一种苦味抑制肽及其应用
阅读说明：本技术 一种苦味抑制肽及其应用 (Bitter taste inhibitory peptide and application thereof ) 是由 励建荣 李冬慧 赵文竹 于志鹏 于 2020-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明保护了一种苦味抑制肽Gln-Arg-Pro-Arg在制备具有掩盖苦味作用的苦味抑制剂中的应用。本发明所提供的具有苦味抑制作用的生物活性肽Gln-Arg-Pro-Arg可与人类苦味受体TAS2R14活性位点结合,对苦味有很好的抑制效果,且具有安全无毒副作用,水溶性良好等特点,解决了现有技术苦味抑制效果不明显等技术问题,可作为苦味抑制剂用于食品、保健品以及药品中,具有广泛的应用前景和十分重要的意义。(The invention protects the application of a bitter taste inhibitory peptide Gln-Arg-Pro-Arg in preparing a bitter taste inhibitor with the bitter taste masking effect. The bioactive peptide Gln-Arg-Pro-Arg with the bitter suppression effect can be combined with the active site of a human bitter receptor TAS2R14, has a good bitter suppression effect, has the characteristics of safety, no toxic or side effect, good water solubility and the like, solves the technical problems of unobvious bitter suppression effect and the like in the prior art, can be used as a bitter inhibitor for foods, health-care products and medicines, and has wide application prospect and very important significance.)
技术领域
本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一种苦味抑制肽及其应用。
背景技术
味觉是哺乳动物极为重要的感觉，苦味是五种基本味感之一，阈值极低，且比其他味感持续的时间长，许多自然的有机物包括咖啡因、尼古丁、番木鳖碱以及众多的化学合成药物都是苦味物质。比较淡的苦味会引发不愉快感，而强烈的苦味会引起恶心呕吐以及心理上的厌恶感，许多消费者会因为食品产品的自身苦味而拒绝购买。研究发现，食品、保健品和药品中许多功能性成分都具有苦味，例如，啤酒中含有的具有镇静和健胃作用的苦味组分啤酒花提取液；茶和葡萄酒中含有的儿茶素和鞣酸；咖啡中大量含有的咖啡因和绿原酸；柑橘类果实中含有的柚皮苷和橙皮苷；蛋白质类如酪蛋白和乳清以及作为其降解产物的肽类物质、氨基酸；各种维生素类如维生素B1；微量矿物质如钙、镁等；碱性药物中的奎宁、黄连素等。略微的苦味可有效提高嗜好性和食品风味，但是如果苦味过强，则会伴随着不愉快感乃至厌恶感。因此，研究消除或抑制苦味的方法也是目前饮食品、保健品及医药品研发中的重点内容。
苦味的感知是溶解于唾液中的苦味物质作用于味觉细胞微绒毛上的受体，经过细胞内信号转导使细胞膜去极化、神经递质释放，再由突触后传入神经纤维把兴奋信号传递给皮层下中枢，经过皮层下中枢的信号整合而实现的。苦味由苦味受体TAS2Rs介导，苦味受体属于G蛋白偶联受体超家族。TAS2R14(T2R14)是对各种苦味化合物调谐最广的苦味受体之一，它能识别多种多样的天然或合成的苦味化合物，包括许多药物。因此，T2R14可作为抑制苦味的有效靶点。
苦味抑制指降低或者消除苦味物质的苦味。目前，国内外已经报道了多种抑制苦味的方法，人们最常用的办法是添加抑制剂或阻滞剂对苦味进行掩盖或消除。例如，食盐对很多苦味物质(奎宁、咖啡因、尿素等)有抑制作用；多种黄酮类化合物如樱花素、6-甲氧基樱花素、棕矢车菊素能抑制苦味受体TAS2R10活性；某些羧酸化合物能显著抑制水杨苷对苦味受体TAS2R16的活化作用，但这些抑制剂的作用条件难以控制，可能会与食品、保健品或药品中的功能性成分相互影响。选择分离法主要用于苦味肽的除去，采用活性炭、葡聚糖、琼脂、玻璃纤维等的吸附作用脱除苦味，或利用一些有机溶剂，如乙醇、丙醇等提取苦味肽，该过程会影响食物风味与人体对于多肽的吸收。此外采用超滤技术处理也是脱苦的有效方法，通过使用几种不同分子量截留范围的超滤膜即可将苦味肽脱除，但应用范围较小，目前只应用于大豆脱苦。酶法是采用外切多肽酶切除苦味肽两端的疏水性氨基酸而达到脱苦的目的，但该方法成本较高，应用较少。
食源性活性肽具有良好的生物活性和功能性，安全性高，无毒副作用，且易于消化吸收，利用食源性生物活性肽与味感受器竞争原理抑制苦味的研究引来了大量学者的关注。食源性活性肽既可以提供人体营养需求，同时还可以解决食品、药品及保健品中不良苦味带来的影响。
本发明旨在提供发现一种苦味抑制肽及其在掩盖食品、药品及保健品中不良苦味的应用。
发明内容
本发明的目的在于，为了克服上述现有技术的不足，提供一种苦味抑制肽和抑制苦味的方法。
本发明的苦味抑制肽，其氨基酸序列为Gln-Arg-Pro-Arg，晶体为粉末状，抑制苦味受体T2R14活性的半抑制浓度(IC50)为270μM。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一方面，本发明提供了一种苦味抑制肽，所述苦味抑制肽来自于虾夷扇贝肌球蛋白。
另一方面，本发明提供了获得苦味抑制肽的方法，利用在线数据库进行多轮筛选，包括以下步骤：
(1)从NCBI数据库中搜寻虾夷扇贝相关的蛋白质序列进行分析，选定依据为虾夷扇贝肌球蛋白的序列信息的可用性。
(2)使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶通过ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)对肌球蛋白进行虚拟水解，选出所有多肽，在在线程序PeptideRanker(http：//bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/Pept ideranker.php)中选定评分高于0.5的部分多肽，使用在线工具Innovagen(http：//www.innovagen.com/proteomics-tools)预测水溶性，用Discovery Studio 2017进行ADMET性质预测，最终选出水溶性好，无毒且生物活性高的多肽，在DS2017中与苦味受体T2R14进行对接，选定对接能量值相对较低的肽序列，进行体外苦味抑制活性验证。
(3)分子对接用于预测T2R14与肽相互作用。在本实验中，T2R14的晶体结构是从BitterDB数据库获得的。使用DS 2017软件进行分子对接，并用于分析结合位点处的肽相互作用。最后的分析是手动完成的。在分析之前，执行了以下步骤：(i)使用CDOCKER对接程序；(ii)选择CHARMm力场；(iii)T2R14的活性中心是XYZ(1.19548，2.03435，11.9968，17.4)。CHARMm力场用来优化每个肽的构象。以对接结果显示的‘-CDOCKER-INTERACTION-ENERGY’得分为指标，筛选得到潜在的具有苦味抑制作用的活性四肽QRPR。
(4)活性肽QRPR的体外苦味抑制活性。配制不同浓度的活性肽QRPR溶液各30mL，再加入一定浓度的苦味物质溶液50mL，配制为待测溶液，以苦味物质溶液作为空白对照组，以肽LEGSLE作为阳性对照组。计算不同浓度活性肽的苦味抑制率，并得到活性肽对苦味受体抑制活性的IC50值。苦味物质可以是奎宁，也可由柑橘类、茶、可可及啤酒花等苦味成分所组成，或含有黄连、黄柏、苍术、龙胆等中药。
本发明具有如下有益效果：本发明提供一种苦味抑制肽，从虾夷扇贝肌球蛋白中筛选得到了能够有效抑制苦味的活性肽QRPR，并明确活性肽QRPR与苦味受体T2R14的作用位点；QRPR具有良好的苦味抑制作用，对苦味物质有良好抑制作用且安全无毒，水溶性良好，具有生物活性，与目前已公开的复合配比的苦味抑制剂相比，应用操作简单，不依赖繁杂技术，可以显著提升食品口感，改善风味，因此可作为苦味抑制剂用于食品、保健品以及药品中，具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
本发明附图1幅，其中：
图1 QRPR与苦味受体T2R14的3D空间相互作用示意图；
具体实施方式
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1.具有苦味抑制作用的生物活性肽的筛选
1.苦味抑制肽的筛选
本发明借助ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)这一在线酶解工具对虾夷扇贝肌球蛋白序列进行虚拟酶解，酶解后获得323个多肽。通过peptide property calculator和PeptideRanker在线程序对323个多肽进行生物活性、水溶性的筛选。使用DS2017软件的ADMET程序进行毒性预测，预测了三种毒性性质：致突变性、发育毒性和皮肤致敏性。得到水溶性良好、生物活性评分高于0.5且安全无毒的多肽10个，序列分别为SM、RR、ADM、GFPSR、GIR、KPM、QRPR、NPPK、DM、DPDF。
2.苦味抑制活性的预测及分析
从BitterDB数据库(http：//bitterdb.agri.huji.ac.il/dbbitter.php)中获得苦味受体T2R14的晶体结构，去除小分子配体，添加氢原子和CHARMm立场，并根据已有数据进行活性中心的定义，作为受体蛋白。将筛选出来的10条多肽导入Discovery Studio 2017中，构建三维结构，采用Minimization Ligand优化后作为小分子配体。将处理完成的受体蛋白和小分子配体通过DS 2017中的CDOCKER程序进行分子对接，来筛选能与T2R14紧密结合的多肽，并明确活性位点。以对接结果显示的‘-CDOCKER-INTERACTION-ENERGY’得分为指标，筛选得到具有良好苦味抑制作用的活性四肽QRPR。使用DS软件分析活性肽QRPR与苦味受体T2R14之间的相互作用方式，苦味抑制肽QRPR的‘-CDOCKER-INTERACTION-ENERGY’能量值为77.2643。QRPR与受体结合的3D空间相互作用如图1所示，由图1可知：QRPR与苦味受体T2R14的最佳对接姿势；QRPR与苦味受体T2R14的Typ159残基、Asn157残基、Gly158残基、Trp89残基、Phe175残基、Ser167残基产生相互作用，通过疏水相互作用与Typ159、Trp89及Phe75相结合，与Asn157、Gly158及Ser67通过传统氢键相结合。
实施例2.苦味抑制肽QRPR抑制苦味活性的验证
通过固相合成、发酵或酶解等手段制备肽QRPR，将肽的冻干粉末溶于去离子水中，配置成不同溶度溶液，加入1mM的奎宁溶液50mL配置为待测溶液，以已报道的苦味抑制肽LEGSLE作为阳性对照，将溶液分别装入电子舌专用烧杯中，置于自动进样分析装置中，检测膜电位变化。结果表明，0.15mg/mL的活性肽QRPR对奎宁苦味的抑制率为50％，且抑制效果强于阳性对照。
同时，苦味抑制肽QRPR还可作为苦味抑制剂用于由柑橘类、茶、可可及啤酒花等苦味成分所组成的食品中，或用于含有黄连、黄柏、苍术、龙胆等中药药物和保健品中，用于抑制苦味。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。