阅读说明：本技术 磷酸肌酸在制备用于治疗2型糖尿病肾病并发症的药物中的用途 (Application of creatine phosphate in preparation of medicine for treating type 2 diabetes and nephropathy complications ) 是由 唐泽耀 杨晓云 牛梦月 王宏焱 艾杰 王福韩 韩国柱 唐中元 彭金咏 马晓东 张 于 2019-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了磷酸肌酸在制备用于治疗2型糖尿病肾病并发症的药物中的用途。磷酸肌酸能够有效改善糖尿病肾脏损伤,其机制是通过抑制ERK的磷酸化激活,调控线粒体凋亡途径和ERK/Nrf2/HO-1通路,进而抑制细胞凋亡和缓解氧化应激损伤。本发明为临床上糖尿病肾脏并发症的预防和治疗提供了有价值的参考信息。一定程度上为磷酸肌酸对2型糖尿病肾病并发症的保护作用防治提供新的思路和理论基础。(The invention discloses an application of creatine phosphate in preparing a medicament for treating type 2 diabetic nephropathy complications. The creatine phosphate can effectively improve diabetic kidney injury, and the mechanism is that the creatine phosphate can regulate and control a mitochondrial apoptosis pathway and an ERK/Nrf2/HO-1 pathway by inhibiting phosphorylation activation of ERK, so that apoptosis is inhibited and oxidative stress injury is relieved. The invention provides valuable reference information for clinically preventing and treating diabetic renal complications. Provides a new thought and theoretical basis for the protective effect of the creatine phosphate on the complications of type 2 diabetic nephropathy to a certain extent.)

磷酸肌酸在制备用于治疗2型糖尿病肾病并发症的药物中的 用途

技术领域

本发明属于医药新适应症领域，具体涉及磷酸肌酸在制备用于治疗2型糖尿病的肾病并发症的药物中的用途。

背景技术

糖尿病(DiabetesMellitus，DM)是一种较为常见的内分泌代谢障碍疾病。糖尿病引起的并发症较多，肾病并发症是较严重和常见，同时也是导致终末期肾衰的主要原因。目前已成为世界范围内日益严重的公共健康问题，严重影响人民的生活质量。目前可用于治疗糖尿病的口服降血糖药合并预防治疗肾病并发症不理想，且服用药物后伴有不良副作用或长期使用后反应减弱。因此，有必要找到新的药物来治疗2型糖尿病肾病并发症，确保安全性和有效性。

临床常用于心脏手术时加入心脏停搏液中保护心肌，也可应用于缺血状态下的心肌代谢异常。发明人以往的研究已证实磷酸肌酸(Phosphocreatine,PCr)可以改善由ox-LDL诱导的动脉粥样硬化，丙酮醛诱导的糖尿病血管并发症相关的氧化损伤。

基于此背景资料，本发明发现磷酸肌酸对糖尿病肾脏并发症氧化应激状态下的凋亡损伤具有保护作用。具体地，本发明从链脲酶素(Streptozotocin,STZ)破坏胰岛·细胞，干扰胰岛素生成，建立糖尿病大鼠模型。本发明采用丙酮醛(Methylglyoxal,MGO)诱导大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)损伤建立糖尿病肾病体外模型，发现PCr对糖尿病大鼠肾损伤的保护作用，为该领域的合理使用提供科学依据。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，在本发明中的一些实施方案中，提供了磷酸肌酸在制备用于治疗2型糖尿病肾病并发症的药物中的用途。

在一个具体的实施方案中，磷酸肌酸的化学结构如下式(1)所示：

在一个具体的实施方案中，其中，所述的药物通过缓解患有2型糖尿病肾病并发症的受试者的肾脏组织、细胞病变、改善肾脏细胞的氧化应激状态、抑制肾脏细胞凋亡损伤来治疗2型糖尿病肾病并发症。

在一个具体的实施方案中，缓解患有2型糖尿病肾病并发症的受试者的肾脏组织、细胞病变是指降低受试者的肾脏肥大指数。

在一个具体的实施方案中，所述的药物通过降低受试者肾脏组织中丙二醛的水平、提高还原型谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶活力、抑制2型糖尿病肾病并发症的受试者的肾脏细胞中ROS水平的上升，以改善肾脏细胞的氧化应激状态。

在一个具体的实施方案中，所述的药物通过上调未活化型的Pro-caspase-9表达量、下调Caspase-3和Caspase-9表达量、提高Bcl-2/Bax比值、降低肾脏细胞内Ca²⁺蓄积、提高肾脏细胞线粒体膜电位，以减少肾脏细胞凋亡。

在一个具体的实施方案中，所述的药物通过抑制患有2型糖尿病肾病并发症的受试者的肾脏细胞p-ERK的激活，下调ERK磷酸化水平，以调节ERK/Nrf2/HO-1信号通路，从而治疗2型糖尿病肾病并发症。

在一个具体的实施方案中，所述的2型糖尿病肾病并发症是哺乳动物中的2型糖尿病肾病并发症。

在一个更具体的实施方案中，所述的哺乳动物是人。

本发明的有益效果：PCr能够有效改善糖尿病肾脏损伤，其机制是通过抑制ERK的磷酸化激活，调控线粒体凋亡途径和ERK/Nrf2/HO-1通路，进而抑制细胞凋亡和缓解氧化应激损伤。本发明为临床上糖尿病肾脏并发症的预防和治疗提供了有价值的参考信息。一定程度上为PCr对2型糖尿病肾病并发症的保护作用防治提供新的思路和理论基础。

附图说明

图1A和图1B：PCr对糖尿病大鼠体重和肾脏指数的保护作用。图1A：大鼠体重(g)。图1B：大鼠的/KW/BW值(肾重/体重，mg/g)。数据表示为平均值±SD(n＝8)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图2：PCr对糖尿病肾病大鼠肾组织H&E染色(200倍，放大)STZ所致肾损伤的保护作用。

图3A至图3C：PCr对糖尿病肾病大鼠肾组织MDA(图3A)、GSH(图3B)和SOD(图3C)水平的影响。数据表示为平均值±SD(n＝8)。*与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图4A至图4C：PCr对糖尿病肾病大鼠细胞凋亡的影响。图4A：TUNEL染色大鼠肾组织荧光图像，绿色荧光显示阳性细胞(放大200倍)。图4B：Western blot检测大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和Pro-caspase-9的组织蛋白表达。图4C为图4B中Western blot电泳结果的统计图。以·-actin为对照，其值与·-actin有关。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图5A至图5C：PCr对糖尿病肾病大鼠ERK/Nrf2/HO-1信号通路的影响。图5A：基于免疫荧光法(200倍放大)的PCr对肾组织p-ERK水平的影响。图5B：肾组织磷酸化和总ERK、Nrf2和HO-1蛋白表达的代表性Western blot分析。图5C为图5B中Western blot电泳结果的统计图。以·-actin为对照，其值与·-actin有关。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图6A至图6C：PCr对MGO诱导的NRK-52E细胞损伤的保护作用。图6A用MGO处理NRK-52E细胞24小时的存活率，随着MGO浓度增高，从0.4～1.0mM，细胞存活活性逐渐降低，呈剂量依赖关系，最大剂量1.0mM MGO可抑制细胞存活活性至51.4％。图6B用PCr(10，20，30mM，4h)预处理，然后用MGO(0.8mM)刺激24小时。当单独MGO(0.8mM)刺激24小时时，细胞存活活性至63.6％，而用PCr(10，20，30mM，4h)预处理，再使用MGO(0.8mM)刺激24小时，细胞存活活性剂量依赖性逐渐恢复，呈现显著性差异，30mM PCr预处理，可使细胞存活活性恢复至84.3％。图6C用PCr处理NRK-52E细胞24小时的存活活性，用不同浓度PCr(10，20，30mM，4h)处理的细胞存活活性未出现显著性变化。数据以平均值±SD(n＝5)表示。与对照组相比，*p<0.05和**p<0.01；与仅0.8mM MGO组相比，^#p<0.05和^##p<0.01。

图7：NRK-52E细胞的形态和荧光图像。第一排为明亮视野(200倍)下PCr对细胞形态的影响。第二排为倒置荧光显微镜(200倍放大)观察DAPI染色NRK-52E细胞凋亡变化的荧光图像。

图8A和图8B：PCr对MGO诱导NRK-52E细胞凋亡的保护作用。图8A流式细胞术检测细胞凋亡。早期和晚期凋亡率代表Annexin V单阳性和Annexin V/PI双阳性细胞的百分比。图8B为流式细胞术检测细胞凋亡的统计图，数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组相比，*p<0.05和**p<0.01；与仅0.8mM MGO组相比，^#p<0.05和^##p<0.01。

图9A至图9C：PCr对MGO诱导NRK-52E细胞凋亡的影响。图9A：TUNEL染色显示NRK-52E阳性细胞，荧光图像呈绿色荧光(放大200倍)。图9B：Western blot检测NRK-52E细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和Procaspase-9的组织蛋白表达。图9C为图9B的统计图，以·-actin为对照，其值与·-actin有关。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图10A至图10B：PCr对线粒体膜电位(MMP)的保护作用。用JC-1探针测定MMP，荧光显微镜拍摄荧光图像(图10A)。红色荧光显示正常线粒体内线粒体膜极化，绿色荧光由胞浆JC-1单体发出，MMP消散。用红、绿荧光强度比值计算各组MMP水平。图10B为图10A的统计图，数据表示为平均值±SD(n＝3)。*与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图11A和图11B：流式细胞仪检测PCr对NRK-52E细胞内钙离子水平的保护作用。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图12A至图12C：PCr对NRK-52E细胞MDA(图12A)、GSH(图12B)、SOD(图12C)水平的影响。数据表示为平均值±SD(n＝3)。*与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图13A至图13B：PCr对MGO诱导NRK-52E细胞产生活性氧水平的影响。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图14A至图14C：PCr对NRK-52E细胞ERK/Nrf2/HO-1信号通路的影响。图14A：基于免疫荧光法的PCr对p-ERK水平的影响(放大200倍)。图14B：对NRK-52E细胞磷酸化和总ERK、Nrf2和HO-1蛋白表达的代表性Western blot分析。图14C为图14B的统计图，以·-actin为对照，其值与·-actin有关。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图15A和图15B：cDNA诱导的ERK过表达消除了PCr对MGO诱导的NRK-52E细胞凋亡的影响。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照cDNA组比较，p<0.05和**p<0.01；与MGO+对照cDNA组比较，*p<0.05和**p<0.01；与PCr+MGO+对照cDNA组比较，^#p<0.05和^##p<0.01。

图16A和图16B：c-DNA诱导的ERK1/2过表达消除了PCr对NRK-52E细胞ERK/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达改变和MGO诱导凋亡的影响。数据表示为平均值±SD(n＝3)。与对照cDNA组比较，*p<0.05和**p<0.01；与MGO+对照cDNA组比较，*p<0.05和**p<0.01；与PCr+MGO+对照cDNA组比较，^#p<0.05和^##p<0.01。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

体内实验

实施例1.大鼠2型DN模型的建立、动物分组和PCr的施用

雄性SD大鼠40只(由大连医科大学SPF实验动物中心提供)，适应性喂养一周，随机分为二组：正常对照组8只(C)和糖尿病组32只。禁食不禁水12h后，糖尿病组大鼠一次性腹腔注射STZ 70mg/kg(购自美国Sigma公司)，72h后剪尾测定大鼠血糖，以随机血糖值≧16.7mM/L为糖尿病成模标准，其中28只建模成功。从建模成功的糖尿病大鼠中取出24只，随机分为3组(每组8只)：模型组(DN)，PCr低剂量组(PCr 20mg/kg/d)(PL)和PCr高剂量组(PCr50mg/kg/d)(PH)。PL组和PH组腹腔注射PCr溶液(购自哈尔滨莱博通药业有限公司)，C组和DN组注射等量0.9％生理盐水，连续注射8周后动物禁食不禁水12h，称量体重(BW,g)并记录，以10％水合氯醛麻醉动物，迅速取出双侧肾脏，去除肾包膜后，左肾称重(KW,g)并记录。

结果PCr对DN大鼠体重、肾脏肥大指数影响

肾脏肥大是早期糖尿病肾病的重要病理表现，以肾脏肥大指数(左肾重/体重，KW/BW)表示，常用于评估糖尿病肾病的治疗是否有效。如图1A所示，与正常组比较，DN模型组大鼠体重明显减轻(图1A)，肾脏肥大指数显著升高(图1B)。而给予PCr处理后，相较于DN模型组，大鼠体重有所增加，肾脏肥大指数则呈下降趋势。说明PCr具有增加糖尿病大鼠体重，缓解肾脏肥大的作用。

实施例2.H&E染色对大鼠肾脏组织病理学观察

实验方法

石蜡切片制备

(1)组织标本的固定：取实施例1中的各组大鼠的肾皮质组织于4％多聚甲醛中室温固定24h，纱布包裹，标记，流水冲洗过夜；

(2)脱水与透明：经50％，60％，70％，80％和90％酒精中梯度各脱水2h，然后于95％酒精，100％酒精-I/II/III中各脱水1h，入二甲苯-I/II各透明30min；

(3)浸蜡与包埋：在58℃恒温箱中浸蜡，用石蜡-I浸蜡1.5h，石蜡-II浸蜡2h。放入包埋盒中60℃下进行石蜡包埋，待冷却凝固成块后将蜡块取出；

(4)切片及展片：切片机4μm厚度切片，50℃水浴展片，捞片贴片于清洁载玻片上，60℃烘箱烤片过夜。切片完成后做好标记，保存待用。

HE染色

(1)脱蜡和复水：切片二甲苯脱蜡两次(15min/次)，分别于100％、95％、90％、80％、70％、50％酒精中各5min，最后入蒸馏水中复水3min；

(2)苏木素染色：切片置于苏木素染液中染色15min，自来水冲洗10min，盐酸酒精分色10s(70％酒精99mL+浓盐酸1mL)；

(3)返蓝及脱水：自来水冲洗10min使其变为蓝色。将切片依次置于50％、70％、80％、90％酒精中各脱水5min；

(4)伊红复染：1％伊红染液染色2min，95％酒精和100％酒精中分别3min脱水分色至界限清楚；

(5)透明与封片：二甲苯透明3min后，中性树胶封片；

(6)封片后放入50℃烘箱烘干，光镜下观察肾组织病理学结构的变化。

实验结果

HE染色观察PCr对DN大鼠肾脏病理学改变影响

大鼠肾组织切片HE染色后，显微镜下观察肾皮质组织结构。如图2所示，正常组大鼠肾组织中肾小球和肾小管形态结构正常，而模型组中肾小球毛细血管扩张，系膜细胞增生，基底膜明显增厚，肾小球体积增大，且肾小管上皮细胞可见肿胀呈空泡样变。经PCr药物治疗后，大鼠肾组织病理改变有不同程度的减轻，PCr高剂量组中可见肾小球和肾小管结构逐渐清晰，且系膜细胞增生较不明显，肾小管肿胀扩张现象也有所缓解。表明PCr可以保护大鼠肾组织，对抗糖尿病中出现的肾脏损伤。

实施例3.生化指标测定

实验方法

10％匀浆液的制备：准确称取实施例1中的各组大鼠的大鼠肾皮质组织重量，按重量(g)：体积(mL)＝1:9的比例，加入9倍体积的0.9％生理盐水，机械匀浆，制备成10％匀浆液，2500转/分，离心10分钟，取上清液待测。

(1)GSH的检测：还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)是机体内重要的非酶性抗氧化物，也是一种低分子清除剂，可清除O₂ ^－、H₂O₂。GSH含量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。按照说明书操作(南京建成生物科技有限公司的GSH检测试剂盒)，大鼠肾皮质组织中GSH含量按下式计算：

GSH含量(μM/gprot)

＝(测定OD值—空白OD值)/(标准OD值—空白OD值)×标准管浓度(20μM/L)×样本前处理稀释倍数(2倍)÷待测匀浆蛋白浓度(gprot/L)

(2)SOD的检测：超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，它可以清除机体内氧自由基。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子自由基可以氧化轻胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现***，于550nm处有最大吸收峰。被测样品中含有的SOD对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值。按照说明书操作(南京建成生物科技有限公司的SOD检测试剂盒)，大鼠肾皮质组织中SOD活性按下式计算：

总SOD活力(U/mgprot)

＝(对照OD值—测定OD值)/对照OD值÷50％×反应液总体积(mL)/取样量(mL)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)

(3)MDA的检测：细胞内产生的氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物(如：醛基、酮基、氢过氧基等)引起细胞损伤。因而检测丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞受到损伤的程度。按照说明书操作南京建成生物科技有限公司的MDA检测试剂盒)，大鼠肾皮质组织中MDA含量按下式计算：

MDA含量(nM/mgprot)

＝(测定OD值—对照OD值)/(标准OD值—空白OD值)×标准品浓度(10nM/mL)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)

实验结果

PCr对DN大鼠肾脏MDA、GSH、SOD影响

图3A至图3C中显示，与正常对照组相比，模型组大鼠肾组织中MDA含量显著增加，GSH含量和SOD活性显著下降。经PCr药物治疗后，PCr能够降低大鼠肾组织中MDA的水平，且明显提高GSH含量和SOD活力。表明PCr可能通过抗氧化作用缓解DN大鼠肾脏的氧化应激状态。

实施例4.凋亡相关蛋白的检测

实验方法：

组织切片TUNEL荧光染色

①脱蜡和复水：大鼠肾组织石蜡切片(4μm厚)经二甲苯浸泡脱蜡2次(10min/次)，100％、95％、80％、70％、50％酒精溶液梯度复水各5min，用PBS浸没静置5min，取出切片，吸去切片周围液体；②通透：切片表面滴加100μL细胞通透液(含0.1％TritonX-100的PBS)，室温静置5min；③标记：将试剂盒中各试剂混匀后滴加至切片表面，37℃避光标记1h；④向切片滴加100μL细胞通透液，室温静置5min，吸净切片周围液体，重复通透3次；⑤最后吸净切片周围液体，滴加2.5μL抗淬灭封片剂，盖玻片封片，正置荧光显微镜下观察荧光，激发波长范围为450～500nm，发射波长范围为515～565nm。

组织切片免疫荧光染色

(1)脱蜡和复水：大鼠肾组织石蜡切片(4μm厚)经二甲苯浸泡脱蜡2次(20min/次)，100％、95％、80％、60％酒精溶液梯度复水各5min，用PBS浸没静置5min，重复3次，取出切片，吸去切片周围液体；

(2)抗原修复：取适量Tris-EDTA修复液于烧杯中(修复液没过切片架即可)，盖上盖子，继续煮沸修复液15min，通风橱中自然冷却；

(3)将固定好的样片置于PBS清洗3次(5min/次)，注意不要干片；

(4)封闭：滴加3％BSA-PBS将样片完全覆没放于湿盒中，37℃放置1h后，用吸水纸吸去多余BSA-PBS溶液；

(5)滴加80μL稀释后的p-ERK一抗(p-ERK抗体：PBS＝1:100)，4℃过夜；PBS清洗3次(5min/次)；

(6)滴加80μL稀释后的荧光二抗(荧光二抗：PBS＝1:100)，37℃避光静置1h；PBS清洗3次(5min/次)；

(7)细胞核用80μL DAPI-PBS(1μg/mL)染色，室温避光静置10min；PBS清洗3次(5min/次)；

(8)滴加抗淬灭封片剂，盖玻片封片，正置荧光显微镜下观察荧光。

Western Blot免疫印迹法检测大鼠肾组织中相关蛋白表达

(1)组织蛋白的提取

称取50mg肾皮质组织，用生理盐水洗净后剪碎，加入300μL含有PMSF的RIPA裂解液。用匀浆机将组织打碎匀浆，4℃，12000rpm离心10min，取上清液，BCA试剂盒测定其蛋白浓度。

(2)蛋白定量与变性

用生理盐水将各组蛋白校准至同一浓度后，加入等体积2×Loading buffer，水浴锅中煮沸10min使其变性，冷却后于－20℃中保存并尽快使用。

(3)SDS-PAGE电泳

①制胶：根据目标蛋白分子量大小配制最适宜浓度的SDS-PAGE分离胶，混合均匀后迅速灌胶至制胶架上提前固定好的玻璃板内，距离玻璃板上缘约1.5cm，加入1mL无水乙醇以保证胶的上缘平整。待分离胶凝固后，倒出无水乙醇，配制5％浓缩胶，灌入分离胶上层，***加样梳，凝固备用；

②上样：待浓缩胶凝固后，将胶板固定至电泳槽上，加入电泳缓冲液没过最短胶板，拔出梳子，每孔上样20μL蛋白样品，并于Marker上样孔中加入2μL的预染蛋白Marker液；

③电泳：接通电源，电泳至目的蛋白分开后即可停止。

(4)转膜

根据分离胶上Maker和目的蛋白的位置，裁取大小合适的分离胶，同时裁取大小与分离胶一致PVDF膜，将PVDF膜置于甲醇中活化10秒，随后将胶和膜浸泡于转膜缓冲液中。在提前铺有滤纸的转膜夹中放入胶和膜，膜在正极，胶在负极，于300mA电流下恒流转膜，转膜时间由目的蛋白分子量决定。

(5)封闭

转膜结束后，将膜放入封闭液(5％脱脂牛奶)，37℃水浴锅中封闭1～2h。

(6)抗体孵育

根据各个抗体说明书用TTBS将一抗稀释至相应比例，将封闭好的PVDF膜在TTBS中清洗后放入稀释好的一抗孵育液中4℃过夜。次日用TTBS清洗PVDF膜3次，10min/次；放入1:1000稀释后的二抗中，37℃孵育2h。孵育结束后，再次用TTBS清洗3次，10min/次。

(7)显色反应

按照ECL试剂盒说明书1:1配制显影液(现配现用)，将PVDF膜正面向上平铺于平皿中，均匀滴加显影液至膜上，避光1min。使用Bio-RAD凝胶成像系统采集图像，利用GELPRO4软件分析条带，结果以目的蛋白与·-actin的灰度比值表示。

实验结果

PCr对DN大鼠肾细胞凋亡影响

TUNEL染色常用于检测组织细胞凋亡情况。如图4A所示，模型组中TUNEL阳性细胞数(绿色荧光细胞)较正常对照组明显增多，提示大鼠肾细胞出现凋亡现象；而与模型组相比，PCr保护组的TUNEL阳性细胞数显著减少。

Western blot检测大鼠肾组织凋亡相关蛋白表达，如图4B和图4C中所示，模型组糖尿病大鼠肾组织中未活化型的Pro-caspase-9表达量减少，Caspase-3和Caspase-9表达量增高，且Bcl-2/Bax比值明显降低；而PCr治疗组中未活化型的Pro-caspase-9表达量上调，Caspase-3和Caspase-9表达量显著下调，且Bcl-2/Bax比值明显提高。提示PCr可以通过减少肾脏细胞凋亡改善糖尿病大鼠肾损伤。

PCr对ERK/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的影响

大鼠肾组织切片免疫荧光实验结果如图5A所示，DN模型组中p-ERK蛋白阳性细胞(红色荧光细胞)较正常对照组明显增多，而PCr治疗组中可以观察到红色荧光减少的现象。Western blot蛋白检测结果如图5B和图5C所示，与正常对照组相比，模型组p-ERK/ERK蛋白比值显著增加，Nrf2和HO-1表达量减少；而p-ERK/ERK蛋白比值在给予PCr治疗后明显下降，Nrf2和HO-1蛋白表达水平出现上调。提示PCr能够有效抑制糖尿病大鼠肾脏细胞中p-ERK的激活，下调ERK磷酸化水平，调节ERK/Nrf2/HO-1信号通路发挥肾脏保护作用。

体外实验

实验方法

NRK-52E细胞培养及实验分组

NRK-52E细胞株(购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)复苏后，用含有10％FBS，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM(高糖型)培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下的恒温培养箱中培养，每2天更换一次培养液。选用对数生长期细胞用于实验。

实验分5组：(1)正常对照组：正常培养的NRK-52E细胞；(2)MGO组：0.8mM MGO作用24h；(3)PCr+MGO组：分别用10mM、20mM、30mM的PCr预孵育NRK-52E细胞4h后加入0.8mM MGO作用24h。

MTT法筛选MGO的浓度及细胞生存率检测

MTT法常用于检测细胞生存率。其检测原理为活细胞线粒体中存在的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶性的蓝紫色细针状结晶甲瓒(Formazan)颗粒，并沉积在细胞中，而死细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶已经失活，不能与MTT反应形成甲瓒结晶，故甲瓒颗粒的生成量与活细胞数目或细胞活性呈正相关。三联液能溶解甲瓒结晶，用酶标仪检测570nm波长处的吸光度值，可间接反映细胞活力。在一定细胞数量级内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

待生长良好的NRK-52E细胞贴壁率达到90％，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，随机平行接种于96孔板(100μL/孔，约2×10⁵/mL)中，无菌PBS填充边缘孔。恒温孵箱中培养24h，待细胞完全贴壁后，根据分组要求给药处理，每组设5个复孔。细胞与药物作用结束后，更换无血清培养基，每孔加入5mg/mL的MTT溶液15μL，37℃避光孵育4h后，各孔加入150μL三联液，待12～16h甲瓒结晶完全溶解后，酶标仪570nm波长处测定各孔OD值，选择最适宜的MGO和PCr浓度作为下一步实验的药物浓度。

实施例5.光镜、DAPI染色观察NRK-52E细胞形态变化

实验方法

(1)光镜观察细胞形态变化

收集实施例4中各组对数生长期的NRK-52E细胞制成单细胞悬液，均匀接种于6孔板，置于37℃含5％CO₂孵箱中培养24h后随机分配对照组和实验组，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，使用倒置显微镜拍摄各组细胞生长情况获取图像。

(2)DAPI染色

DAPI是一种荧光染料，可穿透完整的细胞膜与细胞核中双链DNA强效结合，发出比自身强20多倍的蓝色荧光，常用于检测细胞凋亡。将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于6孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。细胞与药物作用结束后，PBS清洗细胞2次，10％甲醛溶液中固定10min。细胞在室温避光条件下用1μg/mL DAPI溶液染色10min，再用PBS清洗细胞3次，每次5min。使用倒置荧光显微镜观察细胞荧光强度变化，图像采集并记录实验结果。

实验结果

PCr对NRK-52E细胞形态影响

从图6A可得出结论MGO对细胞具有明显的损伤作用，从图6C可得出结论PCr单用对细胞基本无损伤，从图6B可看出合用后PCr可得出结论改善MGO对细胞的损伤

在光镜下观察细胞形态如图7所示，正常组细胞大小均匀，呈卵圆形排列紧密，贴壁牢固且边缘清晰；而模型组细胞逐渐皱缩、变圆、发泡脱落，细胞肿胀不规则；PCr保护组中随药物浓度增加，细胞形态趋向正常卵圆形。DAPI染色观察如图7所示，正常组细胞核形完整，染色质均匀，呈淡蓝荧光；而模型组可见细胞染色质凝聚固缩，细胞核破裂解体呈亮蓝色；PCr保护组中亮蓝色细胞数呈PCr剂量依赖性减少。提示PCr可以改善MGO诱导的细胞损伤。

实施例6.流式细胞术AV-PI检测细胞凋亡

实验方法

Annexin V是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，在Ca²⁺存在的情况下，可与凋亡早期细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)高亲和力特异性结合，从而识别凋亡细胞。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种DNA染料，不能透过完整细胞膜，但能透过凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜将细胞核染红。同时使用Annexin V和PI进行细胞染色，能够区分不同凋亡时期的细胞。

将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于6孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。细胞与药物作用结束后，用胰酶消化细胞，37℃避光条件下使用Annexin V-FITC和PI作为荧光探针与细胞混匀后，利用流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况(具体测定步骤和计算公式参见试剂盒说明书)(日本同仁化学研究所的凋亡检测试剂盒)。

实验结果

PCr对NRK-52E细胞凋亡影响

流式细胞仪检测细胞凋亡率

细胞经Annexin V-FITC/PI双色染色处理，流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。流式图中左下(LL)为正常细胞；右下(LR)为早期凋亡细胞；左上(UL)为坏死细胞；右上(UR)为晚期凋亡细胞。如图8A和图8B所示，正常对照组的细胞凋亡率为7.69％，模型组经0.8mMMGO给药后，细胞凋亡率显著上升至30.07％；而经不同浓度PCr处理后，细胞凋亡率呈PCr剂量依赖性下降，分别为17.93％、13.35％、12.84％。提示PCr可以抑制MGO诱导的NRK-52E细胞凋亡。

实施例7.生化指标测定

实验方法

收集对数生长期的NRK-52E细胞制成单细胞悬液，均匀接种于6孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，收集细胞培养液上清，按照试剂盒说明书标准操作步骤，测定GSH，SOD，MDA的含量变化。按照如下所列公式计算：

GSH含量(μM/gprot)

＝(测定OD值—空白OD值)/(标准OD值—空白OD值)×标准管浓度(20μM/L)

×样本前处理稀释倍数(2倍)÷待测匀浆蛋白浓度(gprot/L)

总SOD活力(U/mL)

＝(对照OD值—测定OD值)/对照OD值÷50％×反应体系的稀释倍数

×样本测试前的稀释倍数

MDA含量(nM/mL)

＝(测定OD值—对照OD值)/(标准OD值—空白OD值)×标准品浓度(10nM/mL)

×样本测试前稀释倍数

实验结果

PCr对NRK-52E细胞内MDA、GSH、SOD影响

图12A至图12C显示，与正常对照组相比，模型组中MGO显著升高细胞内MDA含量，降低GSH含量和SOD活性。而PCr预处理组细胞内MDA水平降低，GSH含量和SOD活性则明显增加，并呈PCr剂量依赖性。提示PCr可以影响MGO诱导的损伤细胞内抗氧化活性物质的含量和活性，具有一定的抗氧化能力。

TUNEL染色和NRK-52E细胞中凋亡相关蛋白表达

如图9A所示，与正常对照组相比，模型组中TUNEL阳性细胞数(绿色荧光细胞)明显增多；而PCr预处理组的TUNEL阳性细胞数呈PCr剂量依赖性减少。Western blot检测细胞中线粒体凋亡途径相关蛋白表达如图9B和图9C所示，经MGO给药24h的模型组细胞中未活化型的Pro-caspase-9表达量减少，Caspase-3和Caspase-9表达量明显增多，且Bcl-2/Bax比值明显降低；而与模型组相比，PCr预处理组中未活化型的Pro-caspase-9表达量上调，Caspase-3和Caspase-9表达量显著降低，Bcl-2/Bax比值明显提高，并呈一定的PCr剂量依赖性。

实施例8.流式细胞术DCFH-DA检测细胞内ROS水平

实验方法

DCFH-DA(2＇,7＇-dichlorodihydrofluorescein)常用于检测细胞内ROS水平的动态变化。其原理为DCFH-DA本身没有荧光，可以自由透过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的非特异性酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能穿过细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以将无荧光的DCFH氧化生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光强度即可反映细胞内ROS水平。

将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于6孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，用胰酶消化收集细胞并用PBS清洗2次，加入10μM/L DCFH-DA探针重悬混匀，于37℃避光孵育30min。每隔5min上下颠倒混匀一下，使细胞和探针充分接触。无血清DMEM清洗细胞3次，利用流式细胞仪上机检测分析(具体步骤参考试剂盒说明书)(日本同仁化学研究所的ROS检测试剂盒)。

实验结果

PCr对NRK-52E细胞内ROS水平影响

DCFH-DA染色后，流式细胞仪检测分析各组细胞内产生ROS水平。如图13A和图13B所示，与正常对照组相比，模型组中MGO可诱导NRK-52E细胞内生成大量ROS，用PCr预处理细胞4h，细胞内ROS水平呈PCr剂量依赖性明显降低。提示PCr可抑制MGO所致NRK-52E细胞中ROS水平的上升，发挥其抗氧化能力保护细胞免受氧化应激损伤。

实施例9.流式细胞术Fluo-3 AM检测细胞内Ca²⁺水平

实验方法

Fluo-3 AM是常用于检测细胞内Ca²⁺浓度的荧光探针。Fluo-3 AM的荧光较弱，其荧光不会随Ca²⁺浓度升高而增强。Fluo-3 AM能够穿透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的非特异性酯酶剪切形成Fluo-3，从而积聚在细胞内。Fluo-3可以结合Ca²⁺后产生较强的荧光，从而反映细胞内Ca²⁺水平。用于细胞内Ca²⁺检测时，Fluo-3 AM常用浓度为5μM。将含有5μM的Fluo-3 AM适当溶液和细胞一起在37℃下孵育40min进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗去未装载入细胞的探针，利用BD FACSCalibur流式细胞仪检测分析细胞内Ca²⁺水平。

实验结果

PCr对NRK-52E细胞内Ca²⁺水平影响

各组细胞用Fluo-3 AM探针孵育后流式细胞仪检测分析细胞内Ca²⁺水平。如图11A和图11B所示，MGO作用24h后模型组细胞内Ca²⁺水平明显上升，PCr预处理组细胞的Ca²⁺水平呈PCr剂量依赖性下降。提示PCr可以减少NRK-52E细胞内Ca²⁺蓄积，从而稳定细胞线粒体膜电位，发挥抑制细胞凋亡的作用。

实施例10.细胞线粒体膜电位检测

实验方法

JC-1广泛用于检测细胞线粒体膜电位(MMP，△·m)。JC-1可以产生两种不同荧光发射峰值，正常细胞△·m较高，JC-1主要以聚合物形式存在线粒体基质中，发出红色荧光；凋亡细胞的△·m较低，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体释放，以单体形式存在于胞质中，发出绿色荧光。JC-1荧光颜色的改变可以反映△·m的变化，常用红绿荧光的相对比值判断△·m的变化。

将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于6孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，用PBS清洗细胞3次，加入1mM的JC-1进行染色，37℃避光条件下平衡20min，再用PBS清洗细胞2次，使用倒置荧光显微镜观察细胞荧光强度变化，图像采集并记录实验结果。

实验结果

PCr对NRK-52E细胞线粒体膜电位变化影响

各组细胞用JC-1染色后倒置荧光显微镜下观察如图10A和图10B所示，对照组细胞线粒体多呈红色荧光；模型组细胞经MGO刺激后，绿色荧光细胞明显增多，提示线粒体膜电位降低，细胞可能处于凋亡早期；而PCr预处理后，红色荧光细胞所占比例明显上升，提示细胞线粒体膜电位呈PCr剂量依赖性显著升高，PCr通过调节线粒体凋亡途径抑制MGO诱导的NRK-52E细胞凋亡。

实施例11.凋亡相关蛋白的检测

实验方法

细胞TUNEL荧光染色

①将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于24孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，用PBS清洗细胞3次，5min/次；②固定：每孔加入1mL甲醛固定液，室温静置30min，PBS清洗细胞3次；③通透：吸干残留液体，滴加100μL细胞通透液，室温静置5min。然后重复实施例4中“组织切片TUNEL荧光染色”的操作步骤③～⑤，倒置荧光显微镜下观察荧光，激发波长范围为450～500nm，发射波长范围为515～565nm。

细胞免疫荧光染色

(1)将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于24孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，用PBS清洗细胞3次，3min/次；

(2)固定：室温在4％多聚甲醛中固定20min，PBS清洗3次，3min/次；

(3)通透：室温在0.2％TritonX-100中通透5min，PBS清洗3次，3min/次；

(4)重复实施例4中“组织切片免疫荧光染色”的操作步骤(4)～(7)，倒置荧光显微镜(200×)下观察荧光。

细胞转染实验

收集对数生长期NRK-52E细胞制成单细胞悬液均匀接种于6孔板，37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育至细胞已贴壁且细胞数达到30％～50％后进行转染实验。将6孔板中换成无FBS的培养液，采用转染试剂Lip3000将ERK-cDNA质粒和随机空白对照质粒转染入细胞，4～6h转染作用后替换成正常培养液，继续培养24h进行相应实验。

Western Blot免疫印迹法检测细胞内相关蛋白表达

(1)细胞蛋白的提取

将NRK-52E单细胞悬液均匀接种于6孔板，培养24h后，依据实验分组进行PCr和MGO给药处理。实验结束后，PBS清洗细胞2遍，每孔加入80μL含有PMSF的RIPA裂解液,4℃裂解15min，细胞刮刮取收集细胞，4℃，12000rpm离心10min，取上清液即为细胞总蛋白。提取核蛋白和胞浆蛋白需按照试剂盒要求实验步骤操作，BCA试剂盒测定其蛋白浓度。

(2)蛋白定量与变性，电泳，转膜，封闭，抗体孵育和显色反应实验步骤同实施例4中“Western Blot免疫印迹法检测大鼠肾组织中相关蛋白表达”的步骤(2)～(7)。

实验结果

PCr对细胞ERK/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达影响

ERK(细胞外信号调节激酶)是MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)家族主要成员之一，在调节细胞增殖生长和***分化凋亡中具有重要作用，也可以通过调控Nrf2/HO-1通路减少氧化应激反应对细胞的损伤。大量文献指出，ERK/MAPK信号通路的激活参与DN的发生发展。NRK-52E细胞免疫荧光实验结果如图14A所示，与正常对照组相比，MGO模型组中p-ERK蛋白阳性细胞(红色荧光细胞)明显增多，而PCr保护组中可以观察到红色荧光逐渐减少的现象。Western blot蛋白检测结果如图14B和图14C所示，模型组细胞中p-ERK/ERK蛋白比值较正常对照组显著增加，Nrf2和HO-1表达量下降；而p-ERK/ERK蛋白比值在PCr预处理细胞中呈PCr剂量依赖性明显下降，Nrf2和HO-1蛋白表达水平则出现上调。提示PCr可以抑制MGO诱导的NRK-52E细胞中p-ERK的激活，下调ERK磷酸化水平，调节ERK/Nrf2/HO-1通路，促进抗氧化防御酶HO-1表达，从而发挥保护糖尿病大鼠肾细胞作用。

ERK过表达对细胞凋亡的影响

为进一步验证PCr是否通过抑制ERK的磷酸化激活来实现抗细胞凋亡作用，将ERKcDNA转染入细胞中使ERK过度表达，Annexin V-FITC/PI双染色后，应用流式细胞仪检测分析。如图15A和图15B所示，ERK过度表达后，MGO诱导细胞凋亡率明显上升；而给予PCr 30mM预处理后发现，PCr降低细胞凋亡率作用被显著抑制。说明PCr发挥抗凋亡作用与其抑制ERK的激活密切相关。

ERK过表达对细胞中ERK/Nrf2/HO-1信号通路蛋白和凋亡相关蛋白表达影响

Western blot实验用于检测细胞中ERK过度表达后PCr对ERK/Nrf2/HO-1信号通路和凋亡相关蛋白表达水平影响。如图16A和图16B所示，ERK过度表达后，MGO诱导的NRK-52E细胞损伤中p-ERK/ERK蛋白比值显著增加，Nrf2和HO-1表达量明显降低，Caspase-3表达量则明显上升。加入PCr 30mM预处理后发现，PCr对p-ERK/ERK蛋白比值，Caspase-3蛋白表达水平的下调作用和对Nrf2，HO-1蛋白表达水平的上调作用被显著抑制。说明PCr可以通过调控ERK/Nrf2/HO-1信号通路发挥抗氧化、抗细胞凋亡作用。