一种水溶性多脲抗菌分子及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种水溶性多脲抗菌分子及其制备方法和应用 (Water-soluble polyurea antibacterial molecule and preparation method and application thereof ) 是由 高玲燕 贾传东 吕光浩 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种水溶性多脲抗菌分子及其制备方法和应用,该水溶性多脲抗菌分子结构式如下,该水溶性多脲分子通过提高分子与细菌的结合强度,实现优异的抗菌性能。拓展了多脲分子在生物领域的应用,而且为解决细菌耐药性发展问题提供新的思路。(The invention discloses a water-soluble polyurea antibacterial molecule, a preparation method and application thereof. The application of the polyurea molecule in the biological field is expanded, and a new thought is provided for solving the problem of the development of the drug resistance of bacteria.)
技术领域
本发明属于化合物合成技术领域，具体涉及一种水溶性多脲抗菌分子及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素的发现，为人类战胜致病微生物奠定了举足轻重的作用。然而近一个世纪以来，抗生素的滥用导致细菌对抗生素的耐药性不断发展并增强，甚至出现了多重耐药性的超级细菌，这已经严重威胁到全人类的生命健康，细菌耐药性问题已经成为全球公共健康领域的重大挑战。然而，新型抗生素的研发速度却远远跟不上细菌耐药性的发展速度。因此，开发新的策略和手段来弥补传统抗生素的不足以及减缓细菌耐药性发展速度已经成为科研工作者的主要任务之一。
阴离子普遍存在于生物和环境体系中，在维持生物体的正常运转和保持生态平衡方面起到了重要作用。“阴离子配位化学”通过几十年的发展，从简单的分子识别的模型体系发展到复杂而高度有序的分子自组装，逐渐成为超分子化学的一个重要分支。长足的发展也让研究者认识到阴离子配位化学可以很好地模拟生命体中的结构和进程，例如研究磷酸盐结合蛋白、硫酸结合蛋白的结合性质等。申请人所在的团队在前期工作中已设计和构筑多类基于多脲分子的结构，并发现该类分子可以在水相中识别磷酸根等阴离子。然而该类分子的水溶性问题一直是阻碍其在生物等领域进一步应用的瓶颈。
众所周知，细菌，尤其是革兰氏阴性菌，其呈负电性的细胞壁外膜中含有丰富的磷脂分子，可与脲类分子通过非共价相互作用实现有效的结合。与此同时，脲类结构已被报道可与DNA分子进行非共价相互作用。因此，细菌细胞膜内DNA可与多脲分子通过分子识别构筑脲类分子与DNA的复合物结构。
发明内容
本发明基于细菌细胞壁和膜内DNA可为多脲分子提供丰富的识别位点，设计和开发了一类基于水溶性多脲分子的膜靶向和非膜靶向相结合的新型的抗菌材料，通过提高分子与细菌的结合强度，实现优异的抗菌性能。该类新型多脲分子的制备不仅可以拓展多脲分子在生物领域的应用，而且为解决细菌耐药性发展问题提供新的思路。
为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：
一种水溶性多脲抗菌分子，所述的水溶性多脲抗菌分子结构式如下：
本发明水溶性多脲抗菌分子中末端季铵盐的引入具有增加多脲分子水溶性的作用。
在本发明的另一方面，提供了所述水溶性多脲抗菌分子的制备方法，包括以下步骤：
1)将胺类化合物和邻硝基异氰酸酯的四氢呋喃溶液滴加在一起，加热反应得到黄色固体化合物；
2)将步骤1)得到的化合物和钯炭溶解于四氢呋喃中，再滴入水合肼加热，反应完成后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，去除钯炭，加入无水乙醚，得到白色固体化合物；
3)将步骤2)得到化合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液滴入4,4′-亚甲基双(苯基异氰酸酯)的四氢呋喃溶液中，加热反应得到白色化合物；
4)取步骤3)白色化合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液与3-溴-N,N,N-三甲基丙烷-1-溴化铵的乙腈溶液混合，加热反应得到灰色目标产物。
进一步的，步骤1)中胺类化合物选自4,4'-二氨基二苯甲烷。
进一步的，步骤1)～3)中加热条件为80℃。
进一步的，步骤4)中加热条件为120℃。
在本发明的另一方面，还提供了上述水溶性多脲抗菌分子在作为抗菌药物中的应用。该水溶性多脲抗菌分子对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有优异的抗菌效果。
优选的，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
本发明水溶性多脲抗菌分子结构中脲基骨架和末端季铵盐在抗菌中的重要作用，随着多脲分子中脲基数量的增多，抗菌效果具有明显的提升。季铵盐的引入可以很好的增加多脲分子的水溶性，因此在抗菌效果的发挥中也有一定的作用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种具有抗菌作用的水溶性多脲抗菌分子，该水溶性多脲抗菌分子可与细菌细胞壁通过非共价键相互作用实现有效的接触，导致细菌细胞壁外膜和内膜破损，细胞内小分子内容物泄漏，导致细菌死亡；另一方面还可通过破损的细胞膜扩散进入细胞内，与膜内DNA通过非共价相互作用有效结合，导致DNA构象的改变，从而促使细胞死亡。为解决细菌耐药性发展问题提供新的思路。
附图说明
图1是本发明大肠杆菌细胞壁外膜(a)和内膜破损(b)后荧光分子摄取实验；
图2是本发明半乳糖苷水解实验(a)和DNA/RNA分子泄漏检测实验(b)；
图3是本发明体外pDNA与6U结合前(a)后(b)的形貌变化；
图4是本发明体外pDNA与6U结合后的琼脂糖凝胶结果；
图5是本发明大肠杆菌与6U共培养后DNA琼脂糖凝胶结果；
图6是本发明多脲分子与DOPE和DOPG的结合强度；
图7是本发明多脲分子与DA的结合强度。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
水溶性多脲抗菌分子(6U)的合成路线：
1)片段化合物3的合成
将胺类化合物(0.8g,3.5mmol)溶解在20ml的THF中，邻硝基异氰酸酯(0.437g,1.75mmol)溶解在20ml的THF中，将两种不同的反应液滴加在一起，升温至80℃。强烈搅拌回流2.5小时，产生大量的黄色固体，抽滤弃掉液体。分别用无水四氢呋喃、乙醚在超声的条件下洗涤所得的黄色固体，置于真空中干燥箱中干燥，得纯净的黄色固体化合物3(0.98g,1.4mmol)，产率为85％。
2)片段化合物4的合成
室温下，将化合物3(0.9g,1.4mmol)和Pd/C 10％(0.09g,cat.)悬浮在200ml的THF中，滴加水合肼(1.0mL)升温至80℃。强烈搅拌回流5小时，抽滤将固体过滤掉，用DMF(50mL)溶解，通过紧密的硅藻土过滤去除Pd/C。将溶解产物的DMF溶液旋蒸至3ml左右，静置常温后缓慢加入200ml的无水乙醚，收集白色沉淀，分别用无水四氢呋喃和无水乙醚在超声条件下清洗白色固体3次，真空干燥，得到纯净的白色固体化合物4(0.6g,0.8mmol)，产率为75％。
3)片段化合物5的合成
常温下，将化合物4(0.6g,0.8mmol)溶解在2mL DMF中，滴入4,4′-亚甲基双(苯基异氰酸酯)(0.263g,1.6mmol)的THF(20.0mL)热溶液，升温至80℃。强烈搅拌回流2.5小时，沉淀过滤并收集，用THF、无水乙醚洗3次，然后在真空中干燥，得到纯净的白色化合物5(0.6g,0.58mmol)，产率为80％左右。
4)化合物6U的合成
称取化合物5(0.6g,0.58mmol)加入2.5mL DMF中，在加热超声的条件下全部溶解。将3-溴-N,N,N-三甲基丙烷-1-溴化铵(0.756g,2.9mmol)溶解在40ml的乙腈溶液中，将两种反应液混匀，升温至120℃，反应液回流8小时，产生大量的灰色固体贴附在瓶壁上。收集固体并用乙腈、无水乙醚分别洗涤3次，然后真空干燥，得到6U的粗产物。
加热状态下，将粗产物溶解在6ml的DMF中，再次加入3-溴-N,N,N-三甲基丙烷-1-溴化铵(0.35g,1.4mmol)的乙腈溶液，升温至120℃，5个小时后收集瓶内灰色固体，用乙腈和无水乙醚分别洗涤三次，得到纯净的灰色固体6U(0.54g,0.348mmol)，产率为60％。
实施例2抑菌效果实验
将待检化合物先以100μL的液体培养基在96孔板内进行连续稀释，每管内再加入100μL供试菌菌液(106CFU/mL)，培养后，观察细菌生长情况，与空白对照比较，以肉眼观察培养基清亮且未见细菌生长的最低浓度判定为该药物的最低抑菌浓度(MIC)。每菌重复3次，求平均值。将无细菌生长的药物和菌种划线接种到新的琼脂平板上进行培养，进一步确定该药物的最低杀菌浓度(MBC)。
结果可知实施例1化合物6U对大肠杆菌繁殖的最低抑菌浓度为3.75μM，当浓度继续增大，对大肠杆菌的最低杀菌浓度为7.5μM。该抗菌结果可以媲美与抗菌肽多粘菌素B对该类细菌的抗菌效果，多粘菌素B对大肠杆菌的最低抑菌浓度为3.75μM，最低杀菌浓度为7.5μM。
实施例3
为探究化合物6U导致细菌细胞壁的破损，开展了荧光分子摄取实验。
1)制备细菌菌液(OD600＝0.34)，取150μL上述菌液于96孔板中，进一步加入N-苯基-2-萘胺(NPN)(40μM,50μL)，共培养5分钟。随后，加入20μL化合物6U(60μM)，观察不同时间的420nm处荧光发射。
制备细菌菌液(OD600＝0.34)，取150μL上述菌液于96孔板中，进一步加入碘化丙啶(PI)(40μM,50μL)，共培养5分钟。随后，加入20μL化合物6U(60μM)，观察不同时间的617nm处荧光发射强度。
通过NPN和PI摄取实验，证实了化合物6U的加入可以导致大肠杆菌细胞壁外膜和内膜的破损(图1)。
2)制备细菌菌液(OD600＝0.34)，取180μL上述菌液于96孔板中，加入20μL化合物6U(60μM)。共培养1小时后，菌液在1000rpm离心5分钟，取上清液测定260nm处的吸收强度。
配置15mM的硝基苯基半乳糖苷的PBS溶液；制备细菌菌液(OD600＝0.34)，然后使用硝基苯基半乳糖苷的PBS溶液，稀释菌液成浓度为106CFU/mL的溶液。取100μL上述菌液于96孔板中，加入20μL化合物6U(60μM)。观察410nm处不同时间的吸收强度。
半乳糖苷水解实验和DNA吸光值实验证实了细胞壁内膜破损后可以导致小分子，例如膜内蛋白质的泄漏，但是无法促使大分子，例如DNA和RNA分子从破损的细胞膜中泄漏(图2)。
实施例4
1)AFM实验探究化合物与DNA的结合实验步骤如下：取pDNA的水溶液，加入一定浓度的6U的溶液，放置30分钟后，通过AFM观察pDNA加入化合物前后的形貌变化。
AFM实验结果表明，pDNA的超螺旋结构在加入7.5μM化合物6U后会发生明显的构象改变，变成颗粒状聚集体(图3)。该结果说明化合物6U分子与pDNA存在非共价相互作用。
2)琼脂糖凝胶电泳实验步骤如下：制备1％(w/v)琼脂糖凝胶，在电泳槽内加入pDNA与不同浓度的6U化合物溶液，与60V电压下跑叫30分钟，通过凝胶成像仪拍摄相应的DNA电泳结果。
琼脂糖凝胶电泳实验揭示了化合物6U与pDNA形成了复合物，从而导致DNA电泳的延滞现象(图4)。
3)为探究细菌细胞内DNA与化合物6U分子的相互作用情况，将化合物6U与大肠杆菌共培养24小时后，将细菌内的DNA进行提取并进行琼脂糖凝胶电泳实验(图5)，与PBS空白实验组的实验结果相比，发现与体外pDNA有类似的DNA电泳延滞现象，说明化合物6U可能进入细菌细胞内，并与DNA通过非共价相互作用形成复合物，导致DNA构象的改变，引起细菌的死亡。
实施例5
为研究化合物6U结构中脲基骨架和末端季铵盐在抗菌中的重要作用，设计如下系列模型化合物：
系统考察模型化合物的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，结果如表1所示。
表1 6U和一系列模型化合物的抗菌结果(浓度单位为μM)
结果表明，随着多脲分子中脲基数量的增多，抗菌效果具有明显的提升。季铵盐的引入可以很好的增加多脲分子的水溶性，因此在抗菌效果的发挥中也有一定的作用。
实施例6脲基与脂类分子DOPG，DOPE以及DNA的非共价相互作用
1)采用DOPG，DOPE作为细胞膜上脂类分子的模型，利用紫外滴定实验，系统考察含有不同脲基数量的多脲分子6U，4U和2U和DOPG，DOPE的结合能力。具体实验步骤如下：配置一定浓度的6U，4U和2U化合物溶液，逐渐往里滴加1当量至25当量的DOPG或DOPE溶液，通过拟合紫外吸收的变化，得出6U，4U和2U与DOPG或DOPE的结合强度。具体实验结果见表2。
表2 6U，4U和2U分别与DOPE，DOPG和DA的结合常数(Ka,M-1)
2)采用鲱鱼精(DA)作为DNA上磷酸戊糖骨架的模型，利用紫外滴定实验，系统考察含有不同脲基数量的多脲分子6U，4U和2U和DA的结合能力。具体实验步骤如下：配置一定浓度的6U，4U和2U化合物溶液，逐渐往里滴加0.25当量至30当量的DA溶液，通过拟合紫外吸收的变化，得出6U，4U和2U与DA的结合强度。具体实验结果见表2。
通过紫外滴定实验，由表2和图6～7可知，随着多脲分子中脲基数量的增多，2U，4U和6U对于DOPE，DOPG和DA的结合常数有着显著的递增。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：PSMA-结合剂及其用途