麻醉性或非麻醉性的镇痛药以及抗惊厥、抗抑郁的药物来缓解带状疱疹带来的强烈神经痛，因此预防和控制VZV的感染工作显得十分重要，而接种疫苗是目前预防和控制VZV的最主要同时也是最有效的方式。目前上市的水痘与带状疱疹疫苗大均是基于Oka株VZV减毒活病毒开发获得的，其不同之处仅在于每次接种所使用的病毒剂量以及接种次数存在一定区别。除减毒活疫苗之外，VZV的亚单位疫苗和DNA疫苗目前也成为较受关注的研究内容。

传统的灭活或者减活疫苗的安全以及其引起的全身性免疫风暴在很多疫苗体系中无法避免。但随着现代分子生物学及生物化学的发展，亚单位蛋白疫苗及多肽疫苗的优势及应用得到广泛肯定。亚单位疫苗是通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。相对全病毒疫苗来讲，亚单位疫苗安全性更高，稳定性更好；同时亚单位疫苗免疫具有持久性，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫。

VZV在细胞感染复制的过程中，病毒囊膜扮演了非常重要的角色。病毒从细胞核开始的DNA复制到核衣壳组装出核，再到内质网和高尔基体的皮层组装修饰，以及最后病毒出胞和胞间融合感染，一系列的过程需要经过多次的包膜以及去包膜，而病毒囊膜中存在的糖蛋白在这些过程中起到了重要作用。目前确定的VZV糖蛋白有9种，分别是gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN。其中gE糖蛋白是VZV表达量最高的糖蛋白，在病毒的复制和组装过程中起到主要作用，也介导病毒在细胞间的传播。研究发现在恢复期水痘和带状疱疹患者的血清中，VZV抗体主要针对gE，gB和gH，尤其是gE诱导的细胞免疫和体液免疫，可保护动物免受病毒侵袭。另外，VZV gE单克隆抗体可以在存在外源补体的情况下介导抗体依赖性细胞毒性并中和病毒感染性。鉴于VZV gE具有很强的免疫原性，能诱导机体产生针对VZV的免疫应答，它已成为VZV亚单位疫苗和DNA疫苗的主要候选抗原之一。以gE为主要成分的HZ亚单位疫苗Shingrix已在2017年底获得美国食品药品管理局(Food and drμg administration，FDA)批准上市，用于50岁以上的老年人群预防HZ及其并发症。

研究表明单独的gE蛋白在动物模型中并不能够诱导强烈的细胞免疫反应，必须通过佐剂才能增强gE的免疫反应。专利CN201780072995.4公开了一种水痘带状疱疹病毒疫苗组合物，包含具有水痘带状疱疹病毒的表面蛋白(gE)和特定比例的铝盐免疫增强佐剂，虽然免疫效果有所增强，但是依然存在免疫原性较弱的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种纳米颗粒。

本发明的另一目在于提供上述纳米颗粒的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述纳米颗粒的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：

一种纳米颗粒，包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE重组蛋白、免疫佐剂、阳离子脂质和辅助脂质。

本发明以水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE糖蛋白蛋白作为疫苗的抗原，通过阳离子磷脂与VZV gE重组蛋白静电相互作用，以胆固醇等辅助脂质为稳定剂，对特定的免疫佐剂进行包裹，形成含有VZV gE蛋白和特定免疫佐剂的脂质体纳米颗粒，相比于单独的VZV gE蛋白，本发明的纳米颗粒能够产生更优的免疫效果。

所述“包裹”并不限于将VZV gE重组蛋白和免疫佐剂完全置于纳米颗粒的内部。本发明的纳米颗粒中，VZV gE重组蛋白和免疫佐剂可以全部位于纳米颗粒内部，也可以部分位于纳米颗粒表面。

优选地，所述纳米颗粒疫苗为脂质体核壳结构，核为水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE重组蛋白和免疫佐剂，壳为包裹在核上的阳离子脂质和辅助脂质。

优选地，所述水痘-带状疱疹病毒gE重组蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明通过删除VZV gE全长片段中跨膜区基因序列进行体外重组表达得到的蛋白VZVgE，设计得到VZV gE蛋白新抗原表位。

优选地，所述免疫佐剂为IMQ和/或MPLA。

优选地，所述阳离子脂质选自溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、溴化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、硬脂胺(SA)中的一种或多种。

更优选地，所述阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)。

优选地，所述辅助脂质选自磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种或多种。

更优选地，所述辅助脂质为胆固醇(Chol)。

优选地，所述VZV gE重组蛋白：免疫佐剂：阳离子脂质：辅助脂质的质量比为6～9：0.4～4：30～40：10～14。

更优选地，当佐剂为IMQ时，VZV gE重组蛋白：免疫佐剂：阳离子脂质：辅助脂质的质量比为8:3:36:12；当佐剂为MPLA时，VZV gE重组蛋白：免疫佐剂：阳离子脂质：辅助脂质的质量比为8:0.4:36:12。当佐剂为IMQ和MPLA时，VZV gE重组蛋白：免疫佐剂IMQ：免疫佐剂MPLA：阳离子脂质：辅助脂质的质量比为8:3:0.4:36:12。

优选地，所述纳米颗粒为近似球形。

优选地，所述纳米颗粒的粒径为30～200nm，例如30～50nm、50～80nm、80～100nm、100～150nm或150～200nm。

优选地，所述纳米颗粒的Zeta电位为+10至+35mV，例如+10至+15mV、+15至+20mV、+20至+25mV、+25至+30mV、+30至+35mV。

优选地，所述纳米颗粒中，VZV gE蛋白的包封率为80％～100％，例如80％～85％、85％～90％、90％～95％或95％～100％。

本发明还提供上述纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1.提供包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZV gE重组蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液；

S2.使包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZV gE重组蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过不同的进样通道到达混合区域中，进行混合，得到纳米颗粒溶液；

S3.除去有机溶剂，得到纳米颗粒水溶液。

优选地，所述方法在包含第一通道、第二通道、第三通道、第四通和混合区域的装置中进行。在一个优选的实施方案中，所述装置为多入口涡流混合器，例如四入口涡流混合器。所述技术和装置记载在本发明人前期申请号为PCT/US2017/014080的专利中。

优选地，当佐剂为IMQ时，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含免疫佐剂IMQ的溶液混合通过第一通道、VZV gE重组蛋白的溶液单独通道第二通道、纯水通过第三和第四通道，且各通道流速相同。

优选地，当佐剂为MPLA时，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含免疫佐剂MPLA的溶液混合通过第一通道、VZV gE重组蛋白的溶液单独通道第二通道、纯水通过第三和第四通道，且各通道流速相同。

优选地，当佐剂为IMQ和MPLA时，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含免疫佐剂IMQ和MPLA的溶液混合通过第一通道、VZV gE重组蛋白的溶液单独通道第二通道、纯水通过第三和第四通道，且各通道流速相同。

优选地，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZV gE重组蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在混合区域中产生涡流。

优选地，所述各通道的流速相同，为1～20mL/min，例如1mL/min、5mL/min、8mL/min、10mL/min、15mL/min或20mL/min。

更优选地，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZV gE重组蛋白的溶液、包含免疫佐剂的溶液和纯水在通道中的流速均为10mL/min。

优选地，所述包含VZV gE重组蛋白的溶液的pH＝7.2～7.4。

优选地，所述方法还包括步骤4：对包含纳米颗粒的溶液进行冻干浓缩，例如通过添加冻干保护剂进行冻干浓缩。

优选地，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZV gE重组蛋白的溶液、包含免疫佐剂的溶液的浓度比为3～4mg/mL：1.0～1.4mg/mL：600～800μg/mL：40～400μg/mL。

优选地，当佐剂为IMQ时，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZVgE重组蛋白的溶液、包含免疫佐剂IMQ的溶液的浓度比为3.4～3.8mg/mL：1.2mg/mL：600～800μg/mL：300μg/mL。

优选地，当佐剂为MPLA时，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZVgE重组蛋白的溶液、包含免疫佐剂MPLA的溶液的浓度比为3.4～3.8mg/mL：1.2mg/mL：600～800μg/mL：40～50μg/mL。

优选地，当佐剂为IMQ和MPLA时，包含阳离子脂质的溶液、包含辅助脂质的溶液、包含VZV gE重组蛋白的溶液、包含免疫佐剂IMQ的溶液、包含免疫佐剂MPLA的溶液的浓度比为3.4～3.8mg/mL：1.2mg/mL：600～800μg/mL：280～300μg/mL：300～400μg/mL。

优选地，所述步骤1中，包含阳离子脂质的溶液为乙醇溶液。

优选地，所述步骤1中，包含辅助脂质的溶液为乙醇溶液。

优选地，所述步骤1中，包含免疫佐剂的溶液为乙醇溶液。

优选地，所述步骤1中，包含VZV gE重组蛋白的溶液为Hepes缓冲溶液(pH＝7.2±0.2)。

本发明共负载VZV gE重组蛋白和免疫佐剂的纳米颗粒能够比游离的VZVgE重组蛋白和佐剂引起更强的免疫应答。因此，本发明还请求保护所述的纳米颗粒在制备与VZV感染相关的疾病的免疫原性组合物中的应用。

优选地，所述与VZV感染相关的疾病为水痘和/或带状疱疹。

本发明还提供一种免疫原性组合物，所述组合物包含本发明的纳米颗粒。

优选地，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的辅料，例如赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或额外的免疫佐剂。

优选地，所述免疫原性组合物为疫苗。

优选地，所述免疫原性组合物用于预防和/或治疗受试者中与VZV感染相关的疾病，例如水痘、带状疱疹。

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。

优选地，所述免疫原性组合物还包含第二免疫原性物质。例如，所述免疫原性组合物还包含除VZV gE重组蛋白以外的VZV的其他蛋白。例如，所述免疫原性组合物还包含灭活和减活VZV。例如，所述免疫原性组合物还包含VZV以外的其他致病微生物(包括活的、灭活的或减毒的)。例如，所述免疫原性组合物还包含VZV以外的其他致病微生物的部分。

在一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者中与VZV感染相关的疾病的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。

优选地，所述与VZV感染相关的疾病为水痘、带状疱疹。

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。

在一个方面，本申请提供了一种引发或增强受试者对VZV的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；所述受试者为所述受试者C57BL/6小鼠。

在一个方面，本申请提供了本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)用于引发或增强受试者对VZV的免疫应答的用途。

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为所述受试者C57BL/6小鼠。

本发明的脂质体纳米颗粒性以重组蛋白抗原VZV gE蛋白为基础，将佐剂和抗原共负载。该纳米颗粒与病原微生物的大小相似，因而更容易被抗原呈递细胞(APC)捕获并向T细胞呈递抗原，促使T细胞和B细胞成熟活化，增强免疫效果。

本发明包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体纳米颗粒疫苗免疫效果明显优于铝佐剂与游离VZV gE重组蛋白的混合物。本发明的纳米疫苗既能够很好的激发Th1型免疫，又能够激活Th2型免疫；能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ，TNF-α和IL-2的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明以水痘-带状疱疹病毒gE重组蛋为疫苗抗原来制备纳米疫苗，制备得到的纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象，VZVgE重组蛋白有较高的包封率。

(2)本发明的纳米颗粒施用于动物后，能产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，免疫效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射以及现有的含铝佐剂的疫苗；且具有靶向***的功能，提高了疫苗在***内的富集以及抗原提呈细胞的摄取。

(3)本发明的纳米颗粒能够通过简单的方法制备，品质稳定，易于产业化生产。

附图说明

图1为本发明制备纳米颗粒的方法中的步骤2的示例性描述。

图2为本发明实施例3～5所制得的4种纳米颗粒的透射电镜形态结果。A为包裹VZVgE重组蛋白和阳离子脂质以及辅助脂质Chol的纳米颗粒NPS在透射电镜下的形态；B为包裹VZV gE重组蛋白、阳离子脂质、辅助脂质Chol以及免疫佐剂IMQ的纳米颗粒NPS-I在透射电镜下的形态；C为包裹VZV gE重组蛋白、阳离子脂质、辅助脂质Chol以及免疫佐剂MPLA的纳米颗粒NPS-M在透射电镜下的形态；D为包裹VZV gE重组蛋白、阳离子脂质、辅助脂质Chol、免疫佐剂IMQ以及免疫佐剂MPLA的纳米颗粒NPS-I-M的在透射电镜下的形态。如图所示，四种纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象。

图3为本发明实施例3～5所制得的4种纳米颗粒的粒径测试结果。如图所示，四种纳米颗粒均具有较窄的粒径分布，粒径分布对称。

图4为本发明实施例8中对小鼠进行第一次免疫后的第7天各组小鼠血清中IgG的滴度(图4A)、IgG1的滴度(图4B)、IgG2c的滴度(图4C)、IgG2c/IgG1的比例(图4D)。

图5为本发明实施例8中对小鼠进行第一次免疫后的第14天各组小鼠血清中IgG的滴度(图5A)、IgG1的滴度(图5B)、IgG2c的滴度(图5C)、IgG2c/IgG1的比例(图5D)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够促进T细胞的极化，增强细胞免疫的效果。

图6为本发明实施例8中对小鼠进行第二次免疫后的第14天各组小鼠血清中IgG的滴度(图6A)、IgG1的滴度(图6B)、IgG2c的滴度(图6C)、IgG2c/IgG1的比例(图6D)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够促进T细胞的极化，增强细胞免疫的效果。

图7为本发明实施例8中对小鼠进行第三次免疫后的第14天各组小鼠血清中IgG的滴度(图7A)、IgG1的滴度(图7B)、IgG2c的滴度(图7C)、IgG2c/IgG1的比例(图7D)。实验结果表明，使用本发明的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够促进T细胞的极化，增强细胞免疫的效果。

图8为本发明实施例8中对小鼠进行第三次免疫后的第32天各组小鼠血清中IgG的滴度(图8A)、IgG1的滴度(图8B)、IgG2c的滴度(图8C)、IgG2c/IgG1的比例(图8D)。

图9为用抗原刺激各组小鼠免疫后的CD4+和CD8+淋巴T细胞内IFN-γ和TNF-α的表达量。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)的IFN-γ和TNF-α的表达量与A组(施予PBS的阴性对照)相比有显著差异。实验结果表明，本发明的纳米颗粒(施予NPS-I-M纳米颗粒)对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1NPS纳米颗粒的制备条件筛选(pH筛选)

1、试剂：VZV重组蛋白由大肠杆菌表达系统表达产生，再经过溶解和复性而获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其他试剂均为商购。

2、制备过程：

(1)将阳离子脂质溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、辅助脂质胆固醇(Chol)共溶于乙醇中，得到DOTAP浓度为0.75mg/mL、Chol浓度为0.25mg/mL的乙醇溶液。将VZV gE重组蛋白分散于不同pH值Hepes缓冲溶液(pH＝6.4，pH＝7.4，pH＝7.9)中，得到VZVgE重组蛋白浓度为0.1～0.2mg/mL。

(2)将包含阳离子脂质DOTAP和辅助脂质Chol的溶液、VZV gE重组蛋白溶液、超纯水1、超纯水2分别装入四支注射器中，包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol的乙醇溶液为通道1，VZV gE重组蛋白溶液为通道2，超纯水1、超纯水2分别进入通道3和4；将四支注射器分别置于高压泵上，各个通道内的溶液的体积均为5mL，各注射器中溶液分别通过1～4通道，各通道的流速相同，为10mL/min。开启高压泵，获得包裹VZV gE重组蛋白的脂质体纳米颗粒的溶液。

(3)旋蒸或者透析有机溶剂，得到包裹VZV gE重组蛋白的脂质体纳米颗粒的水溶液(命名为NPS-1,NPS-2,NPS-3纳米颗粒溶液)。

(4)利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对NPS-1,NPS-2,NPS-3纳米颗粒平均粒径进行测试，结果如表1所示。

表1

利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对以上3种纳米颗粒的平均粒径进行测试，结果如表1所示。通过筛选不同的pH去制备NPS纳米颗粒，最终我们确定制备纳米颗粒的最优pH为7.4。制备得到的纳米颗粒粒径均一，分散性好。后续实验制备纳米颗粒时VZVgE重组蛋白分散于pH＝7.4的Hepes缓冲溶液中。

实施例2NPS纳米颗粒的制备条件筛选(蛋白浓度筛选)

1、试剂：VZV重组蛋白由大肠杆菌表达系统表达产生，再经过溶解和复性而获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其他试剂均为商购。

2、制备过程：

(1)将阳离子脂质溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、辅助脂质胆固醇(Chol)共溶于乙醇中，得到DOTAP浓度为3.6mg/mL、Chol浓度为1.2mg/mL的乙醇溶液。将VZVgE重组蛋白分散于Hepes缓冲溶液(pH＝7.2±0.2)中，得到VZV gE重组蛋白浓度为0.6mg/mL，0.7mg/mL和0.8mg/mL。

(2)将包含阳离子脂质DOTAP和辅助脂质Chol的溶液、VZV gE重组蛋白溶液、超纯水1、超纯水2分别装入四支注射器中，包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol的乙醇溶液为通道1，VZV gE重组蛋白溶液为通道2，超纯水1、超纯水2分别进入通道3和4；将四支注射器分别置于高压泵上，各个通道内的溶液的体积均为5mL，各注射器中溶液分别通过1～4通道，各通道的流速相同，为10mL/min。开启高压泵，获得包裹VZV gE重组蛋白的脂质体纳米颗粒的溶液。

(3)旋蒸或者透析有机溶剂，得到包裹VZV gE重组蛋白的脂质体纳米颗粒的水溶液(命名为NPS-4，NPS-5，NPS-6纳米颗粒溶液)。

(4)利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对NPS-4,NPS-5,NPS-6纳米颗粒平均粒径进行测试，结果如表2所示。

表2

利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对以上3种纳米颗粒的平均粒径进行测试，结果如表2所示。通过筛选不同的蛋白浓度去制备NPS纳米颗粒，最终我们确定制备纳米颗粒的最优为。制备得到的纳米颗粒粒径均一，分散性好。后续实验制备纳米颗粒时VZVgE重组蛋白分散于pH＝7.4的Hepes缓冲溶液中，配成初始浓度为0.8mg/mL的VZV gE重组蛋白溶液。

实施例3NPS-I纳米颗粒的制备

1、试剂：VZV重组蛋白由大肠杆菌表达系统表达产生，再经过溶解和复性而获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其他试剂均为商购。

2、制备过程：

(1)将阳离子脂质溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、辅助脂质胆固醇(Chol)和免疫佐剂IMQ共溶于乙醇中，得到DOTAP浓度为3.6mg/mL、Chol浓度为1.2mg/mL、IMQ浓度为0.3mg/mL的乙醇溶液。将VZV gE重组蛋白分散于Hepes缓冲溶液(pH＝7.2±0.2)中，得到VZV gE重组蛋白浓度为0.8mg/mL。

(2)将包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol和免疫佐剂IMQ的溶液、VZV gE重组蛋白溶液、超纯水1、超纯水2分别装入四支注射器中，包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol、免疫佐剂IMQ的乙醇溶液为通道1，VZV gE重组蛋白溶液为通道2，超纯水1、超纯水2分别进入通道3和4；将四支注射器分别置于高压泵上，各个通道内的溶液的体积均为5mL，各注射器中溶液分别通过1～4通道，各通道的流速相同，为10mL/min。开启高压泵，获得包裹VZVgE重组蛋白和免疫佐剂IMQ的脂质体纳米颗粒的溶液。

(3)旋蒸或者透析有机溶剂，得到包裹VZV gE重组蛋白和免疫佐剂IMQ的脂质体纳米颗粒的水溶液(命名为NPS-I纳米颗粒溶液)。

3、参照步骤(1)～(3)的操作和参数，使用包含阳离子脂质DOTAP和辅助脂质Chol的乙醇溶液、VZV gE重组蛋白溶液、超纯水制备包裹VZV gE重组蛋白、不含免疫佐剂的脂质体纳米颗粒的水溶液(命名为NPS纳米颗粒溶液)。

实施例4NPS-M纳米颗粒的制备

制备过程：

(1)将阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol和免疫佐剂MPLA共溶于乙醇溶液，得到DOTAP浓度为3.6mg/mL、Chol浓度为1.2mg/mL、MPLA浓度为0.04mg/mL的乙醇溶液。将VZV gE重组蛋白分散于Hepes缓冲溶液中(pH＝7.2±0.2)，得到VZV gE重组蛋白浓度为0.8mg/mL。

(2)将包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol和免疫佐剂MPLA的乙醇溶液、VZV gE重组蛋白溶液、超纯水1、超纯水2分别装入四支注射器中，包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol和免疫佐剂MPLA的乙醇溶液为通道1，VZV gE重组蛋白溶液为通道2，超纯水1、超纯水2分别进入通道3和4；将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器中溶液分别通过1～4通道。各个通道内的溶液的体积均为5mL，各通道的流速相同，为10mL/min。开启高压泵，获得包裹VZV gE重组蛋白和免疫佐剂MPLA的脂质体纳米颗粒的溶液。

(3)旋蒸或者透析有机溶剂，得到包裹VZV gE重组蛋白和免疫佐剂MPLA的脂质体纳米颗粒的水溶液(命名为NPS-M纳米颗粒溶液)。

实施例5NPS-I-M纳米颗粒的制备

制备过程：

(1)将阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol和免疫佐剂IMQ、MPLA溶解，得到DOTAP浓度为3.6mg/mL、Chol浓度为1.2mg/mL、IMQ浓度为0.3mg/mL、MPLA浓度为0.04mg/mL的乙醇溶液。将VZV gE重组蛋白分散于Hepes缓冲溶液中，得到VZV gE重组蛋白浓度为0.8mg/mL。

(2)将包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol、免疫佐剂IMQ、MPLA的乙醇溶液、VZVgE重组蛋白溶液、超纯水1、超纯水2分别装入四支注射器中，包含阳离子脂质DOTAP、辅助脂质Chol、免疫佐剂IMQ和MPLA的乙醇溶液为通道1，VZV gE重组蛋白溶液为通道2，超纯水1、超纯水2分别进入通道3和4；将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器中溶液分别通过1～4通道，各个通道内的溶液的体积均为5mL，各通道的流速相同，为10mL/min。开启高压泵，获得包裹VZV gE重组蛋白和双免疫佐剂IMQ及MPLA的脂质体纳米颗粒的溶液。

(3)旋蒸或者透析有机溶剂，得到包裹VZV gE重组蛋白和双免疫佐剂IMQ及MPLA的脂质体纳米颗粒的水溶液(命名为NPS-I-M纳米颗粒溶液)。

实施例6纳米颗粒的形态表征、粒径测试和电位测试

1、形态表征

使用透射电镜观察包裹VZV gE重组蛋白、不含免疫佐剂的脂质体NPS纳米颗粒，包裹VZV gE重组蛋白、免疫佐剂IMQ的脂质体NPS-I纳米颗粒，包裹VZV gE重组蛋白、免疫佐剂MPLA的脂质体NPS-M纳米颗粒及包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体NPS-I-M纳米颗粒，其结果如图2所示，四种纳米颗粒的形态分别如图2A、2B、2C、2D所示，四种纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象。

2、粒径测试和Zeta电位测试：

利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对包裹VZV gE重组蛋白、不含免疫佐剂的脂质体NPS纳米颗粒，包裹VZV gE重组蛋白、免疫佐剂IMQ的脂质体NPS-I纳米颗粒，包裹VZV gE重组蛋白、免疫佐剂MPLA的脂质体NPS-M纳米颗粒及包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体NPS-I-M纳米颗粒的平均粒径和Zeta电位进行测试，结果如表1所示。

表1

图3A、4B、4C、4D分别为包裹VZV gE重组蛋白、不含免疫佐剂的脂质体NPS纳米颗粒，包裹VZV gE重组蛋白、免疫佐剂IMQ的脂质体NPS-I纳米颗粒、包裹VZV gE重组蛋白、免疫佐剂MPLA的脂质体NPS-M纳米颗粒及包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体NPS-I-M纳米颗粒的粒径分布图。结合表2和图3可知，所述四种纳米颗粒均具有较窄的粒径分布，粒径分布对称。

实施例7纳米颗粒中VZV gE重组蛋白的包封率的计算

1、取5mL NPS纳米颗粒溶液到300kDa的超滤管中，在4℃、3000rpm条件下离心30min，取下面滤出液，采用Bradford蛋白检测试剂盒，检测下面滤出液中游离VZV gE重组蛋白的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中VZV gE重组蛋白的包封率。

VZV gE重组蛋白的包封率＝w₀-w₁/w₀×100％，其中w₀为加入的VZV gE重组蛋白的总量；w₁为下面滤出液中游离的VZV gE重组蛋白的总量。

2、按照1中的方法分别测定NPS-I纳米颗粒、NPS-M纳米颗粒、NPS-I-M纳米颗粒中VZV gE重组蛋白的包封率。

包封率的测定结果如表2所示。

表2

从表2的结果可以看出，本发明的上述四种纳米颗粒中，VZV gE重组蛋白的包封率均较高，有利于纳米颗粒引起强的免疫效果。

实施例8.纳米颗粒在小鼠体内的免疫效果评价

1、免疫方式

将5～8周雌性C57BL/6小鼠分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J十组，每组10只。采用尾根部皮下注射方式，按照表3中的免疫方案对小鼠进行免疫，并两周加强免疫一次，再间隔一周再次加强免疫一次，共免疫3次。

表3

2、免疫效果评价(1)小鼠血清中IgG检测

分别在第一次免疫后的第7、14、28、42、60天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG的滴度。

检测过程：

1)将5μg/mL的VZV gE重组蛋白抗原包被在96孔板中，每孔100μL，4℃过夜包被。

2)过夜包被的板，用PBST洗3次，每次200μL，用200μL 3％BSA在37℃封闭2h。

3)取2μL免疫血清或阴性对照血清，稀释至200μL，再依次倍比稀释，加入到包被抗原的孔中，室温下孵育2h。

4)清洗5次，加工作浓度的IgG-HRP，每孔100μL，室温孵育2h。

5)清洗5次，每孔加100μL TMB底物，黑暗下孵育20min，用200μL 2MH₂SO₄终止反应，450nm处检测OD值。

6)计算滴度，若标本孔的平均吸收值(P)与阴性对照(A组)平均吸收值(N)的比值(即P/N)大于2.1，则判定标本孔为阳性。

检测结果如图4A、5A、6A、7A、8A所示。

图4A显示了第一次免疫后的第7天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度高于D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，具有显著性差异(P＜0.05)；且高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)和C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)，具有极显著性差异(P＜0.01)。

图5A显示了第一次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)，具有极显著性差异(P＜0.001)；同时也高于E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)，具有显著性差异(P＜0.05)。

图6A显示了第一次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度高于高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)、H组(施予NPS-I纳米颗粒)，具有极显著性差异(P＜0.001)。

图7A显示了第一次免疫后的第42天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度能达到2.5*10^6，高于E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)，具有极显著性差异(P＜0.01)。

图8A显示了第一次免疫后的第60天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度高于其他所有组，其中明显高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)和C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)，具有极显著性差异(P＜0.001)。

实验结果表明，本发明的包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体NPS-I-M纳米颗粒对小鼠进行免疫后，能够增强体液免疫，提高抗体的滴度。本发明的纳米颗粒的免疫效果明显优于游离VZV gE重组蛋白与铝佐剂的混合物。

(2)小鼠血清中IgG亚型检测

分别在第一次免疫后的第7、14、28、42、60天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG1和IgG2c的滴度，并计算IgG2c/IgG1的值，结果如图4～图9B～D所示。

图4B显示了第一次免疫后的第7天，各组小鼠的血清中IgG1的滴度；图4C显示了第一次免疫后的第7天，各组小鼠的血清中IgG2c的滴度；图4D显示了第一次免疫后的第7天，各组小鼠的血清中IgG2c/IgG1的值。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG1滴度高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，具有显著性差异(P＜0.05)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG2c滴度高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)，具有显著性差异(P＜0.01)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清中IgG2c/IgG1高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)。

图5B显示了第一次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG1的滴度；图5C显示了第一次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG2c的滴度；图5D显示了第一次免疫后的第14天，各组小鼠的血清中IgG2c/IgG1的值。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG1滴度高于B组(施予游离VZVgE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)，具有极显著性差异(P＜0.01)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG2c滴度高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，具有极显著性差异(P＜0.01)，高于E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)，具有显著性差异(P＜0.05)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清中IgG2c/IgG1高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)和C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)，具有显著性差异(P＜0.05)。

图6B显示了第一次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG1的滴度；图6C显示了第一次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG2c的滴度；图6D显示了第一次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG2c/IgG1的值。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG1和IgG2c滴度均高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)、E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)、H组(施予NPS-I纳米颗粒)，具有极显著性差异(P＜0.001)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清中IgG2c/IgG1高于E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)，具有极显著性差异(P＜0.01)。

图7B显示了第一次免疫后的第42天，各组小鼠的血清中IgG1的滴度；图7C显示了第一次免疫后的第42天，各组小鼠的血清中IgG2c的滴度；图7D显示了第一次免疫后的第42天，各组小鼠的血清中IgG2c/IgG1的值。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG1滴度高于B组(施予游离VZVgE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)、E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)、H组(施予NPS-I纳米颗粒)，具有极显著性差异(P＜0.001)，且高于I组(施予NPS-M纳米颗粒)，具有极显著性差异(P＜0.01)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG2c滴度高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZVgE重组蛋白+游离MPLA)、E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)，具有极显著性差异(P＜0.001)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清中IgG2c/IgG1高于B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，具有极显著性差异(P＜0.01)。

图8B显示了第一次免疫后的第60天，各组小鼠的血清中IgG1的滴度；图8C显示了第一次免疫后的第60天，各组小鼠的血清中IgG2c的滴度；图8D显示了第一次免疫后的第60天，各组小鼠的血清中IgG2c/IgG1的值。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG1滴度高于C组(施予游离VZVgE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)，具有极显著性差异(P＜0.01)；J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)小鼠的血清IgG2c滴度高于C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZVgE重组蛋白+游离MPLA)、E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)、H组(施予NPS-I纳米颗粒)，具有极显著性差异(P＜0.01)。

上述实验结果表明，本发明的包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体NPS-I-M纳米颗粒对小鼠进行免疫后，与游离的抗原和佐剂混合物相比，能够增强体液免疫，提高抗体的滴度。本发明的包裹VZV gE重组蛋白、双免疫佐剂IMQ和MPLA的脂质体NPS-I-M纳米颗粒既能够很好的激发Th1型免疫，又能够激活Th2免疫。

(3)小鼠外周血C84+，CD8+T细胞胞内因子检测

检测过程：第一次免疫后的第31天，取各组小鼠外周血，100ul/只，通过红细胞裂解液去除红细胞。通过表面抗体标记CD3，CD4，CD8。然后胞内染色IFN-γ，TNF-α。流式细胞仪检测并分析

图9为用抗原刺激各组小鼠免疫后的CD4+和CD8+淋巴T细胞内IFN-γ和TNF-α的表达量，具体检测结果如图9A～9D所示。结果显示，J组(施予NPS-I-M纳米颗粒)的IFN-γ和TNF-α的表达量与A组(施予PBS的阴性对照)相比有极显著差异，与其他的组别B组(施予游离VZV gE重组蛋白)、C组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ)、D组(施予游离VZV gE重组蛋白+游离MPLA)、E组(游离VZV gE重组蛋白+游离IMQ+游离MPLA)、F组(施予游离VZV gE重组蛋白+铝佐剂)、G组(施予NPS纳米颗粒)、H组(施予NPS-I纳米颗粒)、I组(施予NPS-M纳米颗粒)也有显著性差异。实验结果表明，本发明的纳米颗粒(施予NPS-I-M纳米颗粒)对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。