阅读说明：本技术 一种用于dpp-4活性检测的质谱探针及其制备方法和应用 (Mass spectrum probe for DPP-4 activity detection and preparation method and application thereof ) 是由 王毅 程翼宇 李振皓 张晓慧 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于DPP-4活性检测的质谱探针及其应用。该质谱探针包括氨基酸序列为Glu-Pro-Phe-Lys的多肽及修饰在所述多肽的谷氨酸的哌嗪类化合物。本发明提供的质谱探针由可被DPP-4特异性识别的多肽Glu-Pro-Phe-Lys与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成,不仅能被DPP-4特异性识别并酶切,同时具有极高的质谱响应,质谱检测准确度高,能够准确反应DPP-4的活性,适用于血清等复杂体系中酶活性的检测,也适用于从中药等复杂体系中筛选具有DPP-4抑制活性的化合物。(The invention discloses a mass spectrometry probe for DPP-4 activity detection and application thereof. The mass spectrometry probe comprises a polypeptide with an amino acid sequence of Glu-Pro-Phe-Lys and a piperazine compound for modifying glutamic acid of the polypeptide. The mass spectrum probe provided by the invention is formed by connecting the polypeptide Glu-Pro-Phe-Lys which can be specifically identified by DPP-4 and a micromolecule piperazine compound with high spectrum response, not only can be specifically identified and enzyme-digested by DPP-4, but also has extremely high mass spectrum response, has high mass spectrum detection accuracy, can accurately reflect the activity of DPP-4, is suitable for detecting the enzyme activity in complex systems such as serum and the like, and is also suitable for screening compounds with DPP-4 inhibitory activity from complex systems such as traditional Chinese medicines and the like.)

一种用于DPP-4活性检测的质谱探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种用于DPP-4活性检测的质谱探针及其制备方法和应用。

背景技术

肠促胰岛素(incretin)是一类在肠道生成的具有促胰岛素分泌作用的多肽类激素，它不仅能刺激胰岛素分泌，还有抑制餐后胰高血糖素分泌、延缓肠排空、抑制食欲、增强胰岛素敏感性等作用。肠促胰岛素包括了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)，二者对促进胰岛素释放及胰腺外调节胰岛素水平显示出诸多优点。然而GLP-1和GIP在体内很快被DPP-4水解，且水解产物影响其生理功能的发挥，使得二者无法在临床上得到很好的应用。

DPP-4是一种丝氨酸肽酶，可特异性识别肠促胰岛素N端第二位的脯氨酸(proline)或丙氨酸(alanine)，并切断N端2个氨基酸，使肠促胰岛素失活，从而影响肠促胰岛素的生理作用，进而影响糖尿病的发生发展。研究表明，DPP-4活性与糖尿病的发生发展有着密切关系，DPP-4抑制剂可降低DPP-4的催化活性，抑制肠促胰岛素水解，从而提升肠促胰岛素的浓度，取得改善血糖、保护β细胞功能的效果。

目前常用的DPP-4抑制剂筛选方法有以甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4甲基香豆素为底物的荧光底物法和以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺为底物的发色底物法。由于这些方法对反应时间、样品处理要求较高，需反复验证或通过其它方法相互验证，难以直接测定得到DPP-4活性。

针对上述问题，本发明人在申请号为CN201510507259.X的专利文献公开了一种用于DPP-4检测的多肽及包含该多肽的荧光探针。该荧光探针由特异性识别DPP-4的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，多肽的氨基酸序列为：谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(EPKF)，聚集诱导发光分子与多肽中的赖氨酸相连。由于多肽N端第二位含有脯氨酸，使得该荧光探针中的多肽能被DPP-4特异性识别，切断该多肽；由此可知，该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去N端二肽时，则会产生明显的荧光吸收，从而能对DPP-4活性进行特异性的实时检测。

在蛋白质分析中，为了提高检测的灵敏度和专属性，同时扩宽检测范围，常会对蛋白质样品进行预处理。肽段化学衍生就是蛋白质分析中常用的一种样品预处理方法，通过对肽段的氨基、巯基或羧基进行衍生化处理，引入易电离的小分子标签，从而达到提高检测灵敏度的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高质谱响应的质谱探针，作为酶底物，被DPP-4特异性识别，通过质谱测定酶切反应前后的探针或酶切产物的量来检测DPP-4的活性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于DPP-4活性检测的质谱探针，包括：氨基酸序列为Glu-Pro-Phe-Lys的多肽及修饰在所述多肽的谷氨酸上的哌嗪类化合物。

本发明的质谱探针由可被DPP-4特异性识别的多肽与高质谱响应的小分子连接而成。所述多肽的氨基酸序列为：谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(SEQ ID NO.1)，所述的高质谱响应的小分子为哌嗪类化合物，哌嗪类化合物的-NH与多肽链上的谷氨酸的羧基缩合。

DPP-4酶切位点为脯氨酸与苯丙氨酸之间的酰胺键，因此，本发明质谱探针的酶切产物为哌嗪类化合物-谷氨酸-脯氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸。由于哌嗪类化合物具有很强的质谱响应，因此通过测定反应前后该探针或酶切产物的量，即可检测DPP-4的活性。

作为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪、1-(4-吡啶基)哌嗪或1-(1-甲基-4-吡啶基)哌嗪。

更为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪，所述质谱探针的结构如下式(Ⅰ)所示：

本发明还提供了上述用于DPP-4活性检测的质谱探针的制备方法，包括以下步骤：采用固相法合成氨基酸序列为Glu-Pro-Phe-Lys的多肽，再将多肽与哌嗪类化合物进行固相合成多肽反应，纯化后即得所述的质谱探针。

所述多肽由以下方法制得：先用二氯甲烷溶涨树脂，再加入3倍摩尔过量的保护氨基酸原料，再加入5倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺进行反应，反应结束后加20％哌啶-二甲基甲酰胺溶液进行脱保护；重复上述步骤依次连接氨基酸Lys、Phe、Pro、Glu后制得。

第二方面，本发明提供了上述质谱探针在DPP-4活性检测中的应用。本发明还提供了上述质谱探针在制备检测血清中DPP-4活性的试剂中的应用。本发明还提供了所述质谱探针在DPP-4抑制剂筛选中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的质谱探针由可被DPP-4特异性识别的多肽Glu-Pro-Phe-Lys与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被DPP-4特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应DPP-4的活性，适用于血清等复杂体系中酶活性的检测，也适用于从中药等复杂体系中筛选具有DPP-4抑制活性的化合物。

附图说明

图1为DPP-4质谱探针用于酶活性检测的流程图。

图2为DPP-4质谱探针纯度分析的HPLC色谱图。

图3为DPP-4质谱探针结构确证的HPLC-QqQ-MS提取离子流色谱图，其中右上角附图为质谱结果图。

图4为DPP-4质谱探针的¹H核磁共振谱图。

图5为DPP-4质谱探针对DPP-4的检测灵敏度考察结果图。

图6为DPP-4质谱探针及其他蛋白对DPP-4的检测特异性考察结果图。

图7为抑制剂浓度与其对DPP-4抑制效应的量效关系图。

图8为血清中DPP-4酶活性的测定结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1：DPP-4质谱探针的合成

本实施例DPP-4质谱探针的合成方法，主要包括以下步骤：

一、树脂溶涨

称取0.6g取代度为0.4mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)(15ml/g)，振荡30min。

二、接第一个氨基酸

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH氨基酸，再加入5倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h，最后用DMF和DCM交替清洗6遍。

三、脱保护

加15ml 20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应5min，去掉溶剂，再加15ml 20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应15min。

四、检测

抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、***(KCN)、苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

五、洗

依次用DMF(10ml/g)清洗两次、甲醇(10ml/g)清洗两次、DMF(10ml/g)清洗两次。

六、缩合

保护氨基酸Fmoc-L-Phe-OH三倍摩尔过量，HBTU三倍摩尔过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA五倍摩尔过量，反应60min。再用DMF(10ml/g)清洗一次、甲醇(10ml/g)清洗两次、DMF(10ml/g)清洗两次。重复上述缩合操作，依次连接序列中的氨基酸Pro和Glu。

七、接Boc

接完Fmoc-L-Glu(Oall)-OH后，加入3倍摩尔当量的Boc酸酐和3倍摩尔当量的DIEA脱保护接Boc。

八、脱Oall

加入3倍摩尔当量的四三苯基膦钯和3倍摩尔当量DIEA，加DMF充氮气震荡12h脱Oall。

九、接1-(2-嘧啶基)哌嗪

以相同方法接1-(2-嘧啶基)哌嗪，接完后，甲醇洗4次，抽干10min。

十、切割

配制切割液(TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％)，从树脂上全保护切割多肽，即得粗品探针。

十一、HPLC纯化多肽

用HPLC纯化粗品探针，将纯化后的溶液冻干，密封包装，-20℃保存，即得DPP-4质谱探针。

实施例2：DPP-4质谱探针的化学表征

采用实施例1所述的方法合成DPP-4质谱探针，用HPLC对探针的纯度进行分析。分析条件为：安捷伦1260HPLC色谱系统，配备可变波长检测器(VWD)，检测波长214nm；色谱柱，Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；梯度洗脱：0-5min，1％B；5-40min，1-30％B；40-45min，30-100％B；40-45min，100％B；进样量10μL；柱温30℃。

将DPP-4质谱探针用纯水溶解后，10000rpm离心10分钟后取上清进样分析，得到的HPLC色谱图如图2所示。

由图2可见，实施例1合成的DPP-4质谱探针纯度很高，可以用于后续的实验和研究。

此外，我们进一步用HPLC-QqQ-MS对探针的结构进行了确证。分析条件为：安捷伦1200HPLC色谱系统，串联AB Api 4000三重四极杆质谱(HPLC-QqQ-MS)；ESI离子源；正离子模式；质荷比(m/z)，100-1000；源电压，4kV；源温度600℃；色谱柱，Zorbax SB C₁₈(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；洗脱梯度为0-1min，1％B；1-7min，1-70％B；7-7.5min，70-99％B；7.5-11min，99％B；11-11.5min，99-1％B；11.5-15min，1％B；进样量5μL；柱温30℃。

DPP-4质谱探针的HPLC-QqQ-MS色谱图如图3所示，其¹H核磁共振谱图如图4所示。从质谱图上可以看到准分子离子峰[M+H]⁺(m/z 666.7)以及双电荷离子[M+2H]²⁺(m/z333.8)。这些离子与探针的结构相吻合，也进一步确证了探针的结构。

实施例3：DPP-4质谱探针对DPP-4的检测灵敏度考察

取5μL质谱探针PP-DAPK(终浓度约16μM)，不同浓度DPP-4(终浓度分别为500、400、250、125、50、25、10、5、2.5、1.25、0.5、0.25、0.05μg/L)，以50mM Tris-HCl pH 7.5补齐至100μL，37℃孵育30min后加200μL甲醇终止反应，溶液涡旋、离心，取上清用于进样分析。分析条件为：安捷伦1200HPLC色谱系统，串联Api 4000三重四极杆质(HPLC-QqQ-MS)；ESI离子源；正离子模式；MRM模式；源电压，4500V；源温度500℃；色谱柱，Zorbax SB C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；洗脱梯度为0-1min，1％B；1-7min，1-70％B；7-7.5min，70-99％B；7.5-11min，99％B；11-11.5min，99-1％B；11.5-15min，1％B；进样量5μL；柱温30℃。检测结果见图5。

由图5可见，质谱探针PP-EPFK对DPP-4的检测限为0.05μg/L，线性范围5μg/L-400μg/L。

实施例4：DPP-4质谱探针对DPP-4的检测特异性考察

在5μL质谱探针PP-EPFK(终浓度约50μM)中，加入终浓度约为150ng/mL的DPP-4、牛血清白蛋白、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、α-胰凝乳蛋白酶、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、血管紧张素转换酶(ACE)、凝血酶和胰蛋白酶，以缓冲液50mM Tris-HCl pH 7.5补齐至100μL，37℃孵育30min后加200μL甲醇终止反应，溶液涡旋、离心，取上清，按照实施例3所述的分析方法进行分析，检测结果见图6。

由图6可见，除DPP-4组的峰面积较高外，其他对照组的峰面积均较低，表明该质谱探针仅能被DPP-4特异性识别，该质谱探针对DPP-4具有较强的检测特异性。

实施例5：DPP-4质谱探针在血清中DPP-4活性检测的应用

样品组1：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、5μLDPP-4蛋白(终浓度36μg/L)；

样品组2：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、10μL健康人血清2号(稀释10倍后)；

样品组3：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、10μL健康人血清7号(稀释10倍后)；

样品组4：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、10μL健康人血清13号(稀释10倍后)；

样品组5：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、10μL糖尿病患者血清30号(稀释10倍后)；

样品组6：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、10μL糖尿病患者血清35号(稀释10倍后)；

样品组7：加入10μL PP-EPFK(终浓度约32μM)、10μL糖尿病患者血清40号(稀释10倍后)；

以缓冲液50mM Tris-HCl pH 7.5补齐至100μL，37℃孵育30min后加200μL甲醇终止反应，溶液涡旋、离心，取上清，按照实施例3所述的分析方法进行分析，检测结果见图7。

由图7可见，DPP4探针可用于检测血清中DPP4酶活性。

实施例6：质谱探针在筛选DPP-4抑制剂中的应用

取5μL质谱探针PP-EPFK(终浓度约16μM)，加入5μL DPP-4(终浓度36μg/L)和一定体积不同浓度Sitagliptin母液(使得Sitagliptin终浓度为50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.10、0.05nM)，以缓冲液50mM Tris-HCl pH 7.5补齐至100μL，37℃孵育30min后加200μL甲醇终止反应，溶液涡旋、离心，取上清，按照实施例3所述的分析方法进行分析，检测结果见图8。

由图8可见，随着Sitagliptin浓度的提高，Sitagliptin对DPP-4的抑制效应也逐渐增加；表明质谱探针PP-EPFK能较好地反映抑制剂对DPP-4的抑制作用，可用于DPP-4抑制剂的筛选。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于DPP-4活性检测的质谱探针及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Pro Phe Lys

1