鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用 (Chicken coccidiosis multivalent recombinant protein vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 刘群 杨旭 陈庆忠 宋星桔 刘晶 安同伟 许建海 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用。所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗包含4种鸡球虫蛋白：柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41,柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22,巨型艾美耳球虫配子体蛋白56,和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E。将上述4种鸡球虫蛋白分别与大肠杆菌表达载体相连获重组表达载体,表达重组蛋白。将不同种重组蛋白按比例与佐剂混合,免疫母鸡后的后代雏鸡接种球虫后与未免疫母鸡后代雏鸡相比,能够有效提高接种球虫的雏鸡存活率和相对增重,卵囊排出量减少,显示了良好的母源免疫效果。(The invention discloses a chicken coccidiosis multivalent recombinant protein vaccine and a preparation method and application thereof. The chicken coccidia multivalent recombinant protein vaccine comprises 4 chicken coccidian proteins: eimeria tenella rod protein 41, Eimeria tenella gametophyte protein 22, Eimeria maxima gametophyte protein 56, and Eimeria acervulina merozoite protein Ea 3-1E. And (3) respectively connecting the 4 chicken coccidian proteins with an escherichia coli expression vector to obtain a recombinant expression vector, and expressing the recombinant proteins. Different kinds of recombinant proteins are mixed with adjuvants in proportion, and after the offspring chicks immunized with the hens are inoculated with coccidia, compared with the offspring chicks not immunized with the hens, the method can effectively improve the survival rate and the relative weight gain of the chicks inoculated with the coccidia, reduce the oocyst discharge rate, and show good maternal immunization effect.)
技术领域
本发明是关于生物兽药技术领域，特别是关于一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
鸡球虫病(Coccidiosis)是由7种艾美耳球虫感染引起的严重危害养鸡业的疾病之一，呈世界性分布。引起鸡球虫病的病原包括柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)、堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、布氏艾美球虫(Eimeria brunetti)、毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)、早熟艾美耳球虫(Eimeriapraecox)和和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis)。不同种球虫寄生于鸡的不同肠段上皮细胞，引起以肠炎、出血、增重下降甚至死亡等一系列危害，危害程度与球虫种类、感染量及鸡只日龄等密切相关。生产中，鸡球虫病常为混合感染，发病率高达50-70％，死亡率为20-30％，严重时高达80％。每年世界范围内约有400亿只鸡感染鸡球虫病，全球每年因鸡球虫病造成的经济损失约数十亿美元。目前，鸡球虫病的防控主要依靠抗球虫药物和活疫苗，但由于耐药性和药物残留等问题，抗球虫药物的使用受到了限制；活疫苗的保存、运输、应用以及管理等等问题也限制了其广泛应用。另外，已经在有些国家注册的球虫疫苗是巨型艾美耳球虫的配子体蛋白疫苗，通过提取的巨型艾美耳球虫的天然蛋白制成，主要成分为配子体阶段的EmGAM56、EmGAM82和EmGAM230蛋白，有较好的母源免疫保护效果。但是制作成本非常高，难以推广应用。因此，研制防控鸡球虫病的新产品和新方法具有重要意义。
鸡球虫重组蛋白疫苗的研制关键在于保护性抗原的筛选。在球虫的入侵、发育和繁殖过程中的多种分泌蛋白不仅在其生命活动中具有重要意义，而且可能是球虫的重要免疫原。因此，筛选出具有较好免疫原性的抗原，进行有效组合，组成重组蛋白疫苗。重组蛋白疫苗与强毒苗、弱毒苗以及天然蛋白疫苗相比，具有安全性高、纯度高、稳定性好、产量高等优点，具有较好的应用前景。
禽类的母源免疫(Maternal immunization)是指将抗原免疫母鸡后，母鸡产生特异性的抗体能通过卵黄抗体的形式传递给后代雏鸡，并在一定时间内为雏鸡提供保护。母源免疫在禽养殖业上已有应用母源免疫的优点在于免疫一只母鸡就可使上百只雏鸡获得很好的保护作用，且免疫程序简单方便和成本低。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗，该鸡球虫多价重组蛋白疫苗是通过筛选鸡球虫的优质抗原组合成重组蛋白疫苗，其能够诱导母鸡较好的免疫反应，并且母源抗体能够保护后代雏鸡对抗鸡球虫的感染，可通过免疫母鸡预防后代雏鸡的球虫病。
为实现上述目的，本发明提供了一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗，该鸡球虫多价重组蛋白疫苗包含4种鸡球虫重组蛋白：柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41(EtROP41)、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22(EtGAM22)、巨型艾美耳球虫配子体蛋白56(EmGAM56)、和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E，所述4种鸡球虫重组蛋白均为原核表达，依次具有如SEQ ID NO.1-4所示的氨基酸序列，并按照1:1:1:1的质量比例混合。
上述四种蛋白分别通过下列方式筛选得到的：通过New serach-Genes-Transcriptomics-RNA Seq Evidence在ToxoDB数据库中筛选出子孢子阶段高表达的蛋白，通过预测这些蛋白的分子量、信号肽、B细胞及T细胞抗原表位，以分子量在20-100kDa、有信号肽、各阶段表达量大、抗原表位多的分泌蛋白作为筛选依据，再通过雏鸡免疫保护试验验证筛选得到Et.ROP41蛋白和Ea3-1E蛋白。其中Ea3-1E是目前研究比较多的抗原基因，是E.acervulina子孢子和裂殖子阶段的表面抗原。Ea3-1E序列在E.tenella、E.necatrix和E.acervulina之间具有很高的同源性，可作为候选疫苗的交叉抗原。而Et.ROP41蛋白是新发现并鉴定的蛋白；Etgam22基因是E.tenella在配子体阶段特异性表达的一种多拷贝基因,其表达产物与卵囊壁形成相关。免疫保护结果显示rEtgam22一定程度上能提高增重,降低病变记分和减少卵囊产量；EmGAM56蛋白是国外商品化球虫疫苗的主要成分，该疫苗经过多个国家和地区的实验室和田间验证，具有很好的免疫效果，但因其生产过程复杂、成本较高等问题，尚未在我国推广使用。将上述4种鸡球虫重组蛋白一定比例与佐剂混合，免疫母鸡，母鸡的血清抗体和卵黄抗体及后代雏鸡攻虫保护实验均显示，该重组蛋白疫苗能够诱导母鸡较好的免疫反应，并且母源抗体能够保护后代雏鸡对抗鸡球虫的感染，可通过免疫母鸡预防后代雏鸡的球虫病。
在本发明的一实施方式中，所述4种鸡球虫重组蛋白依次具有如SEQ ID NO.5-8所示的核苷酸序列。
本发明还提供了用于扩增上述核苷酸序列的引物，具有以下序列：扩增EtROP41上游引物：:5’-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGAACCTCCCCGAGTCAACCT-3’(SEQ ID NO.9)，扩增EtROP41下游引物：5’-CACGATGCGGCCGCTCGAGATCCTGGAACTCCCTGGACACC-3’(SEQ IDNO.10)；扩增EtGAM22上游引物：5’-CAAGGCCATGGCTGATATCGGCACCTGAGTATCCTTCTCAGCTTG-3’(SEQ ID NO.11)，扩增EtGAM22下游引物：5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTGTTGATGTCGGTAGGCTGCTCTTCC-3’(SEQ ID NO.12)；扩增EmGAM56上游引物：5’-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCAGGTTCACCCTTACAGCGAG-3’(SEQ ID NO.13)，扩增EmGAM56下游引物：5’-CGTCTCCGCTCTTTGGCAACCTCGAGCGGCCGCATCGTG-3’(SEQ ID NO.14)；扩增Ea3-1E上游引物：5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3’(SEQ ID NO.15)，扩增Ea3-1E下游引物：5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3’(SEQ ID NO.16)。
本发明还提供了一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗的制备方法，包括以下步骤：基因扩增：分别以柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41(EtROP41)、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22(EtGAM22)、巨型艾美耳球虫配子体蛋白56(EmGAM56)，和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E的cDNA序列为模板，通过上述引物分别进行基因扩增；重组载体构建：将扩增出的EtROP41基因序列与pGEX-6p-1骨架构建重组载体，将扩增出的EtGAM22基因序列与pET-28a骨架构建重组载体，将扩增出的EmGAM56基因序列与pGEX-6p-1骨架构建重组载体，将扩增出的Ea3-1E基因序列与pET-28a骨架构建重组载体；重组蛋白表达：将上述4种重组载体分别转化表达菌，表达菌接种于1L的新鲜LB(含AMP 100μg/mL)培养液中，至菌液OD600nm值约为1后加入诱导剂IPTG(0.8mmol/L)，分别进行诱导表达、纯化；以及混合：将诱导表达完成的4种鸡球虫重组蛋白进行等质量混合，即得。
在本发明的一实施方式中，所述表达菌为E.coliTransetta(DE3)菌株；所述柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41(EtROP41)、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22(EtGAM22)、和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E的诱导表达条件均为37℃诱导12h(160r/min)，所述巨型艾美耳球虫配子体蛋白56(EmGAM56)的诱导表达条件为18℃诱导18h。
本发明还提供了一种能够与上述鸡球虫多价重组蛋白疫苗特异性结合的抗体或血清。
本发明还提供了上述鸡球虫多价重组蛋白疫苗在鸡球虫母源免疫以及制备治疗后代雏鸡抗球虫药物中的应用。
在本发明的一实施方式中，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与佐剂共同使用，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与佐剂为等质量混合。
在本发明的一实施方式中，所述鸡球虫母源免疫的免疫程序包括：一免：将所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与弗氏完全佐剂等质量混合后于24-26周龄的母鸡(产蛋前母鸡)胸部皮下注射；二免：在一免之后两周进行二免，将所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与弗氏不完全佐剂等质量混合后于所述进行过一免的母鸡胸部皮下注射；以及三免：在二免之后四周进行三免，将所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与弗氏不完全佐剂等质量混合后于所述进行过二免的母鸡胸部皮下注射，其中，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗中的4种鸡球虫重组蛋白的免疫用量均为100μg/羽。
在本发明的一实施方式中，待所述母鸡经过一免、二免以及三免之后，还分别需要检测母鸡血清中的抗体效价，所述检测条件为：将所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗包被，血清最佳稀释度为1:(350-450)，酶标抗体最佳稀释度为1:10000，优选的，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗被稀释成4μg/mL后进行包被。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明为鸡球虫多价重组蛋白疫苗，是由柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41(EtROP41)、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22(EtGAM22)、巨型艾美耳球虫配子体蛋白56(EmGAM56)和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E按照1:1:1:1比例组合而成。母源免疫结果显示，重组蛋白免疫种母鸡后，母鸡的特异性血清抗体和卵黄抗体均能维持12周左右。选择高水平抗体持续期的种蛋孵化雏鸡，分别对7日龄和14日龄的后代雏鸡进行攻虫保护试验。母鸡的血清抗体和卵黄抗体及后代雏鸡攻虫保护实验均显示，该重组蛋白疫苗能够诱导母鸡较好的免疫反应，并且母源抗体能够保护后代雏鸡对抗鸡球虫的感染，可通过免疫母鸡预防后代雏鸡的球虫病。
附图说明
图1A是根据本发明一实施方式的EtROP41基因扩增产物电泳鉴定图；
图1B是根据本发明一实施方式的EtGAM22基因扩增产物电泳鉴定图；
图1C是根据本发明一实施方式的Ea3-1E基因扩增产物电泳鉴定图；
图1D是根据本发明一实施方式的EmGAM56基因扩增产物电泳鉴定图；
图2A是根据本发明一实施方式的鸡球虫重组蛋白EtROP41表达及纯化的SDS-PAGE图；
图2B是根据本发明一实施方式的鸡球虫重组蛋白Ea3-1E表达及纯化的SDS-PAGE图；
图2C是根据本发明一实施方式的鸡球虫重组蛋白EmGAM56表达及纯化的SDS-PAGE图；
图2D是根据本发明一实施方式的鸡球虫重组蛋白EtGAM22表达及纯化的SDS-PAGE图；
图3是根据本发明一实施方式的种母鸡免疫后特异性血清抗体IgG水平变化。
主要附图标记说明：
M，蛋白Marker；*代表免疫时间节点。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
E.coliTransetta(DE3)菌株：购自北京全式金生物技术有限公司。
菌株E.coli DH5α：购自北京聚合美生物技术有限公司。
高保真酶，Taq酶：购自购自南京诺唯赞生物技术有限公司。
多片段连接试剂盒，反转录试剂盒：购自北京全式金生物技术有限公司。
镍亲和层析填料：购自美国novagen公司。
表达载体pET-28a(+)和pGEX-6p-1(+)：实验室保存。
弗氏佐剂(完全，不完全):Sigma-aldrich，USA。
24-26周龄海兰褐产蛋鸡：购自天津市金翊养殖场。
柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫：由中国农业大学大学国家动物寄生原虫实验室分离、鉴定并保存。
实施例1重组蛋白的表达与纯化
本发明中鸡柔嫩艾美耳球虫的抗原为EtROP在ToxoDB数据库中的登录号为ETH_00005405(https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00005405)，编码该蛋白的基因片段长度为1527bp；EtGAM22在ToxoDB数据库中的登录号为ETH_00035480(https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00035480)，编码该蛋白的基因片段长度为597bp；EmGAM56在ToxoDB数据库中的登录号为EMWEY_00026710(https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/EMWEY_00026710)，编码该蛋白的基因片段长度为1422bp；Ea3-1E在ToxoDB数据库中的登录号为EAH_00057690(https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/EAH_00057690)，编码该蛋白的基因片段长度为1737bp。
1.基因的克隆和重组质粒的构建
根据各基因序列设计引物，引物如下表所示：
表1各基因的引物序列
分别提取子孢子阶段(ROP41)和配子体阶段(GAM22)的柔嫩艾美耳球虫、配子体阶段(GAM56)的巨型艾美耳球虫以及裂殖子阶段(3-1E)的堆型艾美耳球虫的RNA，提取步骤如下：
向所提取的球虫中加入1mlTRIzol，充分摇匀，反复吹打至无可见团块，于-80℃冰箱放置10min左右；10min后取出，待其融化，加入0.2ml预冷的氯仿，剧烈振荡15秒后于室温放置10min，4℃,12000rpm/15min；离心后吸取上层水相并转移至新的EP管，加入等体积的预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃静置10min，4℃,12000rpm/10min；离心后弃上清，加入1ml75％乙醇，12000rpm/5min，洗涤沉淀，重复两次，弃去上清，待乙醇挥发完全。待管壁稍干燥后根据肉眼观察RNA的量加入25-100μl无RNase的DEPC水,用枪头吸打几次使RNA溶解，即得到总RNA。同时用cDNA反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，反转录体系见表2。反转录得到的cDNA于-20℃保存备用。
表2 RNA反转录体系
*根据RNA浓度决定加入RNA量和水量。
以相应阶段球虫的cDNA为模板，对基因进行扩增，反应体系如下：
表3 PCR扩增体系
PCR反应条件：94℃预变性10min，进行30轮循环，循环包括94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸90s，终延伸72℃10min。PCR产物取样进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收与目的片段大小相符的PCR产物。
利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiS One StepCloning Kit)连接片段和骨架，具体反应体系如下：
表4多片段连接体系
2.重组蛋白的表达
将连接所得重组质粒转入表达感受态Transetta(DE3)中，冰浴30min；42℃热激1min，冰浴3-5min；加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃摇菌1h；取100-200μl菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日挑取单个菌落，加入含有卡那霉素的LB液体培养基37℃培养至对数生长期(OD600nm值约为1)，加入IPTG，使其终浓度为0.8mM。继续培养12h后，将菌液8000rpm 4℃离心20min，收集菌体沉淀，超声破碎菌体；将破碎后的菌体裂解液在4℃条件下离心10min(12,000rpm)，分离沉淀与上清；沉淀加入适量的8M尿素溶解。上清和沉淀各取40μL，分别加10μL 5×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸10min，离心10min(12,000rpm)，进行SDS-PAGE电泳，分析是否为可溶性表达。结果发现，EtROP和Ea3-1E蛋白的表达量大，为可溶性表达，表达于上清中，诱导表达条件要求低，加入IPTG的OD600nm在0.6-1.5之间或IPTG浓度在0.2-1.6mM之间均能大量表达，诱导温度为37℃，诱导时间为5h到24h能够获得大量表达蛋白。EmGAM56蛋白为可溶性表达，表达于上清，加入IPTG的OD600nm在0.8-1.0之间或IPTG浓度在0.2-1.6mM之间均能大量表达，诱导温度为18℃，诱导时间为15-18h。EtROP41-GST、Ea3-1E-His和EmGAM56-GST均表达于上清中，用镍亲和层析填料对上清中的蛋白进行纯化，结果见图2A、图2B、图2C。EtGAM22-His(表达条件同上)主要表达于包涵体中，对包涵体进行复性，结果见图2D。4种蛋白表达条件要求低、表达量大等特点使其易于大量生产。
实施例2母源免疫监测
1.免疫程序
购入24-26周龄海南褐种母鸡，随机分为3组，每组15只。在母鸡开产前四周的种母鸡进行首免，第1组用纯化后的重组蛋白各100ug(/羽)与弗氏完全佐剂1:1的等体积混合，胸部皮下注射；两周后进行二免，重组蛋白各100ug(/羽)与弗氏不完全佐剂1:1的等体积混合，胸部皮下注射；二免后四周进行三免，重组蛋白各100ug(/羽)与弗氏不完全佐剂1:1的等体积混合，胸部皮下注射。第2组为佐剂免疫对照组，第3组为PBS对照组，处理方式均与第1组相同。见表5。
表5种母鸡免疫分组
2.种母鸡免疫后血清抗体的间接ELISA检测
分别采集各组鸡一免后第一周和第二周、二免后第一至四周和三免后第一周及第二周的血清，检测其抗体效价，淘汰OD值低于0.6的母鸡。待各组的血清抗体水平稳定后，每两周检测一次，分别对蛋白免疫组母鸡随机选取5只进行ELISA检测。具体方法如下：
1)包被：将四种重组蛋白用碳酸盐缓冲液均稀释至4μg/mL，按照1:1:1:1的比例混合后，向96孔酶标反应板中加入100μL/孔，于4℃包被14h。
2)洗涤：弃去板中的液体，用0.5％PBST洗涤4次。
3)封闭：用5％脱脂奶进行封闭，100μL/孔，置于37℃温箱中1h；洗涤方法同上。
4)一抗孵育：将血清1:400稀释后加入到酶标反应板中，100μL/孔，37℃孵育1h，并设置阴阳性对照；洗涤方法同上。
5)二抗孵育：将HRP标记羊抗鸡IgG 1:10000稀释，加入到酶标反应板中，100μL/孔，37℃孵育1h；洗涤。
6)显色：在避光条件下将底物显色液A液和B液等比例混合，加入到酶标反应板中，100μL/孔，于室温反应7min。
7)终止：加入2MH2SO4终止反应，50μL/孔。
8)读取OD值：用酶标仪在波长450和630下读取吸光值。
结果显示，重组蛋白免疫组母鸡血清特异性抗体(图3)初免后一周的OD值为0.5左右，二免后一周OD≥1.0(与对照组相比差异极显著)。三免后12周血清特异性抗体持续保持OD值在1.5左右。
3.蛋鸡的授精以及雏鸡的孵化
3.1蛋鸡的授精
选择育成期健康、发育良好的公鸡进行精液的采集。人工授精时，左手握住母鸡双腿，稍稍提起，将母鸡胸部靠在笼门口处，右手腹部施以压力使输卵管开口外露，输精器吸取200ul新鲜精液后插入阴道始端1～2cm处，输入精液。一周一次。
3.2雏鸡的孵化
选择蛋壳清洁，大小正常的鸡蛋。放入1：1000的新洁尔灭水溶液，水温43-50℃，浸泡3分钟，晾干后备孵。将鸡蛋放入孵化器中，调节温度38°-39°，湿度60％-70％，孵化期为21天。
实施例3母源免疫对七日龄后代雏鸡保护效果的评价
1.鸡艾美耳球虫孢子化卵囊的制备
3组各5只14日龄无球虫鸡，分别经口感染1×104个孢子化E.tenella孢子化卵囊、2×105个E.maxima孢子化卵囊和1.5×105个E.acervulina孢子化卵囊，每组鸡只在不同隔离器中饲养。分别于144h、121h和97h后开始收集各组粪便连续收集3天，采用饱和盐水漂浮法收集卵囊(方法略)。收集的卵囊置于27℃摇床进行孢子化培养，期间取适量卵囊原液镜检其孢子化程度，当95％的卵囊完全孢子化后，置于4℃保存备用。
2.7日龄后代雏鸡保护效果的评价
2.1实验设计
选择三免后抗体水平较高母鸡的鸡蛋进行孵化，后续用于攻虫对照组和空白对照组均由未免疫母鸡产蛋孵化。实验共分为4组，每组10只7日龄雏鸡，淘汰体重过低或过高的雏鸡。第1组母源免疫组(10羽)，第2组佐剂免疫组(10羽)、第3组攻虫对照组(阳性对照组)(10羽)，第4组空白对照组(阴性性对照组)。7日龄时，称重，经口感染5000个/羽柔嫩、1.5×105个/羽巨型和1.5×105个/羽堆型艾美耳球虫孢子化混合卵囊。每日观察并记录鸡只精神状态、临床表现和死亡情况。14日龄时，称重，每组剖杀7只鸡进行肠道病变计分，5天后收集每组剩下鸡的粪便，进行卵囊计数。
2.2母源免疫种母鸡的后代雏鸡对球虫感染的保护效果评价
1)死亡率：记录攻虫后各组鸡只的死亡情况。攻虫后显示，免疫重组蛋白母鸡蛋所孵化的雏鸡的率明显降低，说明母源免疫组后代雏鸡能有效地抵抗三种艾美耳球虫的混合感染。见表6。
表6 7日龄后代雏鸡攻虫后的存活率
与非免疫攻虫组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
2)增重：分别于攻虫和剖杀时逐只称重，记录攻虫前以及攻虫后7天内体重变化情况，计算每组鸡的平均增重和相对增重率。以平均增重表示重组蛋白对免疫后再攻虫鸡增重的影响。
平均增重＝宰杀时重/组-攻虫时重/组
增重率(％)＝(宰杀时重-攻虫时重)/组÷攻虫时重/组×100％
相对增重率(％)＝(实验组平均增重÷非免疫非攻虫组增重率)×100％
各组的平均增重和相对增重率见表7。结果显示，母源免疫组后代雏鸡与攻虫对照组之间差异极显著(P<0.01)，免疫组相对增重率达39％，而佐剂免疫组和攻虫对照组相对增重率分别为8.6％和2.1％，说明母源免疫能预防后代雏鸡感染球虫后体重下降。
表7 7日龄雏鸡攻虫前后的体重变化
与非免疫母鸡后代雏鸡攻虫组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01，差异极显著。
3)病变记分：攻虫后第7天，给鸡只称重、剖检，按Johnson方法分别判定盲肠、十二指肠和小肠病变值，标准如下：
盲肠病变记分：
0:未见病变。
+1:盲肠壁散在极少数的点状出血斑，肠壁不增厚，内容物正常。
+2:盲肠内容物混有少量血液，肠壁少肥厚，可见很多出血病灶。
+3:盲肠内大量血液或盲肠凝块(凝血或灰白色的栓芯)，盲肠壁肥厚，盲肠明显地变形或萎缩。
+4:盲肠显著萎缩，病变延伸至直肠。盲肠壁极度肥厚，盲肠内容物为凝血或栓芯。
如两侧盲肠病变不一致，以病变严重的一侧为准。
小肠病变记分：
0分无肉眼可见病变。
+1分小肠中段粘膜面可见较小的出血点，肠腔中有少量橘黄色粘液。
+2分小肠中段出现轻度胀气，浆膜面可见许多出血点，延伸至十二指肠，肠腔内可见大量的橘黄色粘液。
+3分肠管扩张，没有正常的肠内容物，肠内容物混有血凝块和橘黄色粘液，肠壁变薄，粘膜面粗糙。
+4分肠管肿胀，肠内容物粘稠，呈棕红色，并混有大量血凝块，呈淡洗肉水色，肠粘膜充血，出血脱落。
十二指肠病变记分：
0分无肉眼可见病变。
+1分十二指肠浆膜面和粘膜面均可见有散在横纹状白斑，横向排列，外观呈梯形。
+2分病变较为密集，但未融合，十二指肠粘膜上覆以横向排列的横纹状白斑，外观呈梯状，病变延伸至空肠，消化道内容物较稀薄，肠粘膜增厚。
+3分十二指肠粘膜面可见密集的灰白色病灶，病变延伸至卵黄囊蒂处，肠道苍白，肠腔内有多量水分，内容物呈水样液体。
+4分十二指肠粘膜面呈浅灰色，横纹状白斑完全融合，肠腔内充满奶油状渗出物，肠壁增厚。
病变值＝各组平均病变记分×10
病变记分下降(％)＝(感染对照组病变计分–各组病变计分)/感染对照组病变记分×100％
各组的病变记分见表8。由表看出，攻虫组与非攻虫组之间病变记分差异明显，说明攻虫成功。仅用佐剂免疫母鸡后代雏鸡和对照组攻虫后病变均较明显，盲肠平均病变记分分别为3.28和3.43；蛋白免疫母鸡后代雏鸡的病变记分为2.28，与佐剂免疫组和攻虫对照组相比差异显著(P<0.01)。母源免疫母鸡后代雏鸡攻虫后的十二指肠平均病变记分为1，佐剂免疫母鸡后代雏鸡攻虫组和攻虫对照组分别为2.42和2.85，与佐剂免疫组和攻虫对照组相比差异显著(P<0.01)；母源免疫母鸡后代雏鸡组小肠病变记分为0.43，佐剂免疫母鸡后代雏鸡攻虫组和攻虫对照组均为2.43，与佐剂免疫组和攻虫对照组相比差异显著(P<0.01)。结果显示，重组蛋白免疫母鸡后，能够较好地保护后代雏鸡抵抗鸡球虫感染，显著减轻了球虫对鸡肠道造成的损伤。
表8 7日龄雏鸡攻虫后的病变记分
与非免疫母鸡后代雏鸡攻虫组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
4)卵囊计数
按麦克马斯特法进行卵囊计数：收取攻虫后7-11天的鸡粪便，加入适量的2.5％的重铬酸钾，混匀粪便，称量粪便总重，用50毫升离心管在不同的三个位置各取三份粪便样品，再次混匀所取得的三份粪便样品，每份称取2g，放入100毫升烧杯，先加10mL饱和食盐水混匀，再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止2min，镜检计数。计数室容积0.15mL，0.15mL内含内容物0.005g，两个计数室则为0.01g，所以OPG＝卵囊数×100。
卵囊排出量＝OPG×粪便总重
卵囊减少率(％)＝(佐剂免疫攻虫组卵囊排出量-蛋白免疫组卵囊排出量)÷佐剂免疫攻虫组卵囊排出量×100
各组鸡只的卵囊排出量和卵囊减少率结果见表9-12，由表可看出母源免疫母鸡后代雏鸡组的卵囊减少率为84.8％(P<0.01)；其中柔嫩艾美耳球虫卵囊减少率为80.6％(P<0.01)，堆型艾美耳球虫卵囊减少率为79.3％(P<0.01)，巨型艾美耳球虫卵囊减少率为93.6％(P<0.01)。与佐剂免疫母鸡后代雏鸡组和非免疫母鸡后代雏鸡攻虫对照组相比，差异极显著(P<0.01)。结果表明，用该重组蛋白免疫母鸡的后代雏鸡能够有效抵抗球虫感染，显著减少卵囊排出量，能有效抑制球虫在鸡只之间的持续传播。
表9 7日龄雏鸡攻虫后卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
表10 7日龄雏鸡攻虫后柔嫩艾美耳球虫卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
表11 7日龄雏鸡攻虫后堆型艾美耳球虫卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
表12 7日龄雏鸡攻虫后巨型艾美耳球虫卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
实施例4母源免疫对14日龄后代雏鸡的保护效果评价
1.新鲜鸡艾美耳球虫新鲜卵囊的准备方法：同实施例3；
2.14日龄后代雏鸡保护效果评价
2.1实验设计
选择三免后母鸡的鸡蛋进行孵化，后续用于攻虫对照组和空白对照组均由未免疫母鸡产蛋孵化。实验共分为4组，每组10只14日龄雏鸡，随机分组，淘汰体重过低或过高的雏鸡。第1组母源免疫组(10羽)、第2组佐剂免疫组(10羽)、第3组攻虫对照组(阳性对照组)(10羽)、第4组空白对照组(阴性性对照组)。14日龄时，称重，经口感染1×104个/羽柔嫩、1.5×105个/羽巨型、1.5×105个/羽堆型艾美耳球虫孢子化混合卵囊。每日观察并记录鸡只精神状态、临床表现和死亡情况。21日龄时，称重，并每组剖杀7只鸡进行肠道病变计分，5天后收集每组剩下鸡的粪便，进行卵囊计数。
2.2母源免疫种母鸡的后代雏鸡对球虫感染的保护效果评价指标
1)死亡率：记录攻虫后各组鸡只的死亡情况。攻虫后显示，免疫重组蛋白母鸡蛋所孵化的雏鸡的死亡率明显降低，说明母源免疫组后代雏鸡能有效地抵抗三种艾美耳球虫的混合感染。见表13。
表13 14日龄后代雏鸡攻虫后死亡率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
2)增重计算方法:同实实施例3；
各组的平均增重和相对增重率见表14。结果显示，母源免疫组后代雏鸡与攻虫对照组之间差异极显著(P<0.01)，免疫组相对增重率达101.8％，而佐剂免疫组和攻虫对照组相对增重率分别为-76.9％和22.8％，说明母源免疫能预防后代雏鸡感染球虫后体重下降。
表14 14日龄雏鸡攻虫前后的体重变化
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
3)病变记分原则：同实实施例3。
各组的病变记分见表15。由表看出，攻虫组与非攻虫组之间病变记分差异明显，说明攻虫成功。其中佐剂免疫攻虫组和攻虫对照组病变最明显，盲肠平均病变记分均为4，母源免疫组病变记分为2.7，与佐剂免疫攻虫组相比差异显著(P<0.05)；母源免疫组十二指肠平均病变记分为0.7，佐剂免疫攻虫组和攻虫对照组分别为2和1.85，与佐剂免疫攻虫组相比差异显著(P<0.05)；母源免疫组小肠病变记分为0.5，佐剂免疫攻虫组和攻虫对照组均为2.0，与佐剂免疫攻虫组相比差异显著(P<0.05)。表明这重组蛋白对鸡球虫感染保护效果较好，减轻了球虫对鸡肠道造成的损伤。
表15 14日龄雏鸡病变记分
与非免疫母鸡后代雏鸡组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
4)卵囊计数方法步骤：同实施例3。
各组的卵囊排出量和卵囊减少率结果见表16-19，由表可看出母源免疫组总卵囊减少率达86.9％(P<0.01)、柔嫩艾美耳球虫卵囊减少率达84.9％(P<0.01)，堆型艾美耳球虫卵囊减少率达87.6％(P<0.01)，巨型艾美耳球虫卵囊减少率达90.4％(P<0.01)。与佐剂免疫组和攻虫对照组相比，差异极显著(P<0.01)，表明母源免疫有显著的抗球虫卵囊形成的效果，可在很大程度的保护感染鸡只，并且能有效抑制球虫在鸡只之间的持续传播。
表16 14日龄雏鸡攻虫后总卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
表17 14日龄雏鸡攻虫后柔嫩艾美耳球虫卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
表18 14日龄雏鸡攻虫后堆型艾美耳球虫卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
表19 14日龄雏鸡攻虫后巨型艾美耳球虫卵囊排出量和减少率
与非免疫母鸡后代雏鸡相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用
<130> P200289DD1F
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 508
<212> PRT
<213> Eimeria tenella
<400> 1
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Ser Glu Ser Ala Lys Ala Pro Ile Glu Lys Pro Lys Asn Lys Val Thr
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Asn Glu Ala Glu Gly Asp Asp Ser Asn Ala Phe Phe Leu Asn Ala Arg
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Pro Gly Arg Arg Gln Gln Arg Gln Val Gly Ser Arg Val Ala Leu Gly
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Leu Leu Arg Gln Leu Gln Glu Pro Pro Arg Val Asn Leu Ser Asn Ala
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Arg Gly Pro Leu Gly Arg Glu Leu Met Leu Val Leu Ala Glu His Leu
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Thr Lys Gly Arg Ser Ser Ser Val Ile Gly Ala Thr Ile Asn Leu Val
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Val Tyr Ser Gly Arg Leu Ser Asp Ile Phe Ala Ala Gly Thr Ala Ala
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Ser Leu Glu Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ser Arg Met Leu Leu Gln Val
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<213> Eimeria tenella
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gcatgttata tgcggcttgt gctttattaa tgcacacaag gctagctaga aagagcagct 540
cagtgtgtgt gtggtggtgt tcgcttgatg aatgctgcag tgtagagttc aaagtgttta 600
cggatctgtc tttattatta ttattgttaa ttacctcctc tttcttttat ctttccctcg 660
ttgtatgaat ggcgttgttt gacttcaccc tccctccttt atttcgtccc caccagattc 720
tgattcacaa gtatatcatc tgcatgtgtg cattcatctt gtactctcat catgcatgtg 780
tgcacacata ttttcatgta tgtctgggta ttgtgtagaa tatatataaa atgtatgagt 840
gtgtgtgtgt gtgtatatat tcgagcagag tacgatgtgt gtgtacacac gaattatgct 900
ctgctcaaat gaacaacgta tatctgcatc tgtatatgta tatatatacg cacgtaaatg 960
cataaatgta tgtatgtata tattagtttc tgaagggcgc tgtttagtgt tggtgttagt 1020
atatggtatg gatttgctct ttgttcattc ttctctctgc gtgggtgtga tgatgtgctc 1080
ttagattgca gatgggtgcc gcctgtttgg cgctgcaata gacaatgggg aggatgcgtg 1140
gagtcagttg gtgaagacag gatatcagat tgaagtgctt caagaggacg gctcttcaac 1200
tcaagaggac tgcgatgaag cggaaaccct gcggcaagca attgttgacg gccgtgcccc 1260
aaacggtgtt tatattggag gagttaaata taaactcgca gaagttgtaa gtttccttca 1320
tactctagaa gaatagcgct tgctcatcca tggtgtcgtg cagtgggatg caatcgccac 1380
gcggggtgta cagacacctc aaagttgaat ggtagtaata atagtcatgt tcttcatgat 1440
gatggaataa gtgaataatt agggtgtttt gtgacggcgt tttcgttttt tttgtcattt 1500
tcgtcgtttc tctttgttta tttcgggccg atgatgcaga aacgtgattt cacctataac 1560
gaccagaact acgacgtggc gattttgggg aagaacaagg gtggcggttt cctgattaag 1620
actccgaacg acaatgtggt gattgctctt tatgacgagg agaaggagca gaacaaagca 1680
gatgcgctga caacggcact tgccttcgct gagtacctgt accagggcgg cttctaa 1737
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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cacgatgcgg ccgctcgaga tcctggaact ccctggacac c 41
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<212> DNA
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caaggccatg gctgatatcg gcacctgagt atccttctca gcttg 45
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ttgtcgacgg agctcgaatt gttgatgtcg gtaggctgct cttcc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccaggggc ccctgggatc ccaggttcac ccttacagcg ag 42
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<212> DNA
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agcaaatggg tcgcggatcc atgggtgaag aggctgatac 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgagtgcgg ccgcaagctt gaagccgccc tggtacaggt 40