一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用 (Eimeria maxima nano subunit vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 李祥瑞 宋小凯 严若峰 徐立新 黄剑梅 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及巨型艾美耳球虫(E.maxima)重组蛋白亚单位疫苗EmMIC3和纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3,属于生物兽药技术领域。该纳米亚单位疫苗为用PLGA纳米材料包裹重组蛋白亚单位疫苗EmMIC3制成。经动物免疫保护性试验证实,上述重组蛋白亚单位疫苗EmMIC3和纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3均能够有效抵抗巨型艾美耳球虫感染。本发明用纳米材料PLGA包裹重组蛋白EmMIC3形成了一个全新的疫苗形式,不同于单独EmMIC3重组蛋白,二者组分不同。并且EmMIC3重组蛋白与纳米材料PLGA包被以后,其免疫保护效果得到明显的提升,保护效果从一般提升到优秀。(The invention relates to an Eimeria maxima (E.maxima) recombinant protein subunit vaccine EmMIC3 and a nano subunit vaccine PLGA-EmMIC3, belonging to the technical field of biological veterinary medicines. The nanometer subunit vaccine is prepared by using PLGA nanometer material to wrap recombinant protein subunit vaccine EmMIC 3. Animal immune protective tests prove that the recombinant protein subunit vaccine EmMIC3 and the nano subunit vaccine PLGA-EmMIC3 can effectively resist the infection of the Eimeria maxima. According to the invention, the recombinant protein EmMIC3 is encapsulated by the nano material PLGA to form a brand-new vaccine form, which is different from the single EmMIC3 recombinant protein, and the two components are different. After the EmMIC3 recombinant protein and the nano material PLGA are coated, the immune protection effect is obviously improved, and the protection effect is generally improved to be excellent.)
技术领域
本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的全球流行的寄生虫病。其发病率50-70％，死亡率为20-30％，严重时可达80％以上。耐过鸡的生产效率大大降低，每年造成的经济损失超过30亿美元。当前，鸡球虫病主要以药物防治为主。但随着耐药虫株不断出现，使药物预防效果明显降低，而且药物使用过程中产生的鸡球虫抗药性和抗球虫药物残留，严重影响了动物源食品安全。因此人们致力于寻找抗球虫药物的替代方法。研究发现，免疫预防可以解决药物残留问题，是控制球虫病的理想方法。当前市售的抗鸡球虫疫苗均为活疫苗，但活疫苗具有自身不足，如免疫程序和使用方法不易控制；生产量有限、成本高、难保存，难以满足现代养鸡业的需要；此外，最重要的是活疫苗存在毒力可能返强、易散毒等安全性问题和免疫效果问题。随着分子生物学领域的快速发展，新一代疫苗如亚单位疫苗诞生，并日益在畜禽疫病控制上发挥重要作用。亚单位疫苗只含有病原体的一种产生保护性免疫应答所必需的免疫原蛋白成分，具有不能在鸡体内复制、对鸡无致病性、不散毒等特点。将亚单位疫苗接种鸡后，可使鸡在获得抗性的同时增强机体抵抗球虫感染的能力，而且亚单位疫苗具有安全、性质稳定，方便运输，生产成本低等优点。因此，亚单位疫苗极具研究意义。但目前商品化的亚单位疫苗极少。
近年来，纳米技术的发展使设计不同成分、大小、形状和表面特征的纳米颗粒成为可能，也为纳米颗粒应用于医学领域创造机会。由于纳米颗粒大小与细胞成分相似，故能通过细胞内吞机制，尤其是胞饮作用进入活细胞。纳米颗粒作为疫苗载体运输工具和免疫增强剂被广泛应用，不仅能够提高抗原的稳定性、增强抗原的递呈和免疫原性，同时也能够靶向性递呈抗原和缓慢释放。事实上，纳米颗粒正在改变疾病的诊断，以及为疾病预防和治疗提供生物活性物质。聚乙丙交酯(PLGA)具有良好的生物相容性和生物降解性，是美国FDA和欧洲药物管理局批准用于临床治疗的纳米材料，已经在HIV DNA疫苗中显示出了良好的免疫增强效果。目前未见PLGA纳米亚单位疫苗在鸡球虫的应用研究报道。
国际上公认的鸡球虫病病原体有7种，分别为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)，早熟艾美耳球虫(E.praecox)和和缓艾美耳球虫(E.mitis)。其中巨型艾美耳球虫(E.maxima)为分布最广泛危害最严重的虫种之一。已有研究报道E.tenella微线蛋白3(EtMIC3)是决定E.tenella寄生于盲肠的关键分子，然而决定E.maxima寄生部位的关键分子尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供能够预防E.maxima鸡球虫感染的纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3。
本发明的另一目的是提供该纳米亚单位疫苗的制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种巨型艾美耳球虫(E.maxima)纳米亚单位疫苗，所述的巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗是由PLGA包裹重组蛋白EmMIC3形成的纳米粒子，所述的重组蛋白EmMIC3为巨型艾美耳球虫微线蛋白3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的重组蛋白EmMIC3优选将E.maxima重组表达质粒pET-32a(+)-MIC3在转入大肠杆菌中进行表达，将表达出来的重组蛋白EmMIC3经His蛋白纯化柱纯化所得。
所述的巨型艾美耳球虫(E.maxima)纳米亚单位疫苗粒径优选80nm-330nm。
本发明所述的巨型艾美耳球虫(E.maxima)纳米亚单位疫苗的制备方法，包含以下步骤：
(1)将E.maxima pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞，得到含有pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒的细菌；
(2)表达纯化巨型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3；
(3)制备纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3：制备PLGA的二氯甲烷溶液，其中PLGA的质量体积浓度为4～5g/100mL；向PLGA的二氯甲烷溶液中加入5％PVA，涡旋混匀1～2min；冰浴条件下，超声破碎3～5min；边涡旋边逐滴加入步骤(2)制备的重组蛋白EmMIC3溶液，涡旋混匀1～2min；冰浴条件下，超声破碎3～5min，形成乳白色的初乳液；往初乳液中边涡旋边加入5％PVA，冰浴条件下超声破碎3～5min，形成复乳液；将超声后获得的复乳液边搅拌边挥发，直至有机溶剂挥发尽；冷冻超速离心机28000～30000r/min离心30～40min；离心结束后，分别收集上清和沉淀；用去离子水重悬超速离心后获得的沉淀得到PLGA包裹的重组蛋白混悬液，将其置于西林瓶中，-80℃放置1.5～2h，再将其转移到真空冷冻干燥机中，冷冻干燥20～24h得所述的巨型艾美耳球虫(E.maxima)纳米亚单位疫苗；其中，每次加入5％PVA的体积为PLGA的二氯甲烷溶液体积的2～2.5倍；每次超声破碎功率40～50W，超声3～5s，间隔5s。
其中，步骤(1)中所述的E.maxima pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒构建方法优选见巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力，黄经纬，南京农业大学博士学位论文，2016。
步骤(2)表达纯化巨型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3方法优选：将含有pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒的大肠杆菌按1:80～120体积比例接种于LB液体培养基，37℃,200r/min培养至OD600为0.4-0.6时，加入终浓度为0.8～1mmol/L的IPTG进行诱导表达，将表达出来的重组蛋白EmMIC3经His蛋白纯化柱纯化得纯化的巨型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3。
本发明所述的巨型艾美耳球虫(E.maxima)纳米亚单位疫苗在制备预防鸡巨型艾美耳球虫感染的药物中的应用。
本发明具有以下优点和效果：
(1)目前未见巨型艾美耳球虫PLGA纳米亚单位疫苗的研究与报道，本发明填补了巨型艾美耳球虫PLGA纳米亚单位疫苗研究的空白。(2)本发明用纳米材料PLGA包裹重组蛋白EmMIC3形成了一个全新的疫苗形式，不同于单独EmMIC3重组蛋白，二者组分不同。并且EmMIC3重组蛋白与纳米材料PLGA包被以后，其免疫保护效果得到明显的提升，保护效果从良好(ACI＝167.03)提升到优秀(ACI＝184)。(3)本发明对报道的纳米材料的包埋工艺进行了改进，将PVA的浓度由报道的浓度1％提升到5％，纳米疫苗的包埋率得到了显著提升(由有报道的44.7％～82.7％提升至90.09％)。
附图说明
图1SDS-PAGE分析EmMIC3融合蛋白。
M：蛋白marker(kDa)；1：诱导前pET-32a；2：诱导5h后pET-32a；3：纯化后pET-32a-EmMIC3；4：诱导前pET-32a-EmMIC3；5：诱导5h后pET-32a-EmMIC3。
图2纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3的扫描电镜结果。
具体实施方式
基础材料：
1.孢子化卵囊：江苏株巨型艾美耳球虫孢子化卵囊，每3个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80％以上(索勋,李国清.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社，1998.)。
2.实验动物：0日龄海兰白雏鸡，购自安海县双利孵禽场，自出壳至试验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。
3.菌种：转化了重组表达质粒E.maxima pET-32a(+)-MIC3(黄经纬，巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力.南京农业大学博士学位论文，2016)的E.coli BL21菌株。
4.工具酶与试剂：蛋白分子量Marker购自Thermo Fisher Scientific公司；HIS融合蛋白纯化试剂盒(美国GE公司)、聚丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰、考马斯亮蓝购自上海化学试剂分装厂；聚乙丙交酯(PLGA,Poly(D,L-lactide-co-glycolide)lactide:glycolide 65:35,Mw 40000-75000)、聚乙烯醇(PVA,Poly(vinyl alcohol),Mw 31000-50000)购自Sigma Aldrich公司；其余试剂为国产分析纯。
5.主要仪器设备：冷冻台式离心机(Eppendorf centrifuge 5417R)；紫外可见分光光度计(Bio-Rad)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)；冷冻超速离心机(美国Beckman Coulter公司)；真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)；扫描电子显微镜(日本JEOL JSM-IT100)。
实施例1.巨型艾美耳球虫EmMIC3重组蛋白的表达纯化
1.基因工程菌制备
将E.maxima pET-32a(+)-MIC3(黄经纬，巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力.南京农业大学博士学位论文，2016)重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞，得到含有pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒的细菌。
2.巨型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3的表达纯化
将含有pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒的细菌按1:100体积比例接种于LB液体培养基，37℃,200r/min培养至OD600为0.4-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。按照GE公司蛋白纯化试剂盒说明书对EmMIC3重组蛋白进行纯化，将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析纯化情况，结果表明该重组蛋白纯化效果良好(附图1)。用PEG20000浓缩纯化后EmMIC3重组蛋白，用0.22μm滤器过滤除菌，再用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，然后将该重组蛋白用无菌PBS稀释成试验所需的浓度，即为巨型艾美耳球虫重组蛋白亚单位疫苗。
1.纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3的制备
称取50mg PLGA置于10mL EP管中，加入1mL二氯甲烷(通风橱中操作)，用二氯甲烷溶解PLGA；加入2mL 5％PVA逐滴加入到已经溶解的PLGA中，边涡旋边滴加，涡旋混匀1min；冰浴条件下，超声破碎5min(超声功率40W，超声5s，间隔5s)；边涡旋边逐滴加入5mg蛋白溶液，涡旋混匀1min；冰浴条件下，超声破碎3min(超声功率40W，超声5s，间隔5s)，形成乳白色的初乳液；往初乳液中边涡旋边加入2mL 5％PVA，冰浴条件下超声破碎5min(超声功率40W，超声5s，间隔5s)，形成复乳液；将超声后获得的复乳液置于通风橱中，边搅拌边挥发，直至有机溶剂挥发尽；冷冻超速离心机30000r/min离心30min；离心结束后，分别收集上清和沉淀；测量上清总体积和上清中蛋白含量，计算PLGA包裹重组蛋白的包埋率(包埋率＝(加入的蛋白总量-上清中的蛋白含量)/加入的蛋白总量×100％)；用2mL去离子水重悬超速离心后获得的沉淀得到PLGA包裹的重组蛋白混悬液,将其置于5mL西林瓶中，-80℃放置2h，再将其转移到真空冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；取出样品，将PLGA纳米亚单位疫苗置于4℃保存，备用。取出少量PLGA纳米亚单位疫苗冻干粉送上海擎奥检测技术有限公司进行扫描电子显微镜观察。结果发现PLGA包裹重组蛋白亚单位疫苗的包埋率为90.09％，PLGA纳米亚单位疫苗的粒径约为80nm-330nm(附图2)。
实施例2.巨型艾美耳球虫重组蛋白亚单位疫苗和纳米亚单位疫苗的免疫保护性检测
1.试验设计
0日龄海兰白雏鸡饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由饮水采食。14日龄鸡逐只称重，淘汰体重过重和过轻的个体，随机分组并调整各试验组间的平均体重，使平均体重接近一致，每组20羽；分别用重组蛋白EmMIC3、pET-32a标签蛋白、PLGA，以及PLGA纳米材料包裹重组蛋白制备而成的纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3和PLGA-pET-32a标签蛋白经腿部肌肉注射免疫鸡，免疫剂量为100μg，21日龄时进行加强免疫，28日龄时经口感染新鲜的E.maxima孢子化卵囊10×104个/羽，并设感染非免疫组(红对照组)和非感染非免疫组(白对照组)，共7组。各组分别于首免、攻虫和剖杀时逐只称重。攻虫后7天(35日龄)剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数，分组情况见表1。
表1重组蛋白亚单位疫苗及PLGA纳米亚单位疫苗免疫程序
2.免疫保护效果的观察
2.1增重效果
在首次免疫时、攻虫时和宰杀时对试验鸡逐只称重，计算平均增重和相对增重率。
平均增重＝宰杀时重-攻虫时重
相对增重率(％)＝试验组平均增重/非感染非免疫组平均增重×100
2.2肠道病变记分
攻虫后7天宰杀全部鸡，逐只观察肠道病变，并按Johnson病变记分方法(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998,257-258,296-298)进行肠道病变记分。具体记分方法如下：
感染E.maxima后小肠病变记分：
0分，无肉眼可见病变。
+1分，小肠中段浆膜面隐约可见出血点，肠腔内含有少量桔黄色粘液，肠管形状未见异常。
+2分，小肠中段浆膜面有多量出血点，肠腔中见有多量桔黄色粘液，肠壁增厚。
+3分，小肠充气，壁增厚，粘膜面粗糙，小肠内容物含有小血凝块和粘液。
+4分，小肠充气明显，肠壁高度增厚，肠内容物含有大量血凝块和红褐色血液。死亡鸡只也计+4分。
病变记分减少率(％)＝(感染非免疫组病变记分-试验组病变记分)/感染非免疫组病变记分×100
2.3卵囊计数
按麦克马斯特法计算卵囊，具体为：攻虫后第7天，宰杀全部鸡，逐只取其肠道，将肠管纵向剖开，用载玻片刮取肠道内容物，混合均匀后称取2g，先加10mL饱和食盐水，搅拌均匀后再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静置1-2min后，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为1×1×0.15＝0.15mL，0.15mL内含肠道内容物2×0.15/(10+50)＝0.005g，两个计数室则为0.01g，所得卵囊数乘100即为每克肠道内容物卵囊数(OPG)。
卵囊减少率(％)＝(感染非免疫组克卵囊数-试验组克卵囊数)/感染非免疫组克卵囊数×100
2.4抗球虫指数(Anticoccidial Index，ACI)
ACI包括存活率、增重、肠道病变以及卵囊产量等多项指标，综合评定抗球虫药物的效力或疫苗免疫的效果。本研究采用如下ACI计算公式：
ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)
存活率(％)＝(实验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100
相对增重率(％)＝(试验组的平均增重/非感染非免疫组的平均增重)×100
病变值(0-40)＝各试验组的平均病变记分(0-4)×10
卵囊值(0～40)的转化标准如下：E.maxima肠内容物卵囊值取决于试验组卵囊数占感染非免疫组的比例(％)，若此比例(％)为0～1.0％，卵囊值则计为0，若为1％～25％，则计为1，若为26％～50％，则计为10，若为51％～75％，则计为20，若为76％～100％，则计为40。
3免疫保护效果分析
根据SPSS 25软件统计分析结果显示(表2)：首免时选择体重相近的鸡进行免疫，各组间体重差异不显著(P>0.05)，表明试验分组平均、合理；平均增重代表疫苗免疫对鸡的保护作用；试验所用重组蛋白亚单位疫苗EmMIC3和PLGA纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3对鸡感染E.maxima后的平均增重均显著高于感染非免疫组、标签蛋白组和PLGA纳米材料组的平均增重(P<0.05)；EmMIC3组与PLGA-EmMIC3组的平均增重差异显著(P<0.05)，其余试验组之间差异不显著(P>0.05)；说明上述重组蛋白亚单位疫苗EmMIC3和PLGA纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3能够缓解鸡在感染E.maxima时对体重的负面影响，且具有保护效果。上述亚单位疫苗和PLGA纳米亚单位疫苗免疫组鸡的OPG和肠道病变记分均明显低于感染非免疫组，差异显著(P<0.05)；各试验组的卵囊减少率和肠道病变记分减少率高于感染非免疫组和标签蛋白免疫组。说明重组蛋白亚单位疫苗EmMIC3和PLGA纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3能够不同程度的减少E.maxima感染后的卵囊排出量和减轻肠道的病变，对E.maxima感染均具有不同程度的免疫保护力。亚单位疫苗EmMIC3的抗球虫指数(ACI)为167.03，大于160，说明其对E.maxima具有良好的免疫保护效果；纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3的ACI为184.00，大于180，说明其对E.maxima具有优秀的免疫保护效果。
表2亚单位疫苗和纳米亚单位疫苗对巨型艾美耳球虫感染的免疫保护效果评价
备注：抗球虫指数(ACI)的判定标准：当ACI>180时，为保护效果优秀；当ACI＝160～180时，为保护效果良好；当ACI＝120～160时，为保护效果差；ACI<120时，为无保护效果。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 661
<212> PRT
<213> 巨型艾美耳球虫(E. maxima)
<400> 1
Met Lys Val Pro Ser Ala Leu Gly Val Leu Ala Trp Ala Thr Ile Gln
1 5 10 15
Ala Ser Glu Ala Val Arg Leu Asp Arg Ser Phe Leu Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Glu Ile Gly Ile Ser Glu Gln Gln Gly Thr Thr Arg Arg Ser Leu Gln
35 40 45
Asp Ala Leu Asp Asp Leu Cys Arg Ile Glu Ala Gln Ala Ala Cys Arg
50 55 60
Ser Gly Leu Gly His Tyr Cys Asn Ala Thr Val Tyr Ala Arg Tyr Asp
65 70 75 80
Gly Ala Ser Asn Asn Val Asn Ser Lys Glu Trp Arg Cys Tyr Ala Glu
85 90 95
Asp Ala Leu Asp Phe Gly Val Ala Arg Ala Gly Cys Val Asp Thr Cys
100 105 110
Gly Arg Gln Lys Met Cys Pro Gly Ala Tyr Asn Gly Val Ala Lys Thr
115 120 125
Tyr Leu Ser Arg Asn Ser Gln Leu Lys Gly Gln Val Asp Ala Leu Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr Cys Ser Ala Pro Ala Pro Thr Leu Gln Glu Ala Leu Asp
145 150 155 160
Arg Lys Cys Ala Ala Phe Gly Glu Glu Ala Cys Asn Gln Gly Leu Trp
165 170 175
Ala Tyr Cys Asp Ile Thr Leu Tyr Ala Arg His Asp Val Gly Asn Ala
180 185 190
Ser Gln Lys Gly Arg Glu Trp Arg Cys Phe Ala Gln Asp Ala Leu Asp
195 200 205
Phe Asp Met Ser Gly Asp Gly Cys Val Asp Asn Cys Gly Asn Leu Ile
210 215 220
Ser Cys Arg Gly Ala Val Asn Gly Thr Ser Ser Lys His Leu Ser Arg
225 230 235 240
Gly Asn Glu Ile Ser Ser Val Ile Leu Gly Asp Lys Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Ala Val Glu Ala Pro Asp Ala Thr Thr Pro Pro Ser Met Pro Pro Ser
260 265 270
Lys Leu Gln Gly Ala Leu Asp Gly Phe Cys Ala Glu Glu Gly Arg Arg
275 280 285
Ala Cys Gly Gln Gly Leu Asn Ala Tyr Cys Asn Ala Asp Met Phe Ala
290 295 300
Arg Phe Asp Val Gly Thr Ala Ser Gln Gln Asn Lys Glu Trp Arg Cys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Glu Ser Leu Asp Phe Gly Met Ser Gly Glu Gly Cys Val
325 330 335
Asp Asp Cys Gly Asn Phe Thr Ser Cys Leu Gly Ala Val Asn Gly Ala
340 345 350
Ser Thr Thr His Leu Thr Arg Asp Ala Gly Leu Arg Ser Ala Leu Ala
355 360 365
Ala Asn Lys Asp Glu Phe Cys Lys Thr Glu Ser Asp Ala Pro Glu Thr
370 375 380
Ser Glu Glu Glu Glu Glu Ala Val Glu Ala Pro Asp Ala Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Ser Met Pro Pro Ser Lys Leu Gln Gly Ala Leu Asp Gly Phe Cys
405 410 415
Ala Glu Glu Gly Arg Arg Ala Cys Gly Gln Gly Leu Asn Ala Tyr Cys
420 425 430
Asn Ala Asp Met Phe Ala Arg Phe Asp Val Gly Thr Ala Ser Gln Gln
435 440 445
Asn Lys Glu Trp Arg Cys Tyr Val Lys Glu Ser Leu Asp Phe Gly Lys
450 455 460
Ser Gly Glu Gly Cys Val Asp Asp Cys Gly Asn Val Thr Ser Cys Leu
465 470 475 480
Gly Ala Val Asn Gly Thr Ser Thr Thr His Leu Thr Arg Asp Ala Gln
485 490 495
Val Arg Glu Leu Ile Gln Lys Lys Lys Ser Val Gly Cys Thr Gln Gln
500 505 510
Gly Glu Thr Gly Ser Glu Ala Pro Ala Pro Gly Arg Glu Pro Glu Val
515 520 525
Pro Ala Gly Val Pro Gly Thr Glu Thr Ala Gly Lys Gly Leu Lys Val
530 535 540
Pro Pro Arg Val Pro Gly Thr Gly His Leu Gln His Val Leu Asp Ser
545 550 555 560
Gln Cys Met Val Glu Val Ala Lys Leu Cys Ile Ala Asp Glu Ser Lys
565 570 575
Cys Asp Tyr Ala Val Ala Arg Arg Val Gly Ser Arg Trp Asp Cys Tyr
580 585 590
Leu Tyr Gly Ala Leu Asp Asp Ser His Ser Thr Asp Ala Cys Thr Asp
595 600 605
Asp Cys Gly Asn Ala Ile Thr Cys Pro Gly Val Pro Lys Ala Gly Asp
610 615 620
Thr Ser Val Thr Glu Asn Ser Asp Leu Asn Ala Met Ala Gln Gln Phe
625 630 635 640
Ser Glu Ala Thr Cys Lys Met Ser Glu Lys Gln Glu Leu Arg Gly Ile
645 650 655
His Ala His Gln Gln
660