阅读说明：本技术 一种兔球虫病活疫苗及其制备方法和应用 (Rabbit coccidiosis live vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 索勋 刘贤勇 索静霞 李超 顾小龙 汤新明 汪运舟 崔玉娟 陶鸽如 王丹 廖琴 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及动物球虫病疫苗技术领域,具体涉及一种兔球虫病活疫苗及其制备方法和应用。本发明提供一种兔球虫病活疫苗组合物,其包含大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和中型艾美耳球虫的早熟致弱虫株以及穿孔艾美耳球虫的早熟致弱虫株。本发明提供的兔球虫病活疫苗同时具有较高的免疫保护效力和安全性,能够有效防治兔球虫病,减少或杜绝抗球虫药物的使用,同时显著降低疫苗接种对于兔体重增重等生长和生产性能的不利影响,具有良好的经济效益和广阔的应用前景。本发明还提供球虫早熟致弱虫株的选育方法,该方法能够有效缩短早熟虫株的选育周期,提高球虫早熟致弱虫株的选育效率,获得的早熟虫株的遗传特性稳定、致病性显著降低、免疫原性良好。(The invention relates to the technical field of animal coccidiosis vaccines, in particular to a rabbit coccidiosis live vaccine and a preparation method and application thereof. The invention provides a rabbit coccidiosis live vaccine composition, which comprises Eimeria macrotype, Eimeria intestinalis and Eimeria intermedia precocious attenuated strains and Eimeria perforated precocious attenuated strains. The rabbit coccidiosis live vaccine provided by the invention has higher immune protection efficacy and safety, can effectively prevent and treat rabbit coccidiosis, reduces or eliminates the use of anti-coccidiosis drugs, and simultaneously obviously reduces the adverse effects of vaccination on growth and production performances of rabbits such as weight gain and the like, thereby having good economic benefits and wide application prospects. The invention also provides a breeding method of the coccidian prematurity attenuated strain, the breeding method can effectively shorten the breeding cycle of the coccidian prematurity attenuated strain, improve the breeding efficiency of the coccidian prematurity attenuated strain, and the obtained prematurity insect strain has stable genetic characteristic, obviously reduced pathogenicity and good immunogenicity.)

一种兔球虫病活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及动物球虫病疫苗技术领域，具体涉及一种兔球虫病活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素和抗球虫药物作为畜禽饲料添加剂已有较长的历史，是保障集约化养殖模式下畜禽健康的主要手段。随着药物残留和耐药菌(虫)株的频发及对环境和人类健康造成的威胁，利用药物防控动物疫病的策略逐渐暴露弊端。兔球虫病的爆发会引起大规模的兔死亡；慢性和亚临床球虫感染则导致动物生产性能下降、经济效益降低。球虫病的持续发生是许多兔场经济效益不高甚至亏损的主要原因。因此，在抗球虫药物使用的限制和球虫耐药性频发而导致药物防控效果不佳的窘境下，开发高效安全的兔球虫病疫苗迫在眉睫。

兔球虫病的病原为艾美耳属的11种球虫，寄生于肠道不同部位或肝脏，不同虫种的致病性和流行率不同，对养兔业的危害不同。其中，大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和穿孔艾美耳球虫是兔场感染和流行的主要虫种，并且前三种虫种具有较强致病性，引起严重腹泻，严重影响生产性能和兔业经济效益。因此，兔球虫病疫苗的研制必须实现两个主要目标：一是对致病性球虫种有很好的保护作用；二是安全性高。以活卵囊为组分的疫苗能够有效抵抗同种球虫的再次感染，在鸡和火鸡球虫病的预防中展现出巨大优势。因此，开发针对流行球虫虫种的活疫苗用于兔球虫病的预防，能够显著降低抗球虫药物的使用，最终实现不再使用抗球虫药物，进而有效提升食品安全、环境和经济效益，应用前景十分广阔。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有优异的安全性和免疫保护效力的兔球虫病弱毒活疫苗以及高效快速选育早熟球虫致弱虫株的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

以兔球虫的活卵囊作为疫苗的免疫原虽然更有利于提高疫苗的免疫保护效力，但是其对动物生长和生产的不利影响风险更高，因此，如何在保证兔球虫活疫苗的免疫保护效力的同时提高其安全性，是兔球虫疫苗研发过程中所面临的技术难题。在兔球虫疫苗的研究中，多利用高致病性虫种进行接种以获得相应虫种的免疫力，而低致病性或基本无致病性的兔球虫往往被忽视，本发明在研发同时具有高免疫效力和高安全性的兔球虫疫苗过程中，发现将相对低剂量的大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫等高致病性兔球虫的早熟致弱虫株与相对高剂量的穿孔艾美耳球虫、微小艾美耳球虫、维氏艾美耳球等低致病性兔球虫复配使用，能够显著降低疫苗对于兔生长的影响，有效提高疫苗的安全性，同时保证疫苗的免疫保护效力。进一步地，为提高疫苗的制备效率，本发明在传统早熟压力选育法的基础上，开发了早熟致弱虫株的快速选育方法，有效缩短了早熟致弱虫株的传代和筛选周期，而且获得的早熟致弱虫株的遗传特性稳定、安全性高、免疫原性好。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种兔球虫病活疫苗组合物，其包含至少3种高致病性兔艾美耳球虫的早熟致弱虫株以及低致病性兔艾美耳球虫；所述低致病性兔球虫为野生虫株和/或早熟致弱虫株。

优选地，所述兔球虫病活疫苗组合物中，所述高致病性兔艾美耳球虫的早熟致弱虫株和所述低致病性兔艾美耳球虫的卵囊数量的比例为1：(2～20)。优选为1：(5～20)。以上述范围内的含量比例复配使用，能够更好地同时保证疫苗的安全性与免疫保护效力。

优选地，所述低致病性兔球虫采用早熟致弱虫株。

优选地，所述低致病性兔艾美耳球虫包括微小艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫中的一种或多种。

在众多的高致病兔球虫和低致病性兔球虫中，本发明发现穿孔艾美耳球虫对于提高大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和中型艾美耳球虫组成疫苗的安全性的效果最优。因此，所述兔球虫病活疫苗组合物中，所述高致病性兔艾美耳球虫的早熟致弱虫株优选包括大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和中型艾美耳球虫的早熟致弱虫株；所述低致病性兔艾美耳球虫优选包括穿孔艾美耳球虫。

在满足上述组分含量配比的基础上，为更好地同时保证疫苗的安全性和免疫保护效力，优选地，所述兔球虫病活疫苗组合物包括如下组分：大型艾美耳球虫的早熟致弱虫株100～3000卵囊/头份，肠艾美耳球虫的早熟致弱虫株500～5000卵囊/头份，中型艾美耳球虫的早熟致弱虫株500～6000卵囊/头份，穿孔艾美耳球虫的野生虫株或早熟致弱虫株1500～40000卵囊/头份。

更优选地，所述兔球虫病活疫苗组合物包括如下组分：大型艾美耳球虫的早熟致弱虫株500～3000卵囊/头份，肠艾美耳球虫的早熟致弱虫株1000～5000卵囊/头份，中型艾美耳球虫的早熟致弱虫株1000～5000卵囊/头份，穿孔艾美耳球虫的野生虫株或早熟致弱虫株3000～30000卵囊/头份。

为扩大疫苗的免疫保护范围，本发明所述的兔球虫病活疫苗组合物可包含多种高致病性球虫和低致病性球虫，进而形成多价球虫疫苗。

作为本发明的一种优选方案，本发明提供由大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和中型艾美耳球虫的早熟致弱虫株以及穿孔艾美耳球虫的早熟致弱虫株组成的四价兔球虫活疫苗组合物。该兔球虫病活疫苗组合物的免疫原组成如下：大型艾美耳球虫的早熟致弱虫株1000～3000卵囊/头份，肠艾美耳球虫的早熟致弱虫株1000～4000卵囊/头份，中型艾美耳球虫的早熟致弱虫株2000～5000卵囊/头份，穿孔艾美耳球虫的野生虫株或早熟致弱虫株3000～30000卵囊/头份。其中，穿孔艾美耳球虫与大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和中型艾美耳球虫的卵囊数量之比优选均为(5～20)：1。

本发明所述的兔球虫病活疫苗的免疫方式为：20～50日龄兔，经口接种。

进一步地，本发明提供所述兔球虫病活疫苗组合物的制备方法，其包括早熟致弱虫株的选育；所述早熟致弱虫株的选育采用经典早熟压力选育法或采用包括如下步骤的选育方法：将待致弱球虫虫株口服接种兔，于接种后12～72小时再次以高剂量的待致弱球虫虫株口服接种一次或多次，收获最早排出的卵囊进行传代扩增。

优选地，首次接种后进行再次接种以及各再次接种之间的时间间隔为12～60小时；所述高剂量为首次接种的免疫剂量的5～10倍。

具体地，所述再次以高剂量的待致弱球虫虫株口服接种一次或多次分别为在首次接种后的12～72小时和24～84小时再次接种两次。

优选地，所述早熟致弱虫株的选育方法包括：将待致弱球虫虫株以1.0×10⁵～2.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种兔，于首次接种后12～72小时将待致弱球虫虫株以5.0×10⁵～1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后24～84小时将待致弱球虫虫株以1.0×10⁶～2.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次，收获最早排出的卵囊进行传代扩增。

本发明还提供所述兔球虫病活疫苗组合物或利用所述制备方法得到的兔球虫病活疫苗组合物在制备用于预防或治疗兔球虫病的制剂中的应用。

本发明提供一种兔球虫病活疫苗，其包含所述兔球虫病活疫苗组合物。

优选地，所述兔球虫病活疫苗还包含动物疫苗领域允许的佐剂和辅料。

另一方面，本发明提供一种球虫早熟致弱虫株的选育方法，包括：将待致弱球虫虫株口服接种兔，于首次接种后12～72小时再次以高剂量的待致弱球虫虫株口服接种一次或多次，收获最早排出的卵囊进行传代扩增。

优选地，首次接种后进行再次接种以及各再次接种之间的时间间隔为12～60小时；所述高剂量为首次接种的免疫剂量的5～10倍。更优选地，首次接种后进行再次接种的时间间隔为12～48小时，各再次接种之间的时间间隔为12～24小时。

本发明提供的上述兔球虫的快速致弱的选育方法，不同于目前最常采用的经典早熟压力选育法，通过增加一次或多次高剂量接种，再收取最早排出的卵囊进行传代、扩增获得的早熟致弱虫株的周期比经典早熟压力选育法缩短2～5代，并且获得的早熟虫株的遗传特性稳定、致病性显著降低、同时保持良好免疫原性。

优选地，所述再次以高剂量的待致弱球虫虫株口服接种一次或多次为分别在首次接种后的12～72小时和24～84小时再次接种两次。更优选地，分别在首次接种后的12～48小时和24～72小时进行再次接种两次。

更优选地，所述选育方法包括：将待致弱球虫虫株以1.0×10⁵～2.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种兔，于首次接种后12～72小时将待致弱球虫虫株以5.0×10⁵～1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后24～84小时将待致弱球虫虫株以1.0×10⁶～2.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次，收获最早排出的卵囊进行传代扩增。

本发明进一步提供所述球虫早熟致弱虫株的选育方法在球虫致弱虫株选育或球虫病疫苗制备中的应用。

本发明还提供一种球虫病活疫苗，其包含利用所述球虫早熟致弱虫株的选育方法选育得到的球虫早熟致弱虫株。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的兔球虫病活疫苗同时具有较高的免疫保护效力和安全性，能够有效防治兔球虫病，免疫持续期长，可有效减少或杜绝抗球虫药物的使用，降低养殖成本，同时显著降低疫苗接种对于兔体重增重等生长和生产性能的不利影响，提高养殖效益，并且该疫苗易于生产、对动物产品和环境无污染，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。

本发明提供的球虫早熟致弱虫株的选育方法能够有效缩短早熟虫株的选育周期，有效提高球虫早熟致弱虫株的选育效率，获得的早熟虫株的遗传特性稳定、致病性显著降低、同时保持良好免疫原性，为球虫早熟致弱虫株的选育和球虫疫苗的制备提供了高效的方法。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1球虫早熟致弱虫株的选育方法(1)

本实施例提供一种球虫的早熟致弱虫株选育方法，包括如下步骤：

(1)首次接种：将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种清洁级(无球虫感染)新西兰大白兔；

(2)重复接种：首次接种后12小时将待致弱的球虫虫株以5.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后24小时将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次；

(3)收获最早排出的卵囊，在适宜条件下完成孢子生殖后进行传代扩增。

实施例2球虫早熟致弱虫株的选育方法(2)

本实施例提供一种球虫的早熟致弱虫株选育方法，包括如下步骤：

(1)首次接种：将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种清洁级(无球虫感染)新西兰大白兔；

(2)重复接种：首次接种后24小时将待致弱的球虫虫株以5.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后36小时将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次；

(3)收获最早排出的卵囊，在适宜条件下完成孢子生殖后进行传代扩增。

实施例3球虫早熟致弱虫株的选育方法(3)

本实施例提供一种球虫的早熟致弱虫株选育方法，包括如下步骤：

(1)首次接种：将待致弱的球虫虫株以2.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种清洁级(无球虫感染)新西兰大白兔；

(2)重复接种：首次接种后12小时将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后24小时将待致弱的球虫虫株以2.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次；

(3)收获最早排出的卵囊，在适宜条件下完成孢子生殖后进行传代扩增。

实施例4球虫早熟致弱虫株的选育方法(4)

本实施例提供一种球虫的早熟致弱虫株选育方法，包括如下步骤：

(1)首次接种：将待致弱的球虫虫株以2.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种清洁级(无球虫感染)新西兰大白兔；

(2)重复接种：首次接种后36小时将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后48小时将待致弱的球虫虫株以2.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次；

(3)收获最早排出的卵囊，在适宜条件下完成孢子生殖后进行传代扩增。

实施例5球虫早熟致弱虫株的选育方法(5)

本实施例提供一种球虫的早熟致弱虫株选育方法，包括如下步骤：

(1)首次接种：将待致弱的球虫虫株以2.0×10⁵孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种清洁级(无球虫感染)新西兰大白兔；

(2)重复接种：首次接种后48小时将待致弱的球虫虫株以1.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服再接种一次；再于首次接种后72小时将待致弱的球虫虫株以2.0×10⁶孢子化卵囊/兔的接种剂量口服接种一次；

(3)收获最早排出的卵囊，在适宜条件下完成孢子生殖后进行传代扩增。

实验例6早熟致弱虫株的选育

利用实施例1～5的球虫早熟致弱虫株的选育方法，分别选育流行率高、致病性强的虫种大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫以及弱致病性虫种穿孔艾美耳球虫的早熟致弱虫株。将利用实施例1～5提供的球虫早熟致弱虫株的选育方法与文献报道的经典早熟选育法(经典早熟选育方法具体为：以高剂量待致弱的球虫虫株进行口服接种，收获最早排出的卵囊，具体方法和实验结果参见文献，Jeffers T K，Attenuation ofeimeria tenella through selection for precociousness.J Parasitol,1975,61(6):1083-1090)的选育传代次数和潜隐期情况进行比较，结果如表1所示。结果表明，实施例1～5提供的球虫早熟致弱虫株的选育方法所需的选育代次明显减少，能够更快速地获得毒力减弱的早熟虫株，并且获得的虫株经无压力连续扩繁10代，仍保持缩短的潜隐期(表1)，表明利用本实施例发明的方法获得的致弱虫株遗传特性稳定。

表1不同选育方法获得兔球虫的早熟致弱虫株的效率比较

实施例7利用兔球虫早熟致弱虫株开发三价兔球虫病活疫苗

本实施例将利用实施例1的选育方法选育得到的大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫的早熟致弱虫株用于兔球虫病活疫苗的制备，开发兔球虫病的三价活疫苗。

首先，以有效抵抗5.0×10⁴个同种孢子化卵囊的野毒虫株感染为标准确定各早熟致弱虫株的最佳免疫剂量(表2)。根据表2所示的实验结果确定各早熟致弱虫株的最佳免疫剂量分别是：大型艾美耳球虫1500/兔、中型艾美耳球虫3000/兔和肠艾美耳球虫2000/兔。

表2大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫早熟致弱虫株的最佳免疫剂量筛选

进一步基于上述确定的单个虫株的最佳免疫剂量，进行多方配比，确定三价疫苗中各虫株的适宜免疫剂量，即大型艾美耳球虫1500/兔、中型艾美耳球虫3000/兔和肠艾美耳球虫2000/兔，根据确定的免疫剂量进行配比制备三价兔球虫活疫苗。

对制备的三价兔球虫活疫苗进行安全性和免疫保护效力分析，具体方法如下：按上述确定的最佳免疫剂量进行配比疫苗后，经口接种35日龄新西兰大白兔(每组10只)，设置免疫组、重复免疫组、高剂量免疫组及不免疫对照组及不免疫攻毒组。其中重复免疫组为按最佳免疫剂量免疫后14日再次按相同剂量进行二次免疫；高剂量免疫组为按推荐剂量的10倍进行免疫。免疫后所有兔正常饲养，保障充足饲料和饮水。对安全性评价：于免疫后14日称重，计算各组免疫前后家兔体增重的变化。对免疫效力评价：于免疫后14日，以高剂量的混合野毒虫株(每种含1.0×10⁵个孢子化卵囊)进行攻毒，统计攻毒后的卵囊排出和体增重。

表3三价兔球虫活疫苗的安全性和免疫保护效力

结果如表3所示，结果表明，三种兔球虫早熟致弱虫株按最佳配比免疫后，对大剂量的野毒虫株感染具有良好免疫保护力，但是三价兔球虫活疫苗的免疫对兔的体重增重存在一定的不利影响。

实施例8四价兔球虫活疫苗的开发

本实施例在实施例2的三价球虫活疫苗的基础上进一步引入高剂量(3000个卵囊/头份、10000个卵囊/头份或30000个卵囊/头份)的利用实施例1的选育方法得到的穿孔艾美耳球虫早熟致弱虫株，制备四价兔球虫病活疫苗。

对上述获得的四价兔球虫活疫苗的免疫保护效力和安全性进行评价，分析穿孔艾美耳球虫的引入对大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫的免疫效力和安全性的影响，具体方法如下：

按最佳免疫剂量进行配比疫苗后，在疫苗组分中按不同高剂量的穿孔艾美耳球虫(3000个卵囊/头份、10000个卵囊/头份或30000个卵囊/头份)，经口接种35日龄新西兰大白兔(每组10只)，分组如表4。免疫后所有兔正常饲养，保障充足饲料和饮水。对安全性评价：于免疫后14日称重，计算各组免疫前后家兔体增重的变化。对免疫效力评价：于免疫后14日，以高剂量的混合野毒虫株(每种含1.0×10⁵个孢子化卵囊)进行攻毒，统计攻毒后的卵囊排出和体增重。

结果如表4所示，结果表明，添加高剂量的穿孔艾美耳球虫对于由大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫组成的三价球虫疫苗的免疫保护效力没有显著影响，但是对于兔的体重增重的不利影响显著减少，证明由大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和穿孔艾美耳球虫组成的四价兔球虫活疫苗同时具有高免疫保护效力与高安全性。

表4四价兔球虫活疫苗的免疫效力和安全性分析

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。