阅读说明：本技术 庆大霉素在制备治疗胆汁淤积药物中的应用 (Application of gentamicin in preparation of medicine for treating cholestasis ) 是由 武新安 王欢 马彦荣 辛明彦 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,涉及庆大霉素在制备治疗胆汁淤积药物中的应用。口服庆大霉素能够显著降低血中胆酸盐浓度,减少肝脏和回肠组织中有毒胆酸盐的浓度以及抑制肝脏病变。(The invention belongs to the field of medicines, and relates to application of gentamicin in preparation of a medicament for treating cholestasis. Oral administration of gentamicin can significantly reduce the concentration of bile salts in blood, reduce the concentration of toxic bile salts in liver and ileum tissues, and inhibit liver lesions.)

庆大霉素在制备治疗胆汁淤积药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及庆大霉素在制备治疗胆汁淤积药物中的应用。

背景技术

胆汁淤积是由各种原因导致的胆汁分泌或***障碍，使胆汁不能正常流入肠道而反流入血液循环引起的肝脏疾病。胆汁淤积引起的临床表现为胆汁酸盐、碱性磷酸酶和谷氨酰转肽酶的含量升高、肝功能受损等。尽管已不断深入地在分子水平剖析其发病机制，但至今，胆汁淤积性肝病尚无特效的治疗方法，文献报道称降低胆酸盐水平是治疗的关键，可减轻肝脏损害，缓解临床症状(陈小青、迎春，肝内胆汁淤积性肝病的病因与治疗，实用肝脏病杂志，2018，21(2)，163-165)。

熊去氧胆酸(UDCA)是目前美国食品与药品管理局批准的唯一广泛用于治疗胆汁淤积的药物，早期治疗能减轻症状，改善肝酶异常以及降低原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的死亡率和肝移植率。虽然UDCA可以改善肝功能生化指标，但是不能改善症状；且长期使用UDCA治疗PBC患者并不能延长患者生存期(李斌等，熊去氧胆酸治疗原发性胆汁性肝硬化的系统评价，广西医学，2009，31(2)，157-159)。此外UDCA价格昂贵，治疗周期长，甚至需终身治疗。因此开发安全有效、便宜的新药物显得尤为迫切。

庆大霉素(或称正泰霉素，Gentamicin，商品名Garamycin)是从绛红小单孢菌身上提炼而得的一种抗生素，于1963年首次发现，主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。但关于庆大霉素在治疗胆汁淤积中的应用尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供庆大霉素在治疗胆汁淤积中的应用。口服庆大霉素后能够显著降低血中胆酸盐浓度，减少肝脏和回肠组织中有毒胆酸盐的浓度，且无肾、肠毒性。

一方面，本发明提供了庆大霉素在制备治疗胆汁淤积的药物中的应用。

在一些实施例中，本发明所述的应用，其特征在于，所述治疗胆汁淤积的药物能够降低胆酸盐的水平。

另一方面，本发明提供了庆大霉素在制备治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用。

在一些实施例中，本发明所述的应用，其特征在于所述的胆汁淤积性肝病为化学性或药物性或原发性胆汁淤积性肝病。

在一些实施例中，本发明所述的应用，其特征在于，所述的胆汁淤积性肝病是妊娠肝内胆汁淤积症。

本发明涉及使用庆大霉素治疗胆汁淤积及其相关疾病。口服庆大霉素后能够显著降低血中胆酸盐浓度，减少肝脏和回肠组织中有毒胆酸盐的浓度，改变胆酸盐的组成，增加亲水性胆酸盐的比例，保护肝细胞和胆管细胞免受毒性胆酸的毒害，阻止疏水性胆酸盐对线粒体膜的干扰，抑制肝细胞凋亡，改善肝功能。特别地，使用本发明所述庆大霉素对慢性内源性胆汁淤积模型的大鼠进行治疗实验，在用量为25mg/Kg至50mg/Kg下(对应人体中用量为4.17mg/Kg至8.33mg/Kg)可以显著降低血中的总胆酸盐水平，减少血、肝脏中次级胆酸盐含量。

附图说明

图1显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后对胆汁淤积型大鼠血清中各生化指标的影响；其中＊为与对照组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

图2显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后胆汁淤积大鼠血液中各胆酸盐的浓度图；其中＊为与对照组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

图3显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后胆汁淤积大鼠肝脏中各胆酸盐的浓度图。其中＊为与对照组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

图4显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后胆汁淤积大鼠肝脏组织病理切片图。A、B、C、D、E分别代表对照组、模型组、UDCA组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组。

图5显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后胆汁淤积大鼠肾脏组织病理切片图。A、B、C、D、E分别代表对照组、模型组、UDCA组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组。

图6显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后胆汁淤积大鼠回肠组织病理切片图。A、B、C、D、E分别代表对照组、模型组、UDCA组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组。

图7显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后正常大鼠回肠组织病理切片图。A、B、C分别代表对照组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组。

图8显示的是根据本发明实施例口服给予庆大霉素后正常大鼠肾脏组织病理切片图。A、B、C分别代表对照组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述本发明，而不是对本发明应用范围的限制。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1

1、材料与方法

(1)实验仪器

液质联用仪(安捷伦公司)，光学显微镜(德国GBS)，分析天平(北京赛多利斯)，电子天平(奥豪斯国际贸易(上海)有限公司)，组织细胞破碎仪(拜谱诺(北京)科贸有限公司)，高速离心机(西格玛奥德里奇公司)，全自动生化仪(瑞士罗氏)，漩涡混合仪(上海医科大学仪器厂)。

(2)实验试剂

炔雌醇(纯度98％)(北京百灵威科技有限公司)，实验中所用BAs标准品包括胆酸(Cholic acid，CA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)、去氧胆酸(Deoxycholicacid，DCA)、石胆酸(Lithocholic acid，LCA)、猪去氧胆酸(Hyodesoxycholic acid，HDCA)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)、鼠胆酸(β-muricholic acid，β-MCA)及其甘氨酸结合型(Glycine-，G-)、牛磺酸结合型(Taurine-，T-)均购于美国Sigma-Aldrich公司，去甲脱氧氯酸(Demethylation deoxycholic acid，NDCA)购于加拿大TRC公司，其他试剂均为国产分析纯。

2、实验方法

(1)造模大鼠实验

健康Wistar雄性大鼠35只，随机分为对照组、模型组、UDCA组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组，每组7只。连续皮下注射炔雌醇丙二醇溶液(2mg/Kg/d)7天造大鼠慢性内源性胆汁淤积模型，对照组大鼠给予空白溶剂。造模第三天分别灌胃给予生理盐水(对照组和模型组)、阳性药物UDCA(60mg/kg/d)、庆大霉素(25mg/kg/d)、庆大霉素(50mg/kg/d)，连续给药7天。

最后一天给药12h后处理大鼠。用***将大鼠麻醉固定后，腹主动脉取血，测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转移酶(GGT)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、胱抑素C(CYS-C)、胆固醇(CHOL)和总胆酸(TBA)的含量。取部分肝脏组织，检测血清和肝脏组织中各胆酸盐的变化情况。收集回肠末端保存于-80℃冰箱，待Westernblot实验使用。每组取3只大鼠部分肝脏、肾脏、回肠置于10％甲醛中固定24h，待病理切片HE染色使用。

(2)正常大鼠实验

健康Wistar雄性大鼠18只，随机分为对照组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组，每组6只。对照组大鼠灌胃给予生理盐水，25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组分别灌胃给予庆大霉素(25mg/kg/d)、庆大霉素(50mg/kg/d)，连续给药7天。

最后一天给药12h后处理大鼠。每组取部分肾脏、回肠置于10％甲醛中固定24h，待病理切片HE染色使用。

(3)检测庆大霉素对胆汁淤积型大鼠血清生化指标的影响

腹主动脉取血，离心后取上清，放入生化分析仪中进行检测。

(4)检测庆大霉素对胆汁淤积型大鼠血清、肝脏组织中各胆酸盐的影响

样品处理：

血液：离心14000rpm离心10min，取上清液备用。

肝脏样品：称取0.2g组织，置于离心管中，加入600μL甲醇匀浆，取上清液备用。

测试方法：

取各样品上清液50μL，分别加入100μL内标溶液(NDCA溶液，4000ng/mL)、50μL甲醇，涡旋40s使之充分均匀，14000rpm离心10min后取上清液加入进样瓶中。使用液质联用仪测定样品中胆酸盐的浓度。

(5)探究庆大霉素对胆汁淤积型大鼠肝脏组织、回肠组织、肾脏组织病理情况的影响以及对正常大鼠肾脏组织和回肠组织病理情况的影响。

每组随意挑选3个肝脏组织、3个回肠组织、3个肾脏组织浸泡在10％的甲醛溶液中固定24h，石蜡包埋，HE染色，制作成大鼠组织病理切片。将切片放置于光学显微镜下，观察大鼠各组织病理结构变化。

3、检测结果与统计数据

(1)庆大霉素对胆汁淤积型大鼠血清生化指标的影响

如图1所示，模型组大鼠与对照组相比，TBA、ALT、ALP、TBIL、DBIL和IBIL指标显著性升高(P<0.05)，表明胆汁淤积模型组造模成功。

25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组与模型组相比，TBA明显降低P<0.05，且回到正常水平。说明庆大霉素能够显著缓解胆酸盐在血液中的蓄积情况，保护肝脏免受毒性胆酸盐的破坏，且其降低胆酸盐能力呈浓度依赖性。UDCA组与模型组相比也有下降趋势，但无显著差异，说明庆大霉素比UDCA具有更好的降低TBA的效果。

25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组与模型组相比，明显改善了ALT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL指标P<0.05，且UDCA仅能改善ALP。说明该剂量下的庆大霉素能够保护***引起的肝损伤，增加肝细胞对血液中各胆红素的摄取功能，减少各胆红素对其他器官的损伤，且效果比UDCA好。

庆大霉素组与对照组相比，BUN、CREA、CYS-C均无升高的趋势，说明口服庆大霉素不会影响肾小球滤过功能，无肾毒性。

(2)口服庆大霉素对胆汁淤积大鼠血清和肝脏组织中各胆酸盐浓度的影响。

如图2、3所示，口服庆大霉素与模型组相比能够显著降低血液、肝脏组织中毒性胆酸盐水平(P<0.05)，其中具有肝细胞毒性的CDCA、DCA、LCA等胆酸盐明显降低，说明庆大霉素能够减少毒性胆酸盐的含量，改善肝功能。

(3)口服庆大霉素对胆汁淤积大鼠肝脏、肾脏、回肠组织病理的影响。

如图4所示，对照组大鼠的肝脏组织结构和细胞形态正常。模型组与对照组相比，大鼠肝组织中出现肝细胞水肿、汇管区炎症细胞浸润并且可见局部肝细胞坏死，表明大鼠胆汁淤积模型造模成功。25mg/Kg-庆大霉素组、50mg/Kg-庆大霉素组和UDCA组与模型组相比，大鼠肝脏病变略有减轻，细胞结构基本恢复正常，但可见轻微出血。可见庆大霉素对***诱导的肝脏损伤具有缓解作用，并且效果与阳性药物UDCA相同。

如图5所示，对照组大鼠的肾脏组织结构和细胞形态正常。模型组大鼠出现肾间质水肿，肾小管上皮细胞空泡变性。UDCA组、25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组的大鼠与对照组大鼠相比，仍有轻微肾小管上皮细胞空泡变性，但与模型组大鼠相比，症状有所缓解。

如图6所示，对照组大鼠的回肠组织结构和细胞形态正常。模型组大鼠的回肠绒毛较对照组大鼠的矮，隐窝深度变浅，肌层空泡变大，有轻微出血。UDCA组大鼠的回肠绒毛与对照组大鼠的相比较短粗、稀疏，隐窝深度变浅，部分绒毛水肿。25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组的大鼠回肠绒毛密集，排列整齐，与模型组大鼠的相比有明显好转，但绒毛有水肿情况。

(4)口服庆大霉素对正常大鼠肾脏、回肠组织病理的影响。

如图7、8所示，与对照组大鼠相比，25mg/Kg-庆大霉素组和50mg/Kg-庆大霉素组的大鼠的回肠和肾脏组织并未发生明显的病理学变化。

总的来说，根据本发明实施例的方案，口服给予庆大霉素，可以显著降低血中的总胆酸盐水平，减少血、肝脏中次级胆酸盐含量，改变胆酸盐的组成，增加亲水性胆酸盐的比例，保护肝细胞和胆管细胞免受毒性胆酸盐的毒害，改善肝功能。且在该剂量下不会引起肾脏、回肠损伤。