阅读说明：本技术 疫苗接种 (Vaccination ) 是由 C.乌斯特富格斯 于 2018-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于保护免于带状疱疹(带状疱疹)的免疫原性组合物以及方法。(The present invention relates to immunogenic compositions and methods for protecting against herpes zoster (shingles).)

疫苗接种

技术领域

本发明涉及诱导针对带状疱疹或带状疱疹后神经痛的早期保护和预防带状疱疹或带状疱疹后神经痛的方法，特别是在老年和免疫受损的人患者中。

背景

带状疱疹(Herpes Zoster，HZ)，也被称作带状疱疹(shingles)，是主要发生在老年或免疫受损的个体中的常见且经常使人虚弱的疾病。HZ由在背根和脑神经节中的潜伏水痘带状疱疹病毒(VZV)的有症状复活造成。这种病毒经常在童年期中作为水痘获得。

目前可用的具有经证实的针对HZ或带状疱疹后神经痛(PHN)的效力的唯一疫苗是作为ZOSTAVAX出售的VZV OKA毒株的活减毒疫苗。在所有人群(≥60 YOA)中，ZOSTAVAX使HZ的发病率下降51.3% (p-值<0.001)，尽管它的有效性随着疫苗接种者的年龄下降。具体地，在年龄较大的人群(≥70岁)中，疫苗效力(VE)下降到37.6％。在由于恶性肿瘤、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或免疫抑制医学疗法而具有免疫缺陷人中，禁用ZOSTAVAX。(ZOSTAVAXEMA SPC 2012；Oxman等人，N Engl J Med 2005; 352:2271-2284；Schmader等人，Clin.Infect. Diseases 2012 Apr;54(7):922-8)。Morrison VA等人报告了ZOSTAVAX的效力下降，其在疫苗接种后超过5-8年变得越来越有限，并且超过8年在统计学上不再显著(Morrison等人，Clin. Infect. Diseases，提前获得出版，2014年11月20日)。

佐剂化的亚单位VZV 组合物描述于WO2006/094756 (US 7939084，其通过引用并入本文以定义免疫原性组合物)。Leroux-Roels I.等人(J. Infect. Diseases 2012:2061280-1290)报告了佐剂化的VZV gE亚单位疫苗的I/II期临床试验，评估了安全性和免疫原性。已显示，佐剂化的亚单位VZV疫苗在2-剂量方案后提供高效力(Himal L.等人，2015NEJM 372(22):2087)。

发明概述

本发明涉及在施用一个剂量的组合物后，并具体在施用一个剂量的后的短时间框内，保护免于HZ的免疫原性组合物以及方法。

本发明还涉及在个体中保护免于、预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛或减少带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的发病率的方法，所述方法包括下述步骤：

a. 从需要在施用后的有限期限内保护免于、预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛或减少带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的发病率的人群中选择主体，和

b. 施用单一或第一剂量的免疫原性组合物(例如疫苗组合物），所述组合物包含与佐剂组合的被截短以除去羧基端锚区域的VZV gE抗原，所述佐剂包含皂苷、TLR-4激动剂和脂质体。

本发明还涉及在个体中保护免于、预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛或减少带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的发病率的方法，所述方法包括下述步骤：

a. 在免疫抑制疗法之前，从需要保护免于、预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛或减少带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的发病率的人群中选择主体，和

b. 施用单一或第一剂量的免疫原性组合物(例如疫苗组合物），所述组合物包含与佐剂组合的被截短以除去羧基端锚区域的VZV gE抗原，所述佐剂包含皂苷、TLR-4激动剂和脂质体，其中所述施用在免疫抑制疗法开始之前或伴随其进行。

具体实施方式

图1A-1C图示：在研究主体的总体组群(图1A)、来自年龄60-69岁的主体组群(图1B)以及年龄大于或等于70岁的主体组群(图1C)中，在以0,2个月的2-剂量疫苗接种方案使用佐剂化的VZV gE (每个剂量具有不同量的gE，即25µg、50µg和100µg)、单一剂量的佐剂化的VZV gE (盐水作为第一剂量施用，然后佐剂化的VZV gE 100µg作为第二剂量施用)后，或在以0,2个月的2-剂量疫苗接种方案使用VZV gE (每个剂量100 µg)后的细胞介导的免疫应答。Y轴是CD4²⁺ T细胞/10⁶ CD4⁺ T细胞，且X轴是初次疫苗接种后的月数。

图2A-2C图示：在研究主体的总体组群(图2A)、来自年龄60-69岁的主体组群(图2B)以及年龄大于或等于70岁的主体组群(图2C)中，在以0,2个月的2-剂量疫苗接种方案使用佐剂化的VZV gE、单一剂量的佐剂化的VZV gE (每个剂量具有不同量的gE，即25µg、50µg和100µg)、单一剂量的佐剂化的VZV gE (盐水作为第一剂量施用，然后佐剂化的VZV gE100µg作为第二剂量施用)后，或在以0,2个月的2-剂量疫苗接种方案使用VZV gE (每个剂量100 µg)后的VZV gE抗体水平。Y轴是抗体几何平均浓度(GMC)，且X轴是初次接种疫苗后的月数。

图3A-3B提供了实施例1中所述的III期临床疫苗接种试验(试验I)的研究设计。

图4提供了实施例2中所述的III期临床疫苗接种试验(试验II)的研究设计。

图5提供了实施例3中所述的III期临床疫苗接种试验的研究设计。

图6呈现了对实施例3报告的免疫原性数据：小图A - 对VZV gE/AS01B疫苗接种的体液免疫应答：通过酶联免疫吸附测定测定的抗糖蛋白E (gE)抗体浓度，报告几何平均浓度(GMC [mIU/mL])，且误差线表示95％置信区间(CI)；小图B - 对VZV gE/AS01B疫苗接种的细胞免疫应答，报告了通过细胞内染色和流式细胞术测定的表达至少2种活化标记(CD4^{2 +})的gE特异性CD4⁺细胞(数据为每10⁶个总外周血单核细胞的中值细胞计数)；浅色条表示HZ-PreVac组，深色条表示HZ-NonVac组。HZ-NonVac =从未接受活减毒带状疱疹疫苗(ZVL)的参与者；HZ-PreVac =在研究开始前接受ZVL≥5年的参与者。

图7提供了临床试验的设计，以评估HZ/su疫苗在免疫抑制化学疗法(chemo)之前或开始时接种疫苗的患有实体瘤的成年人中的免疫原性和安全性。

图8图示：ST主体中抗gE抗体的GMC (对体液免疫原性的适应性ATP组群)，其中gE= 糖蛋白E；ATP = 根据方案规定；GMC = 几何平均浓度；IU = 国际单位；M0 =疫苗接种前；M1 = 剂量1后1个月，M2/M6/M13 = 剂量2后1、5和12个月。误差线表示95％的置信区间。每个时间段(M)中的第一条为HZ/su PreChemo，第二条为HZ/su OnChemo，第三条为安慰剂PreChemo，且第四条为安慰剂OnChemo。

图9图示：ST主体中抗gE抗体的ELISA浓度的体液VRR (对体液免疫原性的适应性ATP组群)，其中gE = 糖蛋白E；ATP = 根据方案规定；VRR = 疫苗应答率；% = 应答者的百分比；M1 = 剂量1后1个月，M2/M6/M13 = 剂量2后1、5和12个月。VRR定义为：(i) 对于最初抗gE抗体呈血清阳性的主体，第二次疫苗接种后抗体浓度是疫苗接种前水平的≥4倍；(ii)对于最初抗gE抗体呈血清阴性的主体，第二次疫苗接种后抗体浓度是抗gE截止值(97 mIU/mL)的≥4倍。误差线表示95％的置信区间。每个时间段(M)中的第一条为HZ/su PreChemo，第二条为HZ/su OnChemo，第三条为安慰剂PreChemo，且第四条为安慰剂OnChemo。

图10图示：ST主体中gE特异性CD4²⁺ T细胞的频率(对CMI的适应性ATP亚组群)，其中gE = 糖蛋白E；ATP = 根据方案规定；CMI =细胞介导的免疫原性；M0 =疫苗接种前；M1 =剂量1后1个月，M2/M13 = 剂量2后1和12个月；Min = 最小值；Max = 最大值；Q1 = 第一四分位数；Q3第三四分位数。

图11图示：通过ST主体中gE特异性CD4²⁺ T细胞频率的CMI VRR (对CMI的适应性ATP亚组群)，其中CMI = 细胞介导的免疫原性。VRR = 疫苗应答率；gE = 糖蛋白E；ATP =根据方案规定；％= 应答者的百分比；M1 = 剂量1后1个月，M2 = 剂量2后1个月；M13 = 剂量2后12个月。疫苗应答率定义为：(i) 对于最初疫苗接种前抗gE CD4²⁺频率高于截止值(320/106 gE特异性CD4²⁺)的主体，抗-gE CD4²⁺频率与疫苗接种前水平相比增加≥2倍；(ii) 对于最初疫苗接种前抗gE CD4²⁺频率低于截止值的主体，抗gE CD4²⁺频率是截止值的≥2倍。误差线表示95％的置信区间。每个时间段(M)中的第一条为HZ/su PreChemo，第二条为安慰剂PreChemo。

图12图示：RTR主体中抗gE抗体的GMC (对体液免疫原性的ATP组群)。每个时间点的第一条为HZ/su；第二条是安慰剂。GMC = 几何平均浓度；gE = 糖蛋白E；ATP = 根据方案规定；IU =国际单位；M0 = 疫苗接种前；M1 = 剂量1后1个月；M2 = 剂量2后1个月；Y = 年岁；CIS = 钙依赖磷酸酶抑制剂或西罗莫司；CS =皮质类固醇；MC =霉酚酸酯化合物。误差线表示95％的置信区间。

图13图示：RTR主体中抗gE抗体的ELISA浓度的体液VRR (对体液免疫原性的ATP组群)。每个时间点的第一条为HZ/su，第二条为安慰剂。VRR = 疫苗应答率；％= 应答者的百分比；其它缩写与图12中相同。VRR定义为：(i) 对于最初抗gE抗体呈血清阳性的主体，第二次疫苗接种后抗体浓度是疫苗接种前水平的≥4倍；(ii) 对于最初抗gE抗体呈血清阴性的主体，第二次疫苗接种后抗体浓度是抗gE截止值(97 mIU/mL)的≥4倍。误差线表示95％的置信区间。

图14图示：RTR主体中gE特异性CD4²⁺ T细胞的频率(对CMI的ATP亚组群)。CMI =细胞介导的免疫原性；Min = 最小值；Max = 最大值；Q1 = 第一四分位数；Q3 = 第三四分位数；其它缩写与图12和13中相同。

图15图示：通过RTR主体中gE特异性CD4²⁺ T细胞频率的CMI VRR (对CMI的ATP亚组群)。缩写与图12-14中相同。疫苗应答率定义为：(i) 对于最初疫苗接种前抗gE CD4²⁺频率高于截止值(320/106 gE特异性CD4²⁺)的主体，抗-gE CD4²⁺频率与疫苗接种前水平相比增加≥2倍；(ii) 对于最初疫苗接种前抗gE CD4²⁺频率低于截止值的主体，抗gE CD4²⁺频率是截止值的≥2倍。误差线表示95％的置信区间。

详细描述

本发明涉及在单一或第一剂量的本文所述的免疫原性组合物后，有效保护免于或预防带状疱疹和/或PHN或减少带状疱疹和/或PHN的严重性的预想不到的发现。以前，受ChlibekR.等人(2014 Vaccine 32:1745-1753)报告的临床免疫数据支持，认为佐剂化的VZV gE亚单位疫苗需要至少2剂量疫苗组合物以产生足够的免疫应答，用于有效预防易感个体中的带状疱疹和/或PHN，即在已知免疫衰老的人群中，例如老年人(50岁(YOA)或更大、60 YOA或更大、70 YOA或更大或80 YOA或更大)，或免疫受损的人类个体(例如，经历免疫抑制疗法的人类个体、遭受免疫抑制感染(例如HIV)的个体)。图1A-C和2A-C取自Chlibek R.等人(2014Vaccine 32:1745-1753)。在图1A-C和2A-C中(如图1A中所示)，研究主体接受：相隔两个月的两个剂量的相同佐剂化(AS01B) VZV gE组合物(包含25 µg、50 µg或100 µg VZV gE)；相隔两个月的两个剂量的非佐剂化VZV gE (100 µg gE/盐水)，或一个剂量的盐水，随后在两个月后一个剂量的佐剂化的VZV gE (盐水+100µg gE/AS01B)。图1A-C显示，在主体的总体组群(图1A)、来自年龄60-69岁的主体组群(图1B)以及年龄大于或等于70岁的主体组群(图1C)中，与单个剂量的佐剂化gE (每剂100 µg gE)相比，在0,2个月2-剂量方案的佐剂化的gE (每个剂量25µg、50µg或100µg gE)后，细胞介导的免疫应答的实质差异。图2A-C显示关于VZV gE抗体水平的相似作用。WO2016/096968中描述了2剂量疫苗接种方案后，佐剂化的VZV gE亚单位疫苗组合物的效力。

现已发现，在一个剂量的本文所述的免疫原性组合物后，个体中的带状疱疹和/或PHN可以被有效地预防或减轻其严重性。已经发现，在施用一个剂量的本文所述的免疫原性组合物(例如疫苗组合物）后2个月之前，所述一个剂量有效保护免于或预防带状疱疹和/或PHN。如实施例1所示，在接受单个剂量的免疫原性组合物的50岁或更大的主体的人群中(即研究中未完成2剂量方案的研究主体的子集)，在76天的平均随访时间期间，在接种疫苗的主体(与接受安慰剂的主体相比)中证实针对HZ的有效预防(见表1)。在实施例2中，将来自接受单个剂量的主体(70 YOA或更大)的数据与来自仅接受两个剂量施用方案的第一剂量的主体(70 YOA或更大)的数据合并。在85天的平均随访时间期间，在这个合并人群(与接种安慰剂的主体相比)中证实单个剂量的免疫原性组合物对HZ的有效保护(见表1)。

根据一个实施方案，所述方法包括施用单个剂量的免疫原性组合物，即它是单剂量免疫程序中的剂量。或者，所述方法包括施用一个剂量，其为多剂量免疫程序中施用的第一剂量。在另一个实施方案中，所述一个剂量是在2-剂量免疫程序中施用的第一剂量。在又进一步的实施方案中，所述一个剂量是2-剂量免疫程序的第一剂量，其中在施用2-剂量免疫程序的第二剂量之前，所述第一剂量有效预防或保护免于HZ。

在多剂量免疫程序的情况下，2 (或多)剂量的疫苗施用之间的间隔可在1个月至约一年(即12个月)之间，或1到3个月之间，或2至12个月之间，或2至6个月之间变化。在一个实施方案中，所述间隔是2、6或12个月。特别地，所述间隔是2个月。同样特别地，所述间隔是12个月。或者，所述间隔为1年。对于本领域技术人员显而易见的是，“1个月”的间隔不限于仅在恰好一个月后发生的那一天施用后续剂量；以“1个月”的时间表的施用通常发生在此前施用后30到48天的时段期间。以2个月间隔的施用通常在49到83天内；12个月的间隔通常在335天和395天之内。

在一个具体实施方案中，所述一个剂量是在具有0,2至0,6月的间隔的2-剂量免疫程序中施用的第一剂量。

在施用一个剂量的免疫原性组合物后，根据本发明的预防或保护的用途或方法(疫苗接种)提供了高效力。一个剂量的免疫原性组合物预防或保护免于HZ的效力表示为与安慰剂相比，仅接受一个剂量的免疫原性组合物后人群中HZ发病率的降低。一个剂量的免疫原性组合物在预防或保护免于HZ中的效力为50％或更高，合适地55％或更高，合适地60％或更高，合适地65％或更高，合适地70％或更高，合适地75％或更高，合适地80％或更高，合适地85％或更高，或者90％或更高。

此外，已经发现根据本发明的效力在多个目标人群中是高的。与在免疫系统衰退的主体中观察到的疫苗效力的通常降低相反，使用根据本发明的免疫原性组合物(例如疫苗组合物）的疫苗接种的效力在多个目标人群中，甚至在年龄超过或大于70岁的个体中异常高，在一个剂量后实现实质性保护。

根据本发明考虑的具体目标人群是≥50岁，≥60岁，≥70岁，50至59岁或60至69岁的人类个体；并且更具体地考虑≥70岁，例如≥71岁，例如≥72岁，例如≥73岁，例如≥74岁，例如≥75岁，例如≥80岁或≥81岁的主体。在一个具体实施方案中，目标人群包括大于70岁的人类个体。

因此，在具体实施方案中：

- 在70岁或更大的成年人群中，一个剂量的免疫原性组合物预防或保护免于HZ的效力为50％或更高，合适地55％或更高，合适地60％或更高，合适地65％或更高；

- 在50岁或更大的成年人群中，一个剂量的免疫原性组合物预防或保护免于HZ的效力为50％或更高，合适地55％或更高，合适地60％或更高，合适地65％或更高，合适地70％或更高，合适地75％或更高，合适地80％或更高，合适地85％以上，或90％或更高；

-在70岁或更大的成年人群中，一个剂量的免疫原性组合物预防或保护免于HZ的效力为50％或更高，合适地55％或更高，合适地60％或更高，合适地65％或更高，如在所述一个剂量后两周、一个月、六周内，或在两个月内测量的；

- 在50岁或更大的成年人群中，一个剂量的免疫原性组合物预防或保护免于HZ的效力为50％或更高，合适地55％或更高，合适地60％或更高，合适地65％或更高，合适地70％或更高，合适地75％或更高，合适地80％或更高，合适地85％或更高，或90％或更高，如在所述一个剂量后两周、一个月、六周内，或在两个月内测量的。

免疫原性组合物的剂量可以单剂量方案施用。如本文所用的，“单个剂量”或“单剂量方案”是指仅施用一个剂量以达到预防或保护。没有计划或指导经历单剂量方案的主体以例如在随后一年、两年、18个月、三年、四年或更长的时间内获得第二剂量。因此，在包括施用单个剂量的免疫原性组合物的方法中，所述方法包括施用步骤，所述施用步骤由施用单个剂量的免疫原性组合物组成。

适合于用本发明治疗的其他特定人群是免疫受损的人群或个体，例如HIV阳性患者或患有AIDS的患者，移植患者，例如肾移植患者或造血细胞移植患者，患有血液系统恶性肿瘤的患者，实体瘤患者或在其他方面免疫缺陷或免疫受损的患者。

将受益于一个剂量或第一剂量的免疫原性组合物的及时施用的、面临免疫力下降或免疫抑制治疗的主体的另外具体人群是具有造血干细胞移植、血液系统恶性肿瘤、实体器官恶性肿瘤、实体器官移植、终末期肾脏疾病、牛皮癣、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和炎症性肠病的患者。

因为在一个剂量的免疫原性组合物后对HZ的有效预防的早期出现，通过一个剂量(例如多剂量方案中的第一剂量)提供的保护免于或预防HZ，对登记接受免疫抑制剂疗法或其他方面面临自然免疫将在不久的将来受到抑制的情况的主体特别有用。因此，本发明提供了在主体中开始免疫抑制治疗之前或伴随免疫抑制疗法开始使用一个剂量的免疫原性组合物。因此，适合于用本发明治疗的特定人群是具有免疫能力(能够在正常范围内产生免疫应答)但计划在不久的将来(例如，施用一个剂量后一周、两周、三周、一个月、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或一年内；或施用一个剂量后一周至一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或一年之间；或施用一个剂量后两周至六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或一年之间；或施用一个剂量后一个月至六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或一年之间)接受免疫抑制疗法或接受免疫抑制疗法的可能性增加的人。合适的主体包括那些开始(或登记接受)免疫抑制剂(也称为免疫抑制或免疫抑制性)疗法(例如化学疗法、放射疗法或免疫抑制药物化合物)的主体，以及计划经历器官移植的主体或登记在接受器官移植的等待名单的那些。

目前，没有带状疱疹(HZ)疫苗被批准用于免疫抑制或免疫受损的个体。据估计，接受免疫抑制化学疗法(chemo)的患有实体瘤(ST)的个体的HZ发病率是美国总人口的HZ发病率的3-4倍(12/1000对比3.2/1000人-年) (Habel等人，Cancer Epidemiol BiomarkersPrev, 2013;22:82-90；Insinga等人，J Gen Intern Med 2005;20:748-53)。据估计，具有实体器官移植(SOT)的个体中的带状疱疹发病率是美国总人口的带状疱疹发病率(3.2/1000人-年)的8-9倍。

在进一步的实施方案中，根据本发明考虑的目标人群包括先前由活减毒VZV疫苗接种的主体，或由其组成。据报道，在使用活减毒VZV疫苗免疫接种后，对HZ和/或PHN的保护迅速减弱(Tseng HF等人，J Infect Dis (2016) 213(12):1872-5)。现已发现，本文所述的免疫原性组合物可有效地用于预防先前使用活减毒VZV疫苗接种(例如，大于3年前、4年前、大于5年前、大于6年前、大于7年前、大于8年前，或大于10年前)的主体中的带状疱疹(或HZ)和/或PHN。

根据本发明的免疫原性组合物(例如疫苗组合物）包含与佐剂组合的重组VZV gE抗原。

如本文公开的，合适的VZV gE抗原是被截短以除去羧基末端锚区域的VZV糖蛋白gE (也被称作gp1)，或其免疫原性变体。Davison等人(J Gen Virol, 67:1759-1816(1986))公开了完整的水痘带状疱疹病毒(VZV)核苷酸序列。野生型或全长gE蛋白由623个氨基酸组成，其包含信号肽、所述蛋白的主要部分、疏水的锚区域(残基546-558)和C-末端尾。一个方面，使用VZV gE C-末端截短物(也被称作截短的gE或gE截短物)，其中所述截短从羧基末端除去全部氨基酸残基的4-20%，例如缺少残基547-623。在可选的实施方案中，所述截短的gE缺少羧基末端锚区域(例如，C-末端区域中的内部缺失，适当地是野生型序列的大约氨基酸547-558)。在一个实施方案中，VZV gE抗原是截短的gE，其包含SEQ ID NO. 1的序列或者由其组成。在进一步的实施方案中，VZV gE抗原不呈现为融合蛋白的形式，所述融合蛋白包含进一步的(非-gE) VZV蛋白或其免疫活性片段。

VZV gE抗原，包括无锚的VZV gE抗原(其也是免疫原性变体)及其产生，描述于EP0405867 (通过引用并入本文)及其中的参考文献中[另请参见Vafai A. Antibodybinding sites on truncated forms of varice lla-zoster virus gpI(gE)glycoprotein Vaccine 1994 12:1265-9]。EP0192902也公开了gE及其生产。Haumont等人(Virus Research (1996) vol 40, p199 -204；在此通过引用完全并入)也公开了截短的gE。WO2006/094756 (US 7939084，其通过引用并入本文)中公开了适于根据本发明使用的佐剂化VZV gE组合物，即，与佐剂组合的羧基末端截短的VZV gE，所述佐剂包括QS21、3D-MPL以及进一步含有胆固醇的脂质体。Leroux-Roels I.等人(J. Infect. Diseases 2012:206 1280-1290)报告了I/II期临床试验，其评估了佐剂化的VZV 截短的gE亚单位疫苗。

如本文所用，术语“变体”是指相对于其天然存在的形式被修饰的抗原。如本文所公开的，合适的“变体”是“免疫原性变体”，因此其与天然抗原足够相似以保留抗原性质，并且仍然能够诱导与天然抗原交叉反应的免疫应答。变体多肽可包含与参考序列(即野生型序列)相比时的多个取代，优选保守取代，即一个氨基酸被具有相似特性的另一个氨基酸取代，例如脂肪族氨基酸Val、Ile、Leu、Met，或碱性氨基酸Lys、Arg、His，或芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp (例如1-50，诸如1-25，特别是1-10，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变，且特别是可以改变(例如取代或缺失) 1个氨基酸残基)。特别地，考虑到关于SEQ ID No.1的变体。适当地，这样的取代不发生在主要表位(即，在免疫学上重要的表位)的区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。已知VZV gE含有B细胞和CD4+ T细胞表位，如R.E.Bergen等人(Viral Immunology, 4 (3) (1991), pp. 151–166)；W.J. Fowler等人(Virology, 214 (2) (1995), pp. 531–540)；G.N. Malavige等人(Clin Exp Immunol,152 (3) (2008), pp. 522–531)和L. Wu & B. Forghani (Arch Virol, 142 (2)(1997), pp. 349–362)公开。蛋白变体还可以包括其中与参考序列相比，***额外的氨基酸的那些，例如，此类***可以发生在1-10个位置(诸如1-5个位置，适当地1或2个位置，特别是1个位置)，且可以，例如，在每个位置涉及添加50个或更少的氨基酸(诸如20个或更少，特别是10个或更少，特别是5个或更少)。适当地，这样的***不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。***的一个实例包括辅助所讨论的抗原的表达和/或纯化的组氨酸残基的短段(例如，2-6个残基)。变体还包括其中与参照序列相比，已经缺失氨基酸的那些，例如，这样的缺失可以发生在1-10个位置(诸如1-5个位置，适当地1或2个位置，特别是1个位置)，且可以，例如，在每个位置涉及20个或更少氨基酸的缺失(诸如10个或更少，特别是5个或更少，尤其是2个或更少)。适当地，这样的缺失不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。技术人员将认识到，特定蛋白变体可以包含取代、缺失和添加(或其任意组合)。变体优选地表现出与相关参照序列的至少约70%同一性，更优选地至少约80%同一性，和最优选地至少约90%同一性(诸如至少约95%、至少约98%或至少约99%)。适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。可以通过合适的免疫学测定(诸如ELISA或流式细胞术)，测量给定变体是否引起这样的免疫应答。

用于针对HZ或PHN对人个体进行免疫接种的VZV gE抗原的量被选择为在典型疫苗接种者中诱导免疫保护性应答而没有显著的不良副作用的量。这样的量将取决于所采用的具体抗原及其如何呈递而变化。通常，预计每个剂量将包含1-1000μg的蛋白，例如2-100μg或5-60μg。在使用VZV gE抗原的情况下，则一方面在人中可以使用25-100μg的gE，例如40-100μg gE用于人使用，一方面约25μg、约50μg或约100μg的gE，合适地25μg、50μg或100μg的gE。在优选的实施方案中，VZV gE抗原(例如，SEQ ID NO. 1)以50 µg的剂量使用。如本文所公开的，“剂量”是单次施用中施用的量。

如本文所公开，合适的佐剂包含脂质体制剂中的TLR-4配体和皂苷。

用于在本发明中使用的特别适合的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美洲的树木皂树(Quillaja saponaria Molina)分离的皂苷制剂，并且在1974年由Dalsgaard等人首先描述(“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)为具有佐剂活性。已经通过HPLC分离Quil A的纯化级分，其保留佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)。QS21是从皂树的树皮衍生出的天然皂苷，其通常诱导CD8+细胞毒性的T细胞(CTL)、Th1细胞和优势的IgG2a抗体应答，并且是在本发明的上下文中优选的皂苷。

适当地，将皂苷提供在其低反应原性的组合物中，其中使用外源甾醇将皂苷猝灭。合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个特定实施方案中，所述佐剂组合物包含胆固醇作为甾醇。这些甾醇是本领域众所周知的，例如在MerckIndex，第11版，第341页中，将胆固醇公开为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。存在几种特定形式的较低反应原性组合物，其中使用外源胆固醇猝灭QS21。将皂苷/甾醇配制在脂质体制剂结构中。用于获得脂质体制剂中的皂苷/甾醇的方法描述于WO 96/33739 (US6846489，通过引用并入本文)，特别是实施例1中。甾醇与磷脂的相对量是1-50% (mol/mol)，合适地20-25%。

当活性皂苷级分为QS21时，QS21：甾醇的比例通常为1:100至1:1 (w/w)的范围，合适地在1:10至1:1 (w/w)之间，并且优选为1:5至1:1 (w/w)。合适地存在过量的甾醇，QS21：甾醇的比例为至少1:2 (w/w)。在一个实施方案中，QS21：甾醇的比例为1:5 (w/w)。甾醇合适地是胆固醇。

佐剂组合物包含TLR-4激动剂。TLR-4激动剂的合适实例是脂多糖，合适地是脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰基脂质A，或更具体地是3-脱酰化的单磷酰基脂质A (3D-MPL)。

3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals S.A.以MPL的名称销售，并且在全文中称为MPL或3D-MPL。参见例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094(其各自通过引用并入本文)。3D-MPL主要促进具有IFN-g (Th1)表型的CD4+ T细胞应答。3D-MPL可以根据GB 2 220 211 A中公开的方法产生。化学上，它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰化的单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL来制备佐剂组合物。小颗粒3D-MPL具有可以使它经0.22μm滤器无菌过滤的粒径。这样的制剂描述在WO 94/21292中。优选地，使用粉末状3D-MPL来制备本发明的佐剂组合物。

可以使用的其它TLR-4激动剂是烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)，诸如在WO98/50399或美国专利号6,303,347中公开的那些(也公开了AGP的制备方法)，合适地如美国专利号6,764,840中公开的RC527或RC529或AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR-4激动剂，且一些是TLR-4拮抗剂。在本发明中，考虑到TLR-4激动剂的使用。

其他合适的TLR-4配体如WO2003/011223 (US20020176861)和WO 2003/099195(US 7833993)中所述，二者均通过引用并入本文，例如WO2003/011223第4-5页或WO2003/099195第3-4页上公开的化合物I、化合物II和化合物III，并且特别是WO2003/011223中公开的那些化合物，如ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764。例如，一种合适的TLR-4配体是ER804057。

可以在本发明中使用的其他TLR4激动剂包括吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，例如描述于WO2008/153541或WO2009/143457或文献Coler RN等人，(2011) Development andCharacterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as aVaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333和Arias MA等人(2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to IntranasalImmunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144。出于定义可以在本发明中使用的TLR4激动剂的目的，将WO2008/153541或WO2009/143457通过引用并入本文。

佐剂组合物包含皂苷和TLR4激动剂二者。在具体的实例中，佐剂组合物包含QS21和3D-MPL。

TLR-4激动剂(诸如脂多糖，如3D-MPL)可以1-100μg/佐剂组合物的人剂量的量使用。可以以约50μg的水平使用3D-MPL，例如40-60μg之间，适当地45-55μg之间，或49-51μg之间或50μg。在进一步的实施方案中，所述佐剂组合物的人剂量包含约25 µg的水平的3D-MPL，例如20-30 µg之间，合适地21-29 µg之间或22-28 µg之间或23-27 µg之间或24-26 µg之间或25 µg。

皂苷(例如QS21)可以1-100μg/佐剂组合物的人剂量的量使用。可以以约50μg的水平使用QS21，例如40-60μg之间，适当地45-55μg之间，或49-51μg之间或50μg。在进一步的实施方案中，所述佐剂组合物的人剂量包含约25μg的水平的QS21，例如20至30μg之间，合适地为21-29μg之间或22-28μg之间或23-27μg之间或24-26μg之间或25μg。QS21可以以每个剂量≤60 µg、≤55µg或≤30µg的剂量存在。QS21可以以每个剂量≥20 µg、≥40µg或≥45µg的剂量存在。

TLR-4激动剂与皂苷的重量比合适地在1:5至5:1之间，合适地是1:1。例如，当3D-MPL以50μg或25μg的量存在时，那么合适地QS21也可以以50μg或25μg/佐剂组合物的人剂量的量存在。

“脂质体制剂”的意思是将皂苷和TLR-4激动剂与脂质体一起配制。有意用于本发明的脂质体含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温适当地是非结晶的，例如蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱。在优选的实施方案中，本发明的脂质体含有DOPC。所述脂质体还可以含有带电荷的脂质，其增加脂质体-QS21结构对于由饱和脂质构成的脂质体的稳定性。在这些情况下，带电荷的脂质的量合适地为1-20% w/w，优选5-10%。

WO2013/041572 (US20140234403，通过引用并入本文)，特别是实施例3和4，进一步公开了制备DOPC脂质体的脂质体大批制剂(bulk preparation)的方法，所述DOPC脂质体还包含胆固醇和3D-MPL，用于进一步与QS21混合，从而获得适合根据本发明使用的佐剂。

在具体实施方案中，根据本发明使用的免疫原性组合物基本上由与佐剂组合的被截短以去除羧基末端锚区域的VZV gE抗原或其衍生物组成，所述佐剂包含QS21、3D-MPL和含胆固醇的脂质体。

通常通过肌内途径施用组合物，但也可考虑替代途径，例如皮内或皮下。

根据本发明的免疫原性组合物(例如疫苗组合物）用于人类个体的疫苗接种，即保护免于或预防带状疱疹(HZ)，即预防VZV的再活化（也称为带状疱疹），和/或带状疱疹后神经痛(PHN)。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物(例如疫苗组合物）用于保护免于或预防带状疱疹的发生。在确实发生HZ的情况下，则与未接种疫苗的个体相比，适当地降低带状疱疹的严重程度(即，改善HZ)。而且，当确实发生HZ时，可发展其他疾病综合征，例如带状疱疹后神经痛。

PHN是最常见的HZ严重并发症。PHN定义为在HZ皮疹消退后持续存在的疼痛。受影响的患者通常主诉灼痛、抽动、间歇性剧痛或电击样疼痛或触摸痛。较大的年龄是PHN的明确风险因素。其他风险因素可包括严重的HZ皮疹和疼痛的HZ前驱症状。PHN在几个月内趋于改善。大约70-80％的病例在1年内消退，但在一些人中，PHN持续多年(Dworkin等人，2007.Clin. Infec. Dis.; 44 Suppl. 1: S1-S26)。PHN通常被定义为在皮疹出现后90天的疼痛。PHN的强度、特征和持续时间在个体之间差异很大。因此，专门设计了旨在评估与HZ相关的疼痛(程度和持续时间方面)和不适的特定调查表，称为带状疱疹简明疼痛量表(ZBPI)。所述ZBPI调查表的副本可得自例如Coplan等人，2004. J. Pain. 5(6):344–356。这种ZBPI特别有用，并通常在评估(例如在临床试验中)旨在预防或保护免于HZ相关的疼痛(包括PHN)的化合物时使用。

在进一步的实施方案中，本发明涉及在保护免于或预防带状疱疹后神经痛中的用途。在确实发生HZ的情况下，则与未接种疫苗的个体相比，适当地降低PHN的严重性(即，改善PHN)。如本文所公开的用途或方法将增强通常由自然感染诱导的免疫应答。如本文公开的，应当理解，当降低HZ和/或PHN的发病率和/或发生的严重性时，发生“预防”或“保护免于”HZ和/或PHN。可以评估与另一人群相比，在鉴定的人群中的预防或保护免于HZ和/或PHN，例如，与相当的但未疫苗接种的人群相比，疫苗接种的人群中的预防或保护免于HZ和/或PHN。严重性的降低是指与HZ和/或PHN相关的总体疾病或任何临床表现的减少。例如，严重性的降低是指与HZ和/或PHN相关的疼痛的减少，所述疼痛可以使用ZBPI调查表适当地测量和监测。

在进一步的实施方案中，根据本发明的用途或方法用于保护免于或预防HZ和PHN二者。

甚至更优选的是前述优选的和特别优选的实施方案中的每一个，其中所述VZV gE抗原具有SEQ ID No. 1的序列且以50µg的剂量存在，且其中QS21和3D-MPL也以50µg的剂量存在。

进一步的特定实施方案是免疫原性组合物(例如疫苗组合物），其包含与佐剂组合的被截短以除去羧基末端锚区域的VZV gE抗原或其衍生物，所述佐剂包含QS21、3D-MPL和含胆固醇的脂质体，所述组合物用于如下方法中，所述方法用于在80岁或更大的个体中保护免于或预防带状疱疹(HZ)和/或带状疱疹后神经痛，使PHN的发病率下降至少60%或至少70%，持续至少5年。

术语

如本文所用，与其野生型或全长形式相比，截短的抗原或蛋白是缺少一氨基酸区域的抗原或蛋白。“截短的”抗原或蛋白可以是从野生型或全长分子中去除所述区域的结果，或者可以从头制备，例如以截短的形式重组产生。

应当理解，“疾病的预防”并不意味着在100％接受治疗的主体中预防疾病。

如本文所用，“免疫抑制剂医学疗法”包括使用免疫抑制剂药物化合物的治疗。免疫抑制剂药物化合物是抑制或降低身体免疫系统的强度的药物。当用于降低移植器官排斥的风险时，免疫抑制剂医学疗法可被称为抗排斥疗法或抗排斥药物化合物的使用。此外，免疫抑制剂医学疗法可用于治疗自身免疫疾病，例如狼疮、牛皮癣和类风湿性关节炎。免疫抑制剂药物化合物包括皮质类固醇，例如***、布***和***龙；钙依赖磷酸酶抑制剂，例如环孢霉素、他克莫司；mTor抑制剂，例如西罗莫司、依维莫司；IMDH (肌苷单磷酸脱氢酶)抑制剂，例如硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯；和生物制品，例如单克隆抗体。

通过以下非限制性实施例来说明本发明。

实施例1：在50岁和更大的成年人中针对HZ的疫苗效力

实施例1描述了III期、随机化的、观察者盲的、安慰剂对照的、多中心、临床疫苗接种试验(试验I)的结果，其证实了当在50岁和更大的成年人中以0,2个月时间表肌肉内地施用时，候选HZ亚单位疫苗(即GSK Biologicals的VZV gE/AS01B疫苗(HZ/su))的预防效力、安全性和免疫原性。

研究群体包括在50-59岁(YOA)、60-69 YOA、70-79 YOA和≥80 YOA的年龄范围内，没有严重免疫受损病况的男性和女性。将70-79 YOA层和≥80 YOA层组合用于初步分析。将≥70 YOA组群的大约20-25%分配至≥80 YOA的人，确保这个特别易感人群得到充分代表。

在这个试验中测试的候选HZ疫苗是佐剂化的重组VZV gE疫苗，如本文所述。在这个研究中包括作为阴性对照(安慰剂)的盐水溶液，以评价候选HZ疫苗的效力和安全性概况。

临床疫苗接种试验的目标包括在以下每个年龄范围内的主体中，评估与安慰剂相比疫苗预防HZ的效力：50-59 YOA、60-69 YOA和≥70 YOA，如通过HZ风险降低所测量的。

研究设计由图3A和3B示出。

研究包括两个处理组，安慰剂组和疫苗组。安慰剂组接受NaCl溶液作为对照。NaCl溶液提供在单剂量小瓶(0.5 mL/剂量)中，其含有每0.5 mL剂量150 mM NaCl。疫苗组接受研究疫苗。每0.5 mL剂量的研究疫苗含有50μg的VZV gE抗原、50μg 的3D-MPL、50μg的QS21，和脂质体(DOPC + 胆固醇)。研究疫苗提供在2个小瓶中，一个含有VZV gE抗原，且另一个含有佐剂系统AS01B。

• AS01B佐剂系统作为液体制剂提供在单剂量小瓶中，每个小瓶包含至少0.5 mL的佐剂。一个0.5 mL剂量的AS01B制剂含有与脂质体混合的50µg 3D-MPL和50µg QS21。根据在WO 2013/041572的实施例3和4中公开的制备方法配制佐剂系统。

• VZV gE抗原是具有SEQ ID NO: 1序列的截短的gE。根据WO2006/094756 (通过引用整体并入本文)的实施例2中描述的方法得到抗原。VZV gE抗原以冻干形式提供在单剂量小瓶中。每个小瓶含有62.5µg的重组的纯化gE和制剂赋形剂。因此，当用全部体积的AS01B佐剂重构每个小瓶中的62.5µg VZV gE时，每个疫苗剂量含有50 µg VZV gE抗原/0.5mL剂量的重构疫苗。

对于疫苗组和安慰剂组，疫苗接种时间表分别是两个剂量的研究疫苗或对照盐水，且第一剂量是在第0个月(访问1)且第二剂量是在第2个月(访问2)。将疫苗肌肉内施用。

按照1:1比率(疫苗：安慰剂)，将合格的主体随机化至疫苗/安慰剂组。主体按年龄分层：50-59 YOA；60-69 YOA；70-79 YOA和≥80 YOA，比例约为8:5:3:1。将70-79 YOA层和≥80 YOA层组合用于初步分析。

在满足以下条件时，进行初步HZ效力分析：在改良的总疫苗接种组群(mTVc)中，累积至少196例HZ的确认病例。总疫苗接种组群(TVc)包括就实际施用疫苗而言，所有接种疫苗的主体。mTVc是用于效力分析的初步组群，其排除了TVc中的以下主体用于效力分析：所述主体没有施用第二次疫苗接种或在第二次疫苗接种后1个月之前发展成HZ的确认病例。Himal L.等人2015 NEJM 372(22):2087报告了对其设计测试组合物的2-剂量免疫程序后的疫苗效力。

本文报告的是研究性疫苗组合物在仅单个剂量后的HZ效力的预想不到的发现。对从参加研究但未完成规定的2-剂量方案的主体获得的数据进行的分析显示，在50 YOA及更大的总成年人群中，单个剂量施用后针对HZ的有效保护作用(见表1)。平均随访时间为76天。

表1：一个剂量的疫苗组合物后的效力分析结果

N = 每个组中包括的主体数目

n = 具有至少一个带状疱疹(HZ)确认病例的主体数目

n/T (每1000)= 每年报告至少一个事件的主体的发病率

LL, UL = 95%置信下限和置信上限

CI = 置信区间。

实施例2：在70岁和更大的成年人中针对HZ的疫苗效力

与实施例1中所述的III期试验同时，在年龄70岁和更大的成年人中进行另一项III期试验(试验II)。另一项III期试验是随机化的、观察者盲的、安慰剂对照的、多中心、临床疫苗接种试验，其评估当在70岁和更大的成年人中以0,2-月时间表肌肉内地施用时，候选HZ疫苗(即GSK Biologicals的VZV gE/AS01B疫苗)的预防效力、安全性和免疫原性。

研究人群包括在70-79岁(YOA)和≥80 YOA的年龄范围内，没有严重免疫受损病况的男性和女性。将≥70 YOA组群的大约20-25%分配至≥80 YOA的人，确保这个特别易感人群得到充分代表。

在这个试验中测试的候选HZ疫苗是佐剂化的重组VZV gE疫苗，如本文所述。在这个研究中包括作为阴性对照(安慰剂)的盐水溶液，以评价候选HZ疫苗的效力和安全性概况。

临床疫苗接种试验的目标包括在≥70 YOA的主体中，评估与安慰剂相比疫苗预防HZ的效力，如通过HZ风险降低所测量的。

研究设计由图4示出。

研究包括两个处理组，安慰剂组和疫苗组。安慰剂组接受NaCl溶液作为对照。NaCl溶液提供在单剂量小瓶(0.5 mL/剂量)中，其含有每0.5 mL剂量150 mM NaCl。疫苗组接受研究疫苗。每0.5 mL剂量的研究疫苗含有50μg的VZV gE抗原、50μg 的3D-MPL、50μg的QS21、和脂质体(DOPC + 胆固醇)。研究疫苗提供在2个小瓶中，一个含有VZV gE抗原，且另一个含有佐剂系统AS01B。AS01B佐剂和VZV gE抗原如实施例1中所述。

按照1:1比率(疫苗：安慰剂)，将合格的主体随机化至疫苗/安慰剂组。主体按年龄分层：70-79 YOA和≥80 YOA，比例约为3:1。将70-79 YOA层和≥80 YOA层组合用于初步分析。

基于在实施例1所述的试验中获得的效力结果，已经在本试验中重新评估了疫苗在预防HZ中的效力的统计功效，并且作为结果，在满足以下条件时，进行初步HZ效力分析的重新评估：在改良的总疫苗接种组群(mTVc)中，累积至少211例HZ的确认病例。总疫苗接种组群(TVc)包括就实际施用疫苗而言，所有接种疫苗的主体。mTVc是用于效力分析的初步组群，其排除了以下主体：所述主体没有施用第二剂量的疫苗或安慰剂，或在第二剂量后1个月之前发展成HZ的确认病例。

因为试验II中一个剂量后可得的数据有限，所以将试验I中70 YOA或更大主体的数据与试验II数据合并，以评估70 YOA或更大的主体中，一个剂量的疫苗后的疫苗效力。所得的分析提供在表2中。平均随访时间为85天。

表2

N = 每个组中包括的主体数目

n = 具有至少一个带状疱疹(HZ)确认病例的主体数目

n/T (每1000)= 每年报告至少一个事件的主体的发病率

LL, UL = 95%置信下限和置信上限

CI, 置信区间。

实施例3：在此前使用活减毒带状疱疹疫苗进行疫苗接种的成年人中针对HZ的疫苗效力

本实施例报告了III期、开放标签、小组匹配的多中心研究。登记在研究开始前≥5年，此前使用活减毒VZV疫苗(也称作ZVL, (ZOSTAVAX))进行疫苗接种的≥65岁的成年人(组1：HZ-PreVac)和组匹配的未接受过ZVL的成年人(组2：HZ-NonVac)。

根据预定义的变量年龄(65-69、70-79，≥80)、性别、种族(高加索人、非裔美国人、西班牙裔和其他)和医学病况，将HZ-NonVac组的参与者与HZ-PreVac组的参与者进行组匹配。将医学病况按层级顺序排列(免疫介导的疾病、糖尿病、当前的抑郁症、肺部疾病、心脏病症，没有这些医学病况)，并根据排名最高的病况对主体进行匹配。

研究参与者是在首次使用VZV gE/AS01B疫苗接种时，65岁或更大的男性或女性。有资格纳入HZ-PreVac组的成年人在研究开始前至少5年接受ZVL。如果成年人在30天内已接受或计划接受活疫苗，在30天内已接受任何经研究性或未注册的药物或疫苗，在180天内已接受免疫抑制剂或其他免疫调节药物持续超过14天，或在首次VZV gE/AS01B疫苗接种之前180天内已接受任何长效的免疫调节药物，则将其排除参与。具有HZ病史的成年人，或计划接受VZV gE/AS01B以外的HZ疫苗的成年人，以及对任何疫苗成分具有任何反应或超敏反应历史的成年人，将其排除参与。

研究目标：研究的共同主要目标是比较HZ-PreVac-和HZ-NonVac组之间，在VZVgE/AS01B剂量2后1个月的体液免疫应答，以及评估两个研究组中，在直到VZV gE/AS01剂量2后1个月的安全性和反应原性。这件文稿中提出的第二研究目标是评估两个研究组中，在基线(疫苗接种前)以及剂量1后和剂量2后1个月，对VZV gE/AS01B疫苗的体液和CMI应答。

免疫原性的评估：在基线以及第一和第二疫苗剂量后1个月，收集血液样品用于免疫原性评估(图5)。通过抗gE ELISA测量抗gE抗体浓度。测定截止值为97 mIU (国际单位)/mL。通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术评估CMI应答。简言之，在体外用gE肽刺激外周血单核细胞，此后，测定表达所评估的4种标志物(干扰素-γ、白介素-2、肿瘤坏死因子-α和CD40配体)中至少2种活化标志物的gE特异性CD4+ T细胞(在此称作CD4²⁺)的频率。

统计分析：所有统计分析均使用Windows SDD 4.3.3上的统计分析系统(SAS)版本9.3 TS1M2进行。

对根据方案规定的组群进行免疫原性数据分析，所述根据方案规定的组群包括遵循方案指定程序且可获得其数据的所有参与者。为了共同主要终点数据的推论分析，对于对数转换的抗体浓度数据使用了方差分析(ANOVA)模型，且包括疫苗组和组匹配的分类作为固定效应。计算两个研究组之间的调整平均值和平均值差连同双侧CI，并且反变换为原始单位，以提供调整的几何平均浓度(GMC)和GM比例。根据方案，如果在剂量2后1个月(活跃期)，HZ-NonVac相对于HZ-PreVac组的调整GMC比例的双侧CI的上限低于1.5，则证实应答的非劣效性。使用描述性分析，评估了第二免疫原性终点数据，包括在此呈现的CMI数据。对于描述性数据，分别对每组获取GMC的95% CI。首先，基于对数转换值正态分布且方差未知的假设，获得对数变换的浓度的平均值的95% CI。随后，通过反对数变换此前计算的对数变换浓度的平均值的95% CI，计算对GMC的95% CI。

如在先前临床试验中所见，基于对VZV gE/AS01B的抗gE抗体应答的变异性，每个研究组190名可评估参与者的样品大小将以至少99％的功效(power)证实体液免疫原性中的非劣效性。

结果

参与者：筛选总计822名老年人参与本研究。其中，根据预先确定的标准(年龄、性别、地理血统和医学病况)，将215名先前未接种疫苗的人与215名先前曾接种ZVL疫苗的人相匹配。(图2)。在430名接种疫苗的参与者中，425名(98.8％)完成了研究的活跃期。两个研究组中的参与者的人口统计学特征相当，并呈现于表3中。

免疫原性：首次疫苗接种之前，HZ-PreVac组的所有可评估参与者和HZ-NonVac组的98％的可评估参与者，对抗gE抗体呈血清阳性(抗gE浓度高于97 mIU/mL的测定截止值)。在两个研究组中，抗gE抗体GMC在基线处显示相似，并且在两个疫苗剂量后显著增加(图6A和表4)。对于两个研究组，剂量2后的抗gE抗体GMC是相当的，且调整的GMC比例为1.04 (表5)。满足主要免疫学研究目标，因为HZ-NonVac组相对于HZ-PreVac组的调整GMC比例的上限低于1.5截止值(表5)。

在基线处，两个组中的中值CD4²⁺ T细胞频率显示相似。剂量1后，两个组中的gE特异性CD4²⁺ T细胞的中值频率均增加，且剂量2后，观察到更显著的总体增加(图6B和表4)。研究组之间明显CD4²⁺ T细胞频率无差异。

结论

这项研究显示，与从未接受过这种疫苗接种的成年人相比时，在5年多以前使用活减毒带状疱疹疫苗(ZOSTAVAX)进行免疫接种的大于65岁的成年人中，剂量2后一个月对VZV gE/AS01B的体液免疫应答没有劣效。这项研究显示，先前使用ZVL疫苗接种对于针对VZV gE/AS01B的体液免疫应答没有负面影响。此外，描述性分析未显示CMI应答中的任何明显差异，如通过CD4²⁺ T细胞频率评估的，并且在两个研究组中均观察到疫苗接种后CD4²⁺ T细胞频率的增加。

表3：研究参与者的特征(总疫苗接种组群)

HZ-NonVac = 从未接受活减毒带状疱疹疫苗(ZVL)的参与者；HZ-PreVac = 在研究开始前≥5年接受ZVL的参与者；SD = 标准偏差；N = 参与者总数目；n (％) = 给定分类中的参与者数目(百分比)。

表4：每10⁶个细胞的表达至少两种活化标志物的gE特异性CD4⁺ T细胞的频率以及抗gE抗体的几何平均浓度

N = 具有可获得结果的参与者数目；HZ-NonVac = 从未接受活减毒带状疱疹疫苗(ZVL)的参与者；HZ-PreVac = 在研究开始前≥5年接受ZVL的参与者；95% CI = 95％置信区间；CD4²⁺：表达CD40配体、白介素-2、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ中的至少两种活化标志物的CD4⁺ T细胞；GMC：几何平均浓度；Q1，Q3：第一和第三四分位数；疫苗前(pre-vac) = 第一剂量的HZ/su前；D1后 = 第一剂量的HZ/su后一个月；D2后 = 第二剂量的HZ/su后一个月。

表5：剂量2后1个月，抗gE抗体浓度的调整GMC和调整GMC比例(根据免疫原性的方案组群)

HZ-NonVac = 从未接受活减毒带状疱疹疫苗(ZVL)的参与者；HZ-PreVac = 在研究开始前≥5年接受ZVL的参与者；调整的GMC = 针对组匹配变量调整的几何平均抗体浓度；N =具有疫苗接种前和疫苗接种后的可获得结果的参与者数目；95％ CI = 双侧95％置信区间; LL =下限；UL =上限

^† = 如果≤1.5，则认为满足主要目标。

实施例4：在免疫抑制化学疗法治疗之前或期间进行疫苗接种的患实体瘤的成年人的免疫原性

实施例4提供了GSK Biologicals的VZV gE/AS01B疫苗(HZ/su疫苗，两个剂量)在患实体瘤(ST)的成年人中的II/III期、随机化的、安慰剂对照的、观察者盲的、多中心临床试验的结果，其中在免疫抑制化学疗法之前或期间施用第一剂量的疫苗(NCT临床试验标识符：NCT01798056)。

方法：

患实体瘤(ST)的成年人(> 18岁)接受两个剂量的HZ/su或安慰剂(Pl)，以1-2个月的间隔肌肉内施用。将主体按4:4:1:1随机化，以在化学疗法(pre-chemo) 前8-30天(D)(HZ/su-PreC组，安慰剂-PreC)、或在化学疗法开始时(±1天(D))(HZ/su-OnC，Pl-OnC)接受第一剂量。因此，将ST成年人按1:1随机化，以1-2个月的间隔经肌肉内接受2个剂量的HZ/su或安慰剂，并且这两个组(HZ/su和安慰剂)进一步随机化(4:1)如下：(i) PreChemo组在开始化疗周期之前8-30天接受第一次疫苗接种；(ii) OnChemo组在化学周期开始时接受第一次疫苗接种(图7)。所有第二剂量均在第一剂量后1-2个月以及随后化疗周期开始时(±1天)施用。HZ/su疫苗含有50μg的VZV gE和AS01B (50μg的3-O-脱酰基-4'-单磷酰基脂质A (MPL，由GSK生产)和50μg QS21，以及脂质体)。

232名主体纳入总疫苗接种组群中：117名HZ/su接受者(90名PreChemo，27名OnChemo)和115名安慰剂接受者(91名PreChemo，24名OnChemo)。

185名主体纳入对于体液免疫原性的根据方案规定(ATP)组群中：65名HZ/su_PreChemo、78名安慰剂_PreChemo、22名HZ/su_OnChemo、20名安慰剂_OnChemo。

58名主体纳入对于CMI的ATP子组群中：27名HZ/su_PreChemo，31名安慰剂_PreChemo。

研究组之间的人口统计学特征相当(表6)。最常见的ST是乳腺癌，其次是结直肠癌、肺癌和其他(包括胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、头颈癌、喉癌、口腔癌、鼻窦癌、扁桃体癌、粘液性脂肪肉瘤、肝癌、食管癌、肾癌、肉瘤、胃癌、睾丸胚胎癌、甲状腺癌、舌癌、子***、尿道上皮癌、子宫平滑肌肉瘤)类型的癌症。

表6：研究主体的人口统计学特征(体液免疫原性的ATP组群)

ATP = 根据方案规定；N = 主体总数目；SD = 标准偏差；n (％) = 给定分类中主体的数目(百分比)。

免疫原性评估：

收集用于免疫原性评估的血液样品，并进行评估，如表7中所示。在剂量2后1个月(M2)和12个月(M13)，对于gE体液免疫和gE特异性CD4⁺细胞介导的免疫(CMI)应答，评估疫苗应答率(VRR)和几何平均值(GMs)/平均值。

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗gE体液免疫应答(抗体浓度和疫苗应答)，并在疫苗接种前直到剂量2后12个月(M13)，在所有主体中进行评估。

在来自PreChemo亚组(HZ/su-PreC，安慰剂-PreC)的主体亚组群中，评估了M2和M13 gE特异性CD4⁺ T细胞介导的免疫(CMI)应答(表达干扰素γ[IFN-γ]、白介素2 [IL-2]、肿瘤坏死因子α[TNF-α]和CD40配体[CD40L]中≥2种活化标志物的gE-特异性CD4⁺ T细胞的频率和疫苗应答，如通过使用gE肽刺激后的细胞内细胞因子染色测定的)。

表7

M =月

第一次疫苗接种：PreChemo组中，在化学疗法周期前8-30D施用；在OnChemo组中，在化学疗法周期开始±1D时施用；

*最后一个化学疗法周期开始；

**第二剂量的疫苗在第一剂量后1-2个月，以及随后化学疗法周期开始时(±1天)施用；

***仅在PreChemo组的子组群(HZ/su和安慰剂)中评估CMI。

表8：体液和细胞免疫应答(分别为对于体液免疫原性的ATP组群和对于CMI的ATP子组群)

HZ/su-PreC：在化学疗法周期开始前8-30天 2 HZ/su疫苗接种的第一次接种；

Pl-PreC：在化学疗法周期开始前8-30天2安慰剂施用的第一次施用；

HZ/su-OnC：在化学疗法周期开始时(±1天) 2 HZ/su疫苗接种的第一次接种；

P1-OnC：在化学疗法周期开始时(±1天) 2安慰剂施用的第一次施用；

N = 具有可获得结果的主体的数目

VRR：疫苗应答率；

GM：几何平均值；

GMC：抗gE抗体ELISA几何平均浓度；

频率：gE特异性CD4[2+] T细胞的频率(每10⁶所有CD4+ T细胞)；％，主体的百分比；

CI：置信区间

IU：国际单位；

M2：第2个月(剂量2后1个月)：M13，第13个月(剂量2后12个月)。

在表8中，p值是相对于零假设H₀：HZ/su：安慰剂= 1。粗体值表明满足的主要目标(对于GMC HZ/su：安慰剂比例的95% CI的下限[LL]≥60％ - 体液免疫原性)和第二目标(对于VRR的95% CI的LL≥3 - 体液免疫原性，以及对于GM频率，HZ/su：安慰剂比例≥1 -CMI)的免疫原性成功标准。

体液VRR是具有疫苗应答的主体的百分比，如下所示：对于最***清阴性的主体(抗gE抗体浓度低于截止值[97 mIU/ml])，与截止值相比增加至少2倍；对于最***清阳性的主体(抗gE抗体浓度高于截止值)，与疫苗接种前的抗体浓度相比增加至少4倍。CMI VRR是具有疫苗应答的主体百分比：对于疫苗接种前的T细胞频率低于阈值(320个gE特异性CD4[2+] T细胞/10⁶个CD4+ T细胞)的主体，与阈值相比增加至少2倍；对于疫苗接种前的T细胞频率高于阈值的主体，与疫苗接种前的T细胞频率相比增加至少2倍。**，针对基线值进行调整的。

抗gE体液免疫应答：

对于M2，满足以下HZ/su免疫原性成功标准(表8)：

o 在PreChemo组(> 3)中，抗gE抗体浓度的几何平均浓度(GMC) HZ/su：安慰剂比例的95％置信区间(CI)的下限(LL)为17.9。

o 体液疫苗应答率(VRR)的95％CI的LL为85.0％(≥60％)。

o 对于gE特异性CD4⁺ T细胞频率的CMI几何平均(GM)频率HZ/su：安慰剂比例的95％CI的LL为3.63(> 1)。

HZ/su的M1至M13抗gE GMC高于相应的安慰剂组(M6的OnChemo接受者除外，其对HZ/su和安慰剂的应答相似地高)(图8)。

47.1% (M13)–93.8% (M1, M2)的HZ/su主体满足体液疫苗应答的标准，相比之下，对于安慰剂组为0.0%–16.7% (图9)。

在HZ/su接受者中，GMC和VRR都倾向于随时间下降；但是，HZ/su亚组的GMC值保持高于疫苗接种前。

剂量1后1个月，PreChemo亚组中的HZ/su接受者与HZ/su_OnChemo亚组相比具有更高的免疫应答。在M13时未观察到差异(图8和图9)。

gE特异性CMI应答：

在HZ/su_PreChemo中，gE特异性CD4²⁺ T细胞值的M2和M13平均频率显著高于安慰剂_PreChemo组中的。HZ/su接受者的平均频率在M2达到峰值(图10)。

在HZ/su PreChemo组中，17.6% (M13)–50.0% (M2)满足CMI疫苗应答的标准，相比之下，对于安慰剂_PreChemo组为0.0％(图11)。

安全性评估：在每个剂量后，记录征集的不良事件(AE) 7天，并记录非征集的和医学关注的AE (MAE) 30天。记录潜在的免疫介导疾病(pIMD)和严重AE (SAE)直到研究结束。大多数征集的一般AE由HZ/su和安慰剂接受者以可比较的频率报告(数据未显示)。在安慰剂组中报告了高背景发病率(65.1％ 安慰剂_PreChemo，70.8％ 安慰剂_OnChemo)。HZ/su组中征集的局部AE频率高于相应的安慰剂组中的。疼痛和疲劳是最常报告的征集AE。在HZ/su和安慰剂接受者中的非征集AE、MAE和SAE的报告频率相似。报告了1个pIMD (安慰剂_OnChemo)和23个致命SAE。没有SAE被研究者认为与疫苗有关。HZ/su_OnChemo组和HZ/su_PreChemo组之间的安全性结果未见差异。分别在M1报告了HZ/su_PreChemo组中1名主体的疑似HZ病例，并且在M6和M13报告了安慰剂_PreChemo组中2名主体的疑似HZ病例。

结果：

185名主体(65 HZ/su-PreC、78 Pl-PreC、22 HZ/su-OnC、20 Pl-OnC)被纳入对体液免疫原性的根据方案规定(ATP)组群，且58名主体(27 HZ/su-PreC、31 Pl-PreC)被纳入对CMI的ATP亚组群中。最常见的ST是乳腺肿瘤(54% HZ/su、49%安慰剂)，其次是结肠直肠癌，肺癌，然后是其他肿瘤。在M2和M13，HZ/su的体液和CMI VRR高于Pl组。在HZ/su-PreC中，M2处的GM浓度(GMC)最高。M13 GMC在HZ/su-PreC和HZ/su-OnC组中相似。

结论：

目前的结果表明，HZ/su疫苗在接受免疫抑制化学疗法的ST成年人中具有免疫原性(如直至M13所测量的)，其中在化学疗法周期之前或开始时施用第一疫苗剂量。

实施例5：HZ/su在肾移植后的成年人中的免疫原性和安全性

由于其用于预防宿主对抗同种异体移植物排斥的每日免疫抑制疗法，实体器官移植(SOT)接受者患带状疱疹(HZ)感染的风险增加(Insinga等人，J Gen Intern Med 2005;20:748–53)，相对于整个美国人口，发病率高约7倍，而在移植后的前4年期间HZ的发病率是17-32％(Pergam等人，Transpl Infect Dis 2011;13:15–23)。

进行本研究以评估HZ/su在接受慢性免疫抑制疗法(钙依赖磷酸酶抑制剂或西罗莫司(CIS)；皮质类固醇(CS)；和/或霉酚酸酯化合物(MC))的成年肾移植(RT)接受者(RTR)中的免疫原性和安全性。选择RT是因为由于所施用的免疫抑制疗法的性质，它可以代表SOT。施用GSK的HZ亚单位候选疫苗HZ/su；HZ/su含有50μg的VZV gE和佐剂AS01B (50μg的3-O-脱酰基-4'-单磷酰基脂质A (MPL，由GSK生产)、50μg皂树级分21 (QS-21)以及脂质体)。

方法：在这个III期，观察者盲的、多中心研究(NCT02058589)中，将≥18 YOA的RTR按1:1随机化，以接受两个剂量的HZ/su或安慰剂，以1-2个月的间隔肌肉内施用。还将主体按照年龄(18-49岁；≥50岁)和免疫抑制治疗分层。在M0、M1、M2、M4、M7、M10和M13采集血液样本；在此呈现M2可得的结果。

在剂量2后1个月(M2)，对于体液和CD4⁺细胞介导的免疫(CMI)应答，评估gE特异性疫苗应答率(VRR)和几何平均值(GMs)。在每个剂量后，记录征集的不良事件(AE) 7天，并记录非征集的和医学关注的AE (MAE) 30天。在剂量1前的7天，还收集了征集的一般AE和非征集的AE。记录潜在的免疫介导疾病(pIMD)和严重AE (SAE)直到剂量2后1年。

免疫原性评估：在所有主体中，评估抗gE体液免疫应答(抗体[Ab]浓度和疫苗应答，如通过酶联免疫吸附测定[ELISA]测定的)。在主体亚组中，评估gE特异性CD4⁺ T细胞介导的免疫应答(CMI) (表达干扰素γ[IFN-γ]、白介素2 [IL-2]、肿瘤坏死因子α[TNF-α]和CD40配体[CD40L]中≥2种活化标志物的gE-特异性CD4⁺ T细胞的频率和疫苗应答，如通过使用gE肽刺激后的细胞内细胞因子染色测定的)。

研究参与者：HZ/su和安慰剂接受者之间的人口统计学特征相当(数据未显示)。在264名疫苗接种主体(132名于HZ/su组中且132名于安慰剂组中)中，240名(121名 HZ/su;119名安慰剂)和72名(每组36名)分别纳入在对于体液免疫原性和CMI的M2根据方案规定的组群中。

抗gE体液免疫应答：满足对于M2的所有HZ/su免疫原性成功标准(表9)：

o 对于抗gE Ab浓度，疫苗应答率(VRR)的95％置信区间(CI)的下限(LL)为71.9％(≥60％)。

o 抗gE Ab浓度的几何平均(GM)比例(HZ/su与安慰剂)的95％CI的LL为10.90(>3)。

o 对于gE特异性CD4 + T细胞频率，VRR的95％CI的LL为51.3％(≥50％)。

o gE特异性CD4+ T细胞频率的GM比例(HZ/su与安慰剂)的95％CI的LL为5.92(>1)。

表9：在M2，对于抗gE抗体ELISA浓度和gE特异性CD4+ T细胞频率的VRR、GM和GM比例(分别对于体液免疫原性和CMI的ATP组群)

VRR =疫苗应答率#；GM(C)=几何平均值(浓度)；M2 = 第2个月(上次疫苗接种后1个月)；ATP = 根据方案规定；N = 具有可得结果的主体的数目；CI =置信区间；IU =国际单位。

*针对基线值调整的；**对于推论分析，通过向活化CD4+ T细胞数(分子)除以所涉及的CD4+ T细胞总数(分母)添加0.5的偏移量，计算在使用抗原体外刺激(诱导条件)后，产生≥2个活化标志物(IFN-γ、IL2、TNFα和CD40配体)的CD4+ T细胞的频率。

#VRR：(i) 对于体液免疫应答：(a) 在最***清阴性主体中，疫苗接种后的抗体浓度≥抗糖蛋白E (gE)截止值的4倍(4x97 mIU/ml)；(b) 在最***清阳性的主体中，疫苗接种后的抗体浓度≥疫苗接种前的抗体浓度的4倍；(ii) 对于细胞介导的免疫原性(CMI)：(a) 在最初疫苗接种前的T细胞频率低于截止值(320/106 CD4+ T细胞)的主体中，疫苗接种后的T细胞频率≥截止值(2x320/106 CD4+ T细胞)的2倍；(b) 在最初疫苗接种前的T细胞频率高于截止值的主体中，疫苗接种后的T细胞频率≥疫苗接种前的T细胞频率的2倍。

粗体值表明满足主要目标(对于VRR的95% CI的下限≥60％ - 体液)和第二目标(对于VRR 95% CI的下限≥50% - CMI，对于GM比例，>3 - 体液，对于GM比例，>1 - CMI)免疫原性成功标准。

剂量2后一个月，与安慰剂接受者相比，HZ/su中的抗gE几何平均浓度(GMC)显著更高(图12)。在两个HZ/su年龄组群中，GMC均高，但在较年轻的年龄组群中，GMC倾向于更高；对于不同的免疫抑制疗法层，GMC相似。

大多数HZ/su接受者(≥77.2％)在M2满足体液疫苗应答的标准(图13)。与年龄较大的组相比，年龄较小的组的VRR倾向于更高，但是在不同的免疫抑制疗法亚组中，VRR相似。

gE特定细胞介导的免疫(CMI)应答：

与安慰剂接受者相比，剂量2后1个月的gE特异性CD42+ T细胞的中值频率在HZ/su接受者中显著更高，并且与≥50岁的接受者相比，在18-49岁的HZ/su接受者中倾向于更高(图14)。

剂量2后1个月，HZ/su组中≥64.7％的主体满足CMI疫苗应答的标准，相比之下，安慰剂组中无一满足(图15)。在HZ/su接受者中，与年龄较大的组相比，年龄较小的组的VRR倾向于更高，尽管差异并不显著。

安全性：两个组以相似的频率均报告了征集的一般AE、非征集的AE，MAE和SAE (数据未显示)。在安慰剂组中报告了征集的一般AE的高背景发病率(55.3%)。与安慰剂组相比，HZ/su组的征集局部AE频率更高。没有报告pIMD、疫苗相关的SAE或移植排斥。

结果与结论：在M2，240名主体(121名 HZ/su；119名安慰剂)纳入到体液免疫原性的根据方案规定(ATP)组群中。在M2，满足所有免疫原性成功标准。在HZ/su组中，ATP体液免疫组群和CMI亚组群的VRR (72名主体：36名 HZ/su；36名安慰剂)更高。与安慰剂组相比，HZ/su的体液GM浓度和CMI GM频率显著更高。在M2，HZ/su在具有RT的成年人中具有免疫原性。

序列表

<110> Glazosithkline biologicals

<120> 疫苗

<160> 1

<170> 用于Windows版本4.0的FastSEQ

<210> 1

<211> 546

<212> PRT

<213> VZV gE截短物

<400> 1

序列表

<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA

OOSTVOGELS, Cornelia

<120> 疫苗接种

<130> VB66318

<150> GB1706798.4

<151> 2017-04-28

<150> GB1707785.0

<151> 2017-05-15

<150> US62/566861

<151> 2017-10-02

<160> 1

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 546

<212> PRT

<213> VZV gE截短物

<400> 1

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly

530 535 540

Leu Ala

545