一种高品质琼脂糖的制备方法
阅读说明：本技术 一种高品质琼脂糖的制备方法 (Preparation method of high-quality agarose ) 是由 张全斌 鞠豪 耿丽华 岳洋 王晶 于 2019-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种联合絮凝法从琼脂中分离制备高品质琼脂糖的方法。该方法包括以下步骤：配制一定浓度的琼胶溶液、加热溶解；配制适宜浓度的聚合氯化铝和聚丙烯酰胺溶液；在40～100℃的水浴锅中保温一段时间；在搅拌的琼胶溶液中加入一定体积的聚合氯化铝溶液并搅拌一定时间；在上述反应的溶液中,加入一定体积的聚丙烯酰胺溶液并搅拌一定时间；过滤,去掉滤渣,收集滤液；滤液降温成为凝胶、凝胶冻结脱水、洗涤、晾干,粉碎得到琼脂糖。本发明使用的制备方法是通过聚合氯化铝无机阳离子絮凝剂和聚丙烯酰胺阳离子絮凝剂的联合使用去除琼脂糖溶液中的硫琼胶和色素,凝胶性好,能够达到分子生物学等领域对高品质琼脂糖的要求。(The invention discloses a method for separating and preparing high-quality agarose from agar by a combined flocculation method. The method comprises the following steps: preparing agar solution with a certain concentration, and heating for dissolving; preparing polyaluminium chloride and polyacrylamide solution with proper concentration; keeping the temperature in a water bath kettle at 40-100 ℃ for a period of time; adding a certain volume of polyaluminum chloride solution into the stirred agar solution and stirring for a certain time; adding a certain volume of polyacrylamide solution into the solution obtained by the reaction, and stirring for a certain time; filtering, removing filter residue, and collecting filtrate; cooling the filtrate to gel, freezing and dehydrating the gel, washing, airing and crushing to obtain the agarose. The preparation method provided by the invention removes the sulfur agar and the pigment in the agarose solution by the combined use of the polyaluminium chloride inorganic cationic flocculant and the polyacrylamide cationic flocculant, has good gelling property, and can meet the requirements of fields such as molecular biology and the like on high-quality agarose.)
技术领域
本发明涉及生化领域，具体涉及一种絮凝剂联合法从琼胶中提取制备高品质琼脂糖的生产工艺，即为一种高品质琼脂糖的制备方法。
背景技术
琼胶，又名琼脂、冻粉、洋菜、大菜、洋粉、凉粉、燕菜等，是一种从伊谷藻属、凝花菜属、石花菜属、江蓠属、鸡毛菜属、紫菜属等红藻中提取的广泛用于食品、医药、日常化工、生物工程等许多领域的物质。琼胶主要是由琼二糖骨架组成的中性糖(含有不同的甲基)经一系列含低电荷的硫酸基及丙酮酸等过渡到具有高电荷、呈酸性的取代基的琼脂糖衍生物的混合体，其主要由琼脂糖和硫琼胶组成。
琼脂糖又名琼胶糖，是一种具有高凝胶特性的天然多糖，广泛存在于琼脂中，是一种不含硫酸基的非离子型多糖，是由1，3连接的β-D-半乳糖和1，4连接的α-3，6-内醚半乳糖为二糖单位构成的线性高分子多糖；而硫琼胶是以琼脂糖为基本骨架，结合着硫酸基、羧酸、丙酮酸和糖醛酸等极性基团，并结合着钙、镁等无机离子。由于硫酸基和羧基的影响，含硫琼胶的琼脂糖凝胶作为电泳支撑物，存在着电内渗大、吸附碱性染料和蛋白质的能力较强、在酸性缓冲液中亦可引起一些蛋白非特性沉淀、透明度差等缺点。理想的琼脂糖是不含极性基团的中性多糖，但实际上很难获得完全不含极性基团的中性多糖。电内渗的大小是琼胶与琼脂糖的主要差别之一，也是衡量琼脂糖质量优劣的一项主要指标。在进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖中过多的硫琼胶使凝胶在直流电场下产生对流，影响样品的迁移和分离，直接表现为电内渗和蛋白质吸附。电内渗的大小主要与琼脂糖中含有的硫酸基和羧基有关，因而琼脂糖制备过程中，主要是去除其中含有硫酸基和羧基的多糖，降低其电内渗，同时在除去琼胶生产过程中掺入的少量藻类蛋白、不溶性沉淀、可溶性盐类和色素，从而提高琼脂糖纯度和产品的稳定性。
琼脂糖具有良好的物理、化学和热稳定性，是琼胶系列产品中质量最优的一种，在医学、科研方面具有广泛的用途。琼脂糖由于其低程度的化学复杂性，而对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是一种理想的惰性载体，可作为凝胶电泳的支持物和亲和层析载体；在生化、医学领域，琼脂糖是研究病毒噬菌体、细菌、临床检验、生化分析、蛋白质、核酸、抗原、抗体的重要试剂，并可用于多糖分离、提纯及药物制备；琼脂糖还可以用作固体培养基、与透明质酸等连接作为多肽载体、用作组织工程支架、制备微囊人工膜等。琼脂糖已成为科学研究过程中不可缺少的物质。
琼胶糖的纯化技术始于上世纪，1937年荒木在研究琼胶的组成与结构时，首次从琼胶中分离出琼脂糖。1961年瑞典科学家S.Hjerten首次利用琼胶纯化了琼脂糖，第一次发现琼脂糖优异的使用性能后，对琼脂糖的研究才越来越多，并开始用于工业生产，1971年，Duckworth和Yaphe建立了琼胶进一步分级得到琼脂糖的方法，Arnott在1974年提出了琼脂糖的凝胶机理，指出琼脂糖分子以左旋形式的双螺旋结构形式存在。M.Djabourov在1989年通过小角光散射SAXS给出了琼脂糖的凝胶过程模型。M.Watase也通过DSC、XRD、NMR等方法给出了一定浓度下琼脂糖凝胶的物理化学结构。国外对于琼脂糖的研究远早于国内，目前琼脂糖产业化生产的国家主要有西班牙、美国、瑞士和英国等，国内琼脂糖尚未形成规模化生产。国内报道的琼脂糖提取技术主要有二甲基亚砜(DMSO)法、十六烷氯化吡啶(CPC)法、碘化钠法、硫酸铵法、壳多糖法、雷万诺法、聚乙二醇法、DEAE-纤维素法、乙酰化法、EDTA钠盐法、螯合法、尿素法等，上述方法除目前常用的DEAE纤维素法外，其他方法都存在收率低，产品色泽差，或者凝胶强度低，生产成本高等问题。DEAE纤维素法虽然是比较成熟的工艺，但DEAE纤维素对不同来源的琼脂适用性差且价格昂贵，限制了其应用范围及琼脂糖的规模化生产。因此寻找新的琼脂糖生产技术具有重要意义。
利用琼胶生产琼脂糖技术的关键是使琼脂糖与硫琼胶(Agaropectin)分离，絮凝剂主要是带有正(负)电性的基团和水中带有负(正)电性的难于分离的一些粒子或者颗粒相互靠近，降低其电势，使其处于不稳定状态，并利用其聚合性质使得这些颗粒集中，并通过物理或者化学方法分离出来。硫琼胶由于链接硫酸基和羧基因而其带负电荷，我们通过絮凝剂与其结合，从而产生絮状沉淀，使其从琼胶溶液中分离，从而获得琼脂糖溶液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种絮凝剂联合絮凝法从琼胶中分离制备低硫酸根琼脂糖，该方法简单高效、经济、环保、易操作实施、制备后的琼脂糖的硫酸根含量小于0.13％，凝胶性较好，能够达到分子生物学等领域对琼脂糖纯度的要求。
一种絮凝剂联合法从琼胶中分离制备高品质琼脂糖的方法，所述高品质琼脂糖，其电内渗低于0.13，硫酸根含量低于0.13％，1.5％溶液白度＞83，凝胶强度＞900g/cm2，其制备方法包括如下步骤：
(1)、将琼胶加水溶胀，加热至90～100℃搅拌溶解，配制成质量百分比为0.5％～5％的琼胶溶液，在40～90℃恒温放置；
(2)、配制0.2％～0.6％的聚合氯化铝无机絮凝剂，在40～90℃恒温放置；
(3)、配制0.2％～1.2％的聚丙烯酰胺有机絮凝剂，在40～70℃恒温放置；
(4)、将步骤(1)所得的琼胶溶液在搅拌下，在加入步骤(2)制备的聚合氯化铝溶液，两种溶液的料液比为1:1～10:1，搅拌10～360min；
(5)、将步骤(4)所得溶液在搅拌下，然后加入步骤(3)制备的聚丙烯酰胺溶液，两种溶液的料液比为1:1～10:1，混合搅拌10～360min；
(6)、将步骤(5)所得溶液即刻过滤或离心，收集滤液或上清液；
(7)、滤液置于低于40℃的温度下静置形成凝胶；
(8)、将凝胶切成条状，在低温下冷冻，使凝胶中所含水分结成冰；冻结后的凝胶条解冻脱水,然后用水3-6次洗涤并晾干，将晾干的琼胶条干燥，粉碎后获得琼脂糖；或者将凝胶压榨脱水，干燥后得到琼脂糖。
所述步(1)所用的琼胶原料来源于石花菜、江蓠或紫菜等属的海洋红藻。步骤(2)所用的聚合氯化铝无机絮凝剂为聚合氯化铝水溶液,步骤(3)所用的聚丙烯酰胺有机絮凝剂为聚丙烯酰胺水溶液，聚丙烯酰胺为阳离子型聚丙烯酰胺。
该方法通过两种絮凝法联用去除琼胶中的硫琼胶及色素，从而制备低硫酸根含量和低电内渗的琼脂糖，同时实现琼脂糖脱色。
本发明的优点
本发明使用的制备方法是通过聚合氯化铝无机阳离子絮凝剂和聚丙烯酰胺阳离子絮凝剂的联合使用去除琼脂糖溶液中的硫琼胶和色素，简单高效、经济、易操作实施、所制备的琼脂糖的硫酸根含量小于0.13％，电内渗低于0.13，白度高于83，凝胶性好，能够达到分子生物学等领域对高品质琼脂糖的要求。
所述琼脂糖对琼胶的回收率在60％以上，且生产的产品在常温下性质稳定。
结合附图阅读本发明的
具体实施方式
后，本发明的优点将变得更加清楚，可以直观的看出该方法的效果。
附图说明
图1是本发明所用琼胶溶解后的状态图，
图2是本发明获得的琼脂糖溶液的状态图。
具体实施方式
本发明揭示了一种用絮凝剂联合法从琼脂中分离制备高品质琼脂糖的方法，包括如下步骤：
(1)、配制质量百分比为0.5％～5％的琼胶溶液，室温加水溶胀，加热至90～100℃搅拌溶解，并于40～90℃恒温放置；
(2)、配制0.2％～0.6％的聚合氯化铝水溶液，搅拌溶解并于40～90℃恒温放置；
(3)、配制0.2％～1.2％的聚丙烯酰胺水溶液，搅拌溶解并于40～90℃恒温放置；
(4)、将步骤(1)所得的琼胶溶液在搅拌下，然后加入步骤(2)制备的聚合氯化铝溶液，两种溶液的料液比为1:1～10:1，搅拌10～360min；
(5)、将步骤(4)所得溶液在搅拌下，然后加入步骤(3)制备的聚丙烯酰胺溶液，两种溶液的料液比为1:1～10:1，混合搅拌10～360min；
(6)、将步骤(5)所得溶液趁热过滤或离心，收集滤液(或上清液)；
(7)、滤液置于40℃下静置形成凝胶并将凝胶切成条状，低温冷冻，使凝胶中所含水分结成冰。冻结后的凝胶条解冻脱水,然后用水3-6次洗涤并晾干；
(8)、将晾干的琼胶条干燥，粉碎后获得琼脂糖。
实施例1：
(1)、取琼胶2g，加超纯水200ml，溶胀2h，放入沸水中搅拌至溶解，放入60℃的水浴锅里面保温30min以上；
(2)、在烧杯中加入50ml超纯水，开启磁力搅拌器。然后将0.2g聚合氯化铝加入，继续搅拌30min以上，溶解完成后放入60℃的水浴锅中保温30min；
(3)、在烧杯中加入50ml超纯水，开启磁力搅拌器。然后将0.4g聚丙烯酰胺加入，继续搅拌30min以上，溶解完成后放入60℃的水浴锅中保温30min；
(4)、在60℃的水浴锅中，在200ml的琼胶样品溶液中，加入50ml聚合氯化铝溶液，搅拌120min；
(5)、在60℃的水浴锅中，在经过聚合氯化铝絮凝过的溶液中，加入50ml聚丙烯酰胺溶液，搅拌120min有絮状物沉降，趁热过滤。
(6)、滤液遇冷凝固成无色透明凝胶，然后将其切成条状，将切条的凝胶在4℃温度下预冷6～7h，置速冻冰箱内-20℃下冷冻24h，使凝胶中所含水分结成冰，放在室外向阳处，在日光下解冻脱水，然后在25℃的烘箱中烘干获得条状琼胶糖。粉碎后获得琼脂糖1.23g，产率为61.5％，经测定其硫酸根含量为0.079％、电内渗0.10，凝胶强度1020g/cm2,白度为83.72。
实施例2：
(1)、取琼胶4g，加超纯水400ml，溶胀2h，放入沸水中搅拌至溶解，放入60℃的水浴锅里面保温30min以上；
(2)、在烧杯中加入100ml超纯水，开启磁力搅拌器。然后将0.4g聚合氯化铝加入搅拌，溶解完成后放入60℃的水浴锅中保温30min；
(3)、在烧杯中加入100ml超纯水，开启磁力搅拌器。然后将0.8g聚丙烯酰胺加入搅拌，溶解完成后放入60℃的水浴锅中保温30min；
(4)、在60℃的水浴锅中，在400ml的琼胶样品溶液中，加入100ml聚合氯化铝溶液，搅拌120min；
(5)、在60℃的水浴锅中，在经过聚合氯化铝絮凝过的溶液中，加入100ml聚丙烯酰胺溶液，搅拌120min，有絮状物沉降，趁热过滤。
(6)、在60℃的水浴锅中，在经过聚丙烯酰胺絮凝过的溶液中，再次加入100ml聚丙烯酰胺溶液，搅拌120min有絮状物沉降，趁热过滤。
(7)、滤液遇冷凝固成无色透明凝胶，然后将其切成条状，将切条的凝胶在4℃温度下预冷6～7h，置速冻冰箱内-20℃下冷冻24h，使凝胶中所含水分结成冰，放在室外向阳处，在日光下解冻脱水，然后在25℃的烘箱中烘干获得条状琼胶糖。粉碎后获得琼脂糖2.68g，产率为67％，经测定其硫酸根含量为0.09％、电内渗0.09，凝胶强度986g/cm2,白度为83.24。
实施例3：
(1)、取琼胶2g，加超纯水400ml，溶胀2h，放入沸水中搅拌至溶解，放入50℃的水浴锅里面保温30min以上；
(2)、在烧杯中加入100ml超纯水，开启磁力搅拌器。然后将0.4g聚合氯化铝加入搅拌溶解完，50℃的水浴锅中保温30min；
(3)、在烧杯中加入100ml超纯水，开启磁力搅拌器。然后将0.8g聚丙烯酰胺加入搅拌溶解，50℃的水浴锅中保温30min；
(4)、在50℃的水浴锅中，在400ml的琼胶样品溶液中，加入100ml聚合氯化铝溶液，搅拌120min；
(5)、在60℃的水浴锅中，在经过聚合氯化铝絮凝过的溶液中，加入100ml聚丙烯酰胺溶液，搅拌120min有絮状物沉降，趁热过滤。
(6)、滤液遇冷凝固成无色透明凝胶，然后将其切成条状，将切条的凝胶在4℃温度下预冷6～7h，置速冻冰箱内-20℃下冷冻24h，使凝胶中所含水分结成冰，放在室外向阳处，在日光下解冻脱水，然后在25℃的烘箱中烘干获得条状琼胶糖。粉碎后获得低硫酸根琼脂糖1.24g，产率为62％，经测定其硫酸根含量为0.092％、电内渗0.11，凝胶强度968g/cm2,白度为86.69。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，并非对本发明的技术范围作任何限制，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行细微修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。